Luận án Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta - Thalassemia vùng đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử - Phạm Thị Ngọc Nga

CẢM TẠ . i

TÓM LƯỢC . ii

ABSTRACT. iii

LỜI CAM ĐOAN. iv

MỤC LỤC. v

DANH SÁCH BẢNG . ix

DANH SÁCH HÌNH. xii

TỪ VIẾT TẮT. xv

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU . 1

1.1. ặt ấn đề . 1

1.2. Mục tiêu đề tài. 2

1.3. Ý nghĩa của luận án . 2

1.4. Tính mới của luận án . 2

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU. 4

2.1. Bệnh Beta thalassemia. 4

2.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia . 4

2.1.2. Di truyền bệnh Beta thalassemia . 5

2.1.3. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen betaglobin. 5

2.1.4. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia . 7

2.1.5. Các thể bệnh Beta thalassemia. 11

2.1.6. Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia. 14

2.1.7. Điều trị Beta thalassemia . 16

2.1.8. Phòng bệnh Beta thalassemia. 17

2.2. Phương pháp lập à phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia. 18

2.2.1. Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ. 18

2.2.2. Phương pháp lập phả hệ . 19

2.2.3. Phân tích phả hệ. 19vi

2.2.4. Các ký hiệu dùng để lập gia hệ . 20

2.3. Tư ấn di truyền à các phương pháp chẩn đoán trước sinh phòng bệnh

Beta thalassemia. 21

2.3.1. Tư vấn di truyền cho bệnh nhân Beta thalassemia . 21

2.3.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Beta thalassemia . 22

2.4. Tổng quan các nghiên cứu ề đột biến gây bệnh Beta thalassemia tại Việt

Nam . 28

CHƯƠNG III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 32

3.1. ối tượng nghiên cứu . 32

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1: xác định tỷ lệ kiểu đột biến

gen. 32

3.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: xây dựng phả hệ. 32

3.1.3. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3: tư vấn di truyền cho người

mang gen bệnh. 32

3.2. Thời gian à địa điểm nghiên cứu. 33

3.3. Phương pháp nghiên cứu. 33

3.3.1. Thiết kế nghiên cứu. 33

3.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu . 33

3.3.3. Nội dung nghiên cứu . 35

3.3.4. Phương pháp thu thập số liệu. 40

3.3.5. Phương pháp hạn chế sai số . 52

3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu. 52

3.4. Hạn chế của đề tài . 53

3.5. ạo đức trong nghiên cứu . 53

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ . 55

4.1. ặc điểm của đối tượng nghiên cứu . 55

4.1.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến . 55

4.1.2. Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ . 56

4.1.3. Đặc điểm của đối tượng tư vấn . 57

4.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen beta-globin gây bệnh Beta thalassemia . 58

4.2.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen β-globin. 58vii

4.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta

thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long . 61

4.3. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia . 70

4.3.1. Xây dựng phả hệ di truyền . 70

4.3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu. 81

4.3.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ . 84

4.3.4. Tỷ lệ các thể bệnh trong phả hệ nghiên cứu . 84

4.3.5. Kiểu hình huyết học của các thể bệnh Beta thalassemia trong các

phả hệ . 85

4.4. Tư ấn di truyền cho những người mang gen bệnh Beta thalassemia trong

các phả hệ nghiên cứu . 87

4.4.1. Kiến thức đúng về bệnh Beta thalassemia . 87

4.4.2. Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia. 88

4.4.3. Kiến thức đúng về phòng bệnh Beta thalassemia . 89

4.4.4. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta

thalassemia . 89

CHƯƠNG V. THẢO LUẬN . 91

5.1. ặc điểm của đối tượng nghiên cứu . 91

5.1.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến. 91

5.1.2. Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ . 92

5.1.3. Đặc điểm của đối tượng tư vấn. 92

5.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh Beta thalassemia . 93

5.2.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử dùng để xác định đột biến gen beta

globin. 93

5.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta

thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. 97

5.3. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia . 110

5.3.1. Xây dựng phả hệ di truyền. 110

5.3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu . 115

5.3.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ nghiên cứu . 117

5.3.4. Các thể bệnh Beta thalassemia và kiểu hình huyết học . 117viii

5.3.5. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sàng lọc các thể bệnh trong gia

đình bệnh nhân và cộng đồng . 123

5.4. Tư ấn di truyền cho người mang gen đột biến trong các phả hệ. 126

5.4.1. Kiến thức về bệnh Beta thalassemia. 126

5.4.2. Kiến thức về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia. 129

5.4.3. Kiến thức về phòng bệnh Beta thalassemia . 130

5.4.5. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta

thalassemia . 131

CHƯƠNG VI. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. 135

6.1. Kết luận . 135

6.1.1. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và thể bệnh Beta thalassemia

ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long . 135

6.1.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia. 135

6.1.3. Tư vấn di truyền cho người mang gen trong 12 phả hệ . 136

6.2. ề xuất . 136

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 137

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: tờ thông tin dành cho bệnh nhân và gia đình nghiên cứu.

Phụ lục 2: phiếu đồng thuận nghiên cứu về bệnh Beta thalassemia

Phụ lục 3: phiếu thông tin

Phụ lục 4: bộ câu hỏi đánh giá kiến thức tư vấn di truyền

Phụ lục 5: kết quả MLPA trên gen α/β-globin của bệnh nhân Nguyễn

Thị Thu H và Nguyễn Thị Mộng N

Phụ lục 6: danh sách bệnh nhân tham gia xác định kiểu đột biến

Phụ lục 7: danh sách các đối tượng tham gia trong 12 phả hệ

pdf200 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 415 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta - Thalassemia vùng đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử - Phạm Thị Ngọc Nga, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
c gen Delta đến 0,5kb sau của exon 3 thuộc gen β-globin tạo thể bệnh δβ- Thal. Và một ĐB mất một đoạn từ vị trí promoter đến hết exon 1 của gen β- globin tạo thành dạng bệnh β-Thal rất hiếm gặp. Tuy hiệu quả chẩn đoán mắc bệnh cao, nhưng MLPA chỉ phát hiện được ĐB mất hoặc nhân đoạn lớn, nên với các ĐB điểm và vi mất đoạn, MLPA sẽ không hiệu quả. Tóm lại, cả 3 k thuật: RDB, SEQ, MLPA đều có độ đặc hiệu cao trong phát hiện ĐB gây bệnh β-Thal dù chi phí khá đắt khoảng 2 triệu Việt Nam đồng/1 mẫu. Nghiên cứu chưa ghi nhận sự bỏ sót ĐB nào ở phạm vi xác định của từng k thuật trong tất cả các mẫu khảo sát. Sự phối hợp của cả 3 phương pháp đã giúp chẩn đoán 100% các kiểu ĐB trên 341 bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL và các kết quả này đều phù hợp với lâm sàng. Phát hiện ĐB và phát hiện khác về thể bệnh là điểm bắt đầu cho việc lập kế hoạch điều trị bệnh β-Thal bằng công nghệ gen: chỉnh sửa khuyết tật trong gen β-globin, thay thế gen β-globin hay đơn giản nhất là kích thích sự tổng hợp γ-globin giúp giảm tình trạng thiếu máu hiện tại (Schweiz Med Wochenschr, 1983 . Tuy nhiên, mỗi k thuật sẽ phát huy tốt ưu điểm và hạn chế được khuyết điểm trong từng tình huống bệnh cần chẩn đoán. Nghiên cứu Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 97 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH tổng hợp lại các ưu, khuyết điểm và tình huống nên chỉ định của từng xét nghiệm trong bảng 5.1. Bảng 5.1. Ưu khuyết điểm của k thuật RDB, SEQ, MLPA Kỹ thuật Ưu điểm Khuyết điểm Áp dụng RDB Nhanh, độ đặc hiệu cao, dễ thực hiện. Chỉ xác định ĐB có probe dò. Quần thể đã biết ĐB phổ biến, gia đình đã biết tiền sử kiểu gen ĐB di truyền. SEQ Phát hiện các ĐB điểm và vi mất đoạn trong vùng SEQ. Thực hiện tốn thời gian, bỏ sót các mất đoạn lớn hoặc ĐB ngoài vùng SEQ Quần thể chưa biết ĐB phổ biến, gia đình đã chưa biết tiền sử kiểu gen ĐB di truyền. MLPA Phát hiện được các ĐB mất đoạn lớn trên cả c m gen β. Không phát hiện được ĐB điểm và vi mất đoạn. Sử d ng cho các bệnh nhân chưa xác định được ĐB bằng các k thuật khác. 5.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh à các thể bệnh Beta thalassemia ở khu ực Đồng bằng sông Cửu Long 5.2.2.1. Tỷ lệ đột biến gen gây bệnh β-Thal ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long * Các kiểu đột biến phổ biến: Có 17 kiểu ĐB được xác định trên 609 alen của 341 bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL. Trong đó, 8 kiểu ĐB phổ biến của Việt Nam: Cd26G>A, Cd41/42 delTTCT, Cd17A>T, -28A>G, IVS1.1G>T, IVS2.654C>T, Cd71/72+A và Cd95+A chiếm đến 97,2% trên tổng số. Tỷ lệ mỗi kiểu ĐB không giống nhau, nhưng kết quả nghiên cứu cho thấy ĐB ở vùng ĐBSCL cũng tập trung các vào các kiểu phổ biến như ở các vùng miền khác và các nghiên cứu của các tác giả khác khi tìm ĐB ở khu vực phía nam. Ngoại trừ, đột biến Cd26 G>A gây HbE chiếm tỷ lệ cao, thì hai ĐB hay gặp nhất là βCd41/42 và βCd17. Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Trần Minh Hiếu, 2001 trên bệnh nhân β-Thal tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ đột biến βHbE (31%), βCd41/42 (25%) và βCd17 (17% . Nghiên cứu năm 2003 của Trương Đình Kiệt và ctv phát hiện được 8 loại ĐB trong đó đột biến βCd41/42 (23,18%) và βCd17 (20% vẫn chiếm tỷ lệ cao Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 98 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH nhất và còn nhiều nghiên cứu khác như Lê Thị Hảo, Filon et al, Svasti kết hợp với các cộng sự người Việt (Bảng 5.2 . Bảng 5.2. Tỷ lệ 8 kiểu đột biến của nghiên cứu so sánh với nghiên cứu khác Kiểu đột biến Tỷ lệ Filon (2000) n = 23 Lê Thị Hảo (2001) n = 44 Svasti (2002) n = 50 Trương Đình Kiệt (2003) n = 206 Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007) n = 26 Phạm Thanh Loan (2014) n = 28 Nghiên cứu này (2017) n = 341 βCd41/42 34,5 27 35,3 23,18 33,3 30,4 23,3 βCd17 48,3 20 25 20 12,1 21,4 21 βHbE - 29 - 40 21,2 17,8 33,8 β-28 0 4,5 7,3 4,5 0 5,4 4,6 βIVS1.1 0 1 6 1 9,1 8,9 3,6 βIVS2.654 0 6 7,3 4 12,1 1,8 4,2 βCd71/72 3,4 4,5 7,3 4 12,1 8,9 4,6 βCd95 13,8 6 10,3 2,5 0 1,8 2,1 Khác 0 2 1,5 0,92 0 3,6 2,8 Như vậy, kết quả nghiên cứu của đề tài một lần nữa khẳng định tại Việt Nam các ĐB tìm gặp trên bệnh nhân β-Thal phần lớn đều rơi vào 8 loại ĐB phổ biến tương tự như nhiều tác giả đã nghiên cứu trước đây (Bảng 5.2). - Đột biến gây HbE: Hemoglobin E là đột biến phổ biến nhất ở châu Á đặc biệt là Đông Nam Á. ĐB này được ước tính đã xuất hiện từ 5.000 năm trước (Ohashi et al, 2004). Một số nước như: Thái Lan, Myanmar, Campuchia, Lào, nơi tỷ lệ hiện nhiễm có thể lên đến 50-60% (Fucharoen, S., Winichagoon, P., 1992). Vùng Đông Bắc Thái Lan, ĐB từ 50-70%. Tại Sri Lanka có 40% đột biến gây β- Thal là βHbE và ĐB này cũng thường thấy ở Bangladesh và Indonesia ở người gốc Thổ Nhĩ Kỳ, Trung Quốc và Philipine. Trong nghiên cứu này có 203/609 alen (33,8%) mang đột biến HbE, như vậy HbE ở khu vực ĐBSCL thấp hơn các quốc gia trong khu vực. Nhưng HbE vẫn là ĐB chiếm tỷ lệ cao hơn so với các ĐB còn lại gây bệnh β-Thal. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 99 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH - Đột biến phổ biến khác HbE Theo Loukopoulos, D. và Kollia, P., 2001, ngoài sự lưu hành của HbE là ĐB phổ biến nhất ở Đông Nam Á. So với các nước trong khu vực như Thái Lan, Singapore và Nam Trung Quốc thì các đột biến: -28 A>G, Cd17 A>T, Cd41/42 -TTCT, IVS.1.1 G>A, IVS.2.654 C>T cũng là những ĐB hay gặp mà nghiên cứu ghi nhận bên cạnh các ĐB khác mang tính chất đặc trưng cho từng quốc gia (Bảng 5.3 . Trong các ĐB trên, bên cạnh ĐB gây HbE, -28 A>G và Cd41/42 -TTCT là ĐB đặc trưng ở khu vực châu Á, đặc biệt là Đông Nam Á so với các khu vực khác trên thế giới, do tần số xuất hiện 2 loại ĐB này khá cao (Kohne, E., 2011). Bảng 5.3. Phân bố các kiểu đột biến của nghiên cứu so với một số nước tại khu vực Đông Nam Á Kiểu ĐB Thái Lan Singapore Nam Trung Quốc Nghiên cứu này Trung Quốc Malaysia -28 A>G 56 8 3 48 28 + 1 A>G 1 10 4 Mã mở đầu 1 IVS.1.1 G>A, T 25 1 10 8 22 IVS.1.5 G>C, T 71 27 56 3 IVS.2.654 C>T 42 47 5 22 26 Cd17 A>T 152 14 7 71 128 Cd19 A>G 54 3 11 Cd35 C>A 30 Cd 41 –C 7 Cd41/42 -TTCT 305 83 12 136 142 Cd 71/72 +A 16 2 11 28 Mất đoạn 3,4 Kb 17 Đột biến khác 18 3 13 16 26 Chưa r 45 12 2 Tổng alen mang ĐB 839 199 133 314 403 Tỷ lệ đột biến Cd41/42 -TTCT xuất hiện với tần suất khá cao ở các nước trong khu vực châu Á: Trung quốc 41,84%, Indonesia 1,69%, Nhật 5,99%, Hàn Quốc 4,17%, Malaysia 26,32%, Pakistan 6,7%, Punjabi 13,22%, Singapore 37,59%, Đài Loan 30,63% và Thái Lan 37,24% và trong nghiên Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 100 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH cứu này là 23,3%. Không cao như Cd41/42 nhưng đột biến -28 A>G cũng xuất hiện với tỷ lệ khá phổ biến: Trung Quốc 12,31%, Malaysia 6,43%, Đài Loan 9,38%, Thái Lan 6,83%. Nghiên cứu này ghi nhận tỷ lệ kiểu đột biến -28 A>G chỉ có 4,6% thấp hơn các quốc gia trên nhưng lại cao hơn Nhật 0,32%. - Đột biến đặc trưng của Việt Nam Cd95+A Đột biến do sự chèn A vào trong codon 95 AAG của gen β-globin, làm thay đổi khung đọc với sự chấm dứt của bản dịch tại codon 101 là một stop codon thay vì stop ở codon 146. Đột biến này được công bố lần đầu tiên trong nghiên cứu của Cai, S. và Chehab, F.F., 1996 trên 2 gia đình người Việt sống tại M . Đột biến cũng được ghi nhận xuất hiện ở 1 ph nữ 26 tuổi ở Pháp và 1 gia đình tại Thái Lan với một tần số hiếm 0,12% (Winichagoon, P. et al, 1992). Ở nước ta, đột biến βCd95 được gặp với tần số cao hơn từ 1,8-13,8% tùy nghiên cứu (Bảng 5.2 . Do vậy, ĐB đã được ghi nhận là một ĐB khá đặc trưng của Việt Nam. Trong nghiên cứu này βCd95 có tần số là 2,1% và 100% các ĐB được tìm trên dân tộc Kinh, không ghi nhận ĐB có ở dân tộc Hoa, Chăm hay Khmer sống trong khu vực. Nên có thể nói ở khu vực ĐBSCL, βCd95 là ĐB đặc trưng của người Kinh. * Các đột biến không phổ biến Có 6 kiểu ĐB hiếm đã được công bố bởi vài nghiên cứu trong hoặc ngoài nước và 3 đột biến: βIVS2.499; βIVS2.636 và βCd38-39 là biến đổi mới chưa được ghi nhận trong dữ liệu ĐB gây bệnh β-Thal trên thế giới được phát hiện tại khu vực ĐBSCL bởi nghiên cứu (Bảng 4.8 . - Kiểu βIVS1.5 (IVS1.5 G>C): tạo kiểu hình β+, ĐB xảy ra ở vị trí c.92+5 G>C của vùng Intron 1, ngay vị trí bám của enzyme cắt đoạn intron ở đầu 5’. Chính ĐB đã làm giảm hiệu quả cắt intron 1 để gắn exon 1 và 2 trong quá trình tạo mRNA thuần th c, nên chỉ làm giảm số lượng mRNA, tạo ra kiểu hình thiếu máu nhẹ. Đột biến ghi nhận xuất hiện trong nghiên cứu này với tỷ lệ 0,5%. Trong nghiên cứu của Phạm Thanh Loan, 2014 ở bệnh nhân khu vực miền Bắc, ĐB xuất hiện với tần số cao hơn 3,6%. Nên ở khu vực phía Bắc nước ta, đột biến βIVS1.5 cũng được liệt vào ĐB phổ biến trong quá trình sàng lọc, chẩn đoán bệnh β-Thal. Ở Việt Nam, βIVS1.5 là ĐB tìm gặp với tần số thấp <10%, nhưng ở các quốc gia trong khu vực châu Á, ĐB này lại rất phổ biến: Bangladesh 60%, Vương quốc Oman của Ả rập 61,6%, Pakistan 37,3%, và Đông Nam Á: Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 101 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Indonesia 54,24%, Malaysia 26,9%, vùng Maharastra của Ấn Độ 6,55%, ( - βCd26 (Cd26 G>T): đột biến xảy ra ở vị trí codon 26. Tại vị trí này nucleotide loại G thường được thay thế thành A để tạo ra một ĐB phổ biến HbE, quy định kiểu hình β+ (thiếu máu nhẹ, hoặc không có biểu hiện lâm sàng . Tuy nhiên, nếu nucleotide loại G được thay bằng T thì GAG (Glu >TAG (Stop codon , sẽ tạo ra kiểu hình β0. Trong nghiên cứu này, kiểu đột biến βCd26 được ghi nhận với tỷ lệ rất thấp 0,3% trên một bệnh nhân thể phối hợp HbE/β-Thal dân tộc Kinh, ở Bến Tre và một người nữ cũng dân tộc Kinh ở Kiên Giang. Năm 2013, khi tìm ĐB cho 498 sản ph và chồng đến khám tại bệnh viện Từ Dũ, Nguyễn Khắc Hân Hoan cũng tìm được ĐB này với tỷ lệ 0,1%. Hiện tại, theo cơ sở dữ liệu ĐB gen β-globin của Ithanet, đột biến βCd26 lần đầu tiên được tìm gặp trong một gia đình sống ở Bắc Thái Lan, trong nghiên cứu của Goonnapa Fucharoen,1990. Tác giả này cũng ghi nhận đột biến Cd26 G>T xuất hiện trong cộng đồng Thái với tỷ lệ 0,12%. - βCd15 (Cd15 G>A hay c48.G>A): đột biến thay acid amin Trytophan thành stop codon ở vị trí c.48, gây ra kiểu hình β0 do tạo mRNA không thực hiện được chức năng. Có 0,8% đột biến βCd15 được ghi nhận trong nghiên cứu, ĐB xuất hiện trên các bệnh nhân dân tộc Kinh, không ghi nhận dân tộc khác và cũng chưa tìm thấy nghiên cứu khác trong nước có ĐB này. Trên thế giới, ĐB này chỉ tìm gặp ở Nhật 0,95%, Bồ Đào Nha 11,79% và Nga 6,45%. Trong khi ĐB khác cũng xảy ra codon 15 và cùng một biến đổi G>A nhưng xảy ra ở vị trí c.47 lại là một ĐB vô cùng phổ biến ở khu vực Đông nam Á. Kết quả của nghiên cứu cho thấy đột biến Cd15 G>A phát hiện được trong khu vực ĐBSCL là một ĐB hiếm, không thuộc ĐB phổ biến ở Đông Nam Á. Do vậy, việc sử d ng các k thuật dò tìm ĐB phổ biến ở Đông Nam Á sẽ bỏ sót ĐB này. - βCd11 (Cd11G>A), đột biến thay acid amin Valin thành Isoleucin hay còn gọi là Hb Hamilton. Đột biến được nghiên cứu ghi nhận với tỷ lệ rất thấp 0,2% trên một bệnh nhân người mang gen bệnh dân tộc Kinh, ở Tiền Giang. Đột biến chưa tìm thấy ở các nghiên cứu khác trong nước. Đây cũng là ĐB hiếm gặp trên thế giới và cả khu vực Đông Nam Á. Đột biến này được tìm thấy đầu tiên trong một gia đình Úc sống ở Canada và trong một gia đình Trung Quốc. Ở Sardinia, một vương quốc ở khu vực Địa Trung Hải Hb Hamilton xuất hiện với tần số là 1/400 (0,25% ( Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 102 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH - Tương tự βCd11 2 kiểu đột biến (-pro)del, ()del được tìm thấy trong nghiên cứu với tỷ lệ mỗi kiểu là 0,2% và cũng chưa tìm thấy trong kết quả nghiên cứu khác trong nước. Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2013 cũng tìm thấy được 2 kiểu mất đoạn ngoài gen β-globin: dell 1393bp và dell 9,6kb, đột biến này có vị trí và lượng nucleotide mất cũng khác biệt với nghiên cứu. * Các đột biến mới trong nghiên cứu Có 3 bệnh nhân mang 3 đột biến mới được phát hiện bằng k thuật giải trình tự. 100% các bệnh nhân là dân tộc Kinh. Trong đó, có 2 bệnh nhân ở thể dị hợp tử kép do sự phối hợp ĐB mới với ĐB đã biết khác: βCd17/βCd38/39, - pro) del /βIVS2.499 và một bệnh nhân thể dị hợp tử: βIVS2.636 (Bảng 4.8 . Theo nghiên cứu của TIF và nhiều tác giả trong, ngoài nước nếu bệnh nhân chỉ mang mỗi đột biến βCd17 hay đột biến -pro)del sẽ ở dạng thể nhẹ, không có triệu chứng thiếu máu. Với chỉ số Hb ghi nhận trong nghiên cứu thấp: bệnh nhân βCd17/βCd38/39 là 6,1g/dL; -pro)del/βIVS2.499 là 6,8g/dL (Bảng 4.10 . Kết hợp với lâm sàng cần truyền máu ph thuộc hàng tháng, ứ sắt nặng, gan, lách to, biến dạng xương,... Nghiên cứu kết luận: hai ĐB mới là βCd38/39 và βIVS2.499 cũng góp phần gây thiếu máu ở bệnh nhân với mức độ tương tự như các bệnh nhân β-Thal thể nặng do hai ĐB khác nhau trên gen β-globin gây ra. Tuy vậy, khi dựa trên chỉ số MCV, MCH và điện di Hb, nghiên cứu ghi nhận tình trạng thiếu máu hồng cầu nhỏ, nhược sắc do MCV=71,8fL, MCH=22,3pg và điện di bất thường với HbF tăng cao (HbA: 65,5%; HbA2: 2,7%; HbF: 32% ở bệnh nhân βCd17/βCd38/39. Các chỉ số ghi nhận tương tự như β-Thal thể trung gian theo phân loại của Kohne, 2011 (Bảng 2.5 . Tương tự, theo bảng phân loại này, dựa vào chỉ số Hb=10g/dL, MCV=69,2fL, MCH=21pg và kết quả điện di: HbA: 89,8%; HbA2: 6%; HbF: 4,2%. Kết hợp với lâm sàng thiếu máu nhẹ và không cần truyền máu. Nghiên cứu kết luận: bệnh nhân dị hợp tử với kiểu đột biến βIVS2.636 (c.316-179 A>C) hoàn toàn phù hợp với β-Thal thể nhẹ. Đột biến này tuy chưa được ghi nhận trong dữ liệu ĐB gây bệnh β-Thal, nhưng năm 2013, Eun Sil Park et al, 2013 cũng đã tìm thấy một bệnh nhân dị hợp tử mang kiểu ĐB này với MCV=74,3fL, MCH=24pg, khi thực hiện nghiên cứu trên 20 bệnh nhân β- Thal tại Hàn Quốc. Kiểu phối hợp đột biến -pro)del/βIVS2.499 được tìm thấy trên bệnh nhân Nguyễn Thị Mộng N, 13 tuổi với lâm sàng thiếu máu nặng. Theo y văn, sự thay đổi của chỉ số MCV, MCH là dấu hiệu quan trọng cho sàng lọc bệnh Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 103 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH thalassemia vì mức độ giảm của MCV liên quan trực tiếp đến mức độ giảm sản xuất chuỗi globin và MCH thể hiện tình trạng nhược sắt của hồng cầu. Tuy nhiên, kết quả công thức máu của bệnh nhân được phân tích trước khi truyền máu, 2 chỉ số MCV=85,8fL, MCH=29,5pg được ghi nhận là hoàn toàn bình thường. Kết quả nghiên cứu của đề tài và nhiều nghiên cứu khác một lần nữa cho thấy nếu chỉ dựa vào giá trị MCV và MCH vẫn có kết quả âm tính giả nhất định. Như theo nghiên cứu của Nguyễn Hồng Thị Nga là 6%. Và cũng theo tác giả này nếu sử d ng công thức Shine và Lal (MCV2 x MCH để sàng lọc bệnh tỷ lệ âm tính giả là 9%. Về các chỉ số điện di Hb, nghiên cứu ghi nhận bệnh nhân có kết quả điện di gần như bình thường: HbA: 95,2%; HbA2: 2,2%; HbF: 2,2%. Nghi ngờ có thể xuất hiện ĐB trên gen α-globin, nghiên cứu cũng đã gửi mẫu máu của đối tượng đến bệnh viện Từ Dũ để làm MLPA, kiểm tra các ĐB gây bệnh α-Thal. Kết quả, không tìm thấy ĐB nào trên 4 gen α-globin (Ph l c 5 . Vậy Nguyễn Thị Mộng N là bệnh nhân β-Thal truyền máu ph thuộc hồng cầu bình thường đầu tiên ở bệnh nhân khu vực ĐBSCL được nghiên cứu ghi nhận với chỉ số điện di HbA giảm rất nhẹ và HbF tăng rất ít. Khi kiểm tra kiểu ĐB của cha và mẹ bệnh nhân bằng k thuật giải trình tự tìm βIVS2.499; MLPA tìm ĐB trên gen α-globin và ĐB -pro)del. Kết quả: cả 2 ĐB của bệnh nhân đều được di truyền từ mẹ. Mẹ bệnh nhân có lâm sàng biểu hiện mức độ thiếu máu trung bình, truyền máu không thường xuyên khoảng 2-3 tháng 1 lần, có khi chỉ truyền máu 2 đợt/1 năm, mức độ ứ sắt 1.800ng/mL, lách to độ 3, có biểu hiện da xanh, niêm nhạt và biến dạng xương nhẹ. Chỉ số huyết học: Hb 8,3g/dL, MCV=83,5fL, MCH= 29,9pg. Chỉ số Hb: HbA: 96,4%; HbA2: 2,5%; HbF: 1,1% và mẹ bệnh nhân cũng không mang ĐB gây α-Thal nào khi thực hiện MLPA. Như vậy, nếu dựa vào chỉ số Hb của bệnh nhân (6,8g/dL và mẹ (8,3g/dL nằm trong khoảng 6-10g/dL trong nghiên cứu của Khone, E., 2011, thì kiểu phối hợp đột biến -pro)del/βIVS2.499 phù hợp với β-Thal thể trung gian. Tuy nhiên, kiểu gen của mẹ và bệnh nhân hoàn toàn giống nhau nhưng lâm sàng của con biểu hiện nặng hơn mẹ điều này có thể giải thích dựa vào cơ chế tạo kháng thể bất thường sau mỗi lần truyền máu ở bệnh nhân β-Thal. Mặc dù chẩn đoán β-Thal thể nặng thường là không khó, nhưng điều này thường gây khó khăn ở các nước đang phát triển khi đi kèm với một số bệnh nhiễm trùng (sẽ làm tăng mức độ tan huyết hoặc sau khi bệnh nhân dùng Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 104 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH thuốc kéo dài (Khone, E., 2011 . Theo gia đình, bệnh nhân Nguyễn Thị Mộng N được phát hiện mắc bệnh β-Thal khi đang nhập viện điều trị viêm hô hấp lúc 2 tuổi. Từ thời điểm đó, cứ cách 2-3 tháng bệnh nhân được chỉ định đến bệnh viện theo d i, truyền máu. Thời gian càng rút ngắn lại, cho đến hiện tại khoảng 1lần/1tháng. Ngoại trừ ABO và Rh, bệnh nhân không được xét nghiệm các kháng thể lạ kháng hồng cầu (xuất hiện sau mỗi lần truyền máu và các kháng nguyên nhóm máu khác trước khi truyền máu. Hồng cầu khối không qua quá trình lọc rửa, chưa có chương trình thải sắt tại nơi điều trị. Tất cả có thể là nguyên nhân đã chuyển bệnh nhân từ thiếu máu thể trung gian thành thể nặng như hiện nay sau 11 năm truyền máu. Trong khi mẹ của bệnh nhân lúc còn nhỏ chỉ phát hiện thiếu máu không r nguyên nhân ở trạm y tế, do xa bệnh viện và gia đình không có điều kiện nên bệnh nhân chỉ được đưa đến bệnh viện truyền máu khi bị ngất. Tính đến thời điểm trước kết hôn (20 tuổi , mẹ bệnh nhân chỉ truyền máu được hai lần. Mẹ bệnh nhân chỉ được chẩn đoán mắc bệnh β-Thal và được khám định kỳ khi điều trị cùng con. Như vậy, tất cả các xét nghiệm về thông số huyết học (công thức máu, điện di Hb,.là một bước không thể thiếu trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh nhân β-Thal. Nhưng theo nghiên cứu, chẩn đoán thalassemia thật sự được khẳng định khi kết hợp lâm sàng, các thông số huyết học với cả xét nghiệm sinh học phân tử tìm ra chính xác kiểu ĐB gây bệnh. Tất cả sẽ là cơ sở vững chắc giúp bác sĩ có thể khẳng định chính xác mức độ thiếu máu nặng, nhẹ cho mỗi bệnh nhân. Từ đó, một phác đồ điều trị sẽ được thiết lập phù hợp, giúp bệnh nhân giảm biến chứng và kéo dài tuổi thọ cũng như tránh những trường hợp truyền máu quá nhiều cho những kiểu ĐB gen gây thiếu máu trung gian. Tóm lại, bên cạnh các kiểu ĐB phổ biến chiếm tỷ lệ cao, nghiên cứu đã ghi nhận có đến 9 kiểu ĐB khác. Trong đó có cả ĐB mới, ĐB chưa phát hiện trong các nghiên cứu trước tại Việt Nam, hơn nữa các ĐB này còn rất hiếm gặp trên thế giới. Điều này cho thấy phổ ĐB của bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL rất rộng. Kết quả nghiên cứu là một tiền đề quan trọng trong việc gợi ý các xét nghiệm tìm kiểu gen cho bệnh nhân hoặc chẩn đoán trước sinh cho đối tượng mang gen có ý định có con. Cần phải chú trọng sử d ng k thuật phù hợp để tránh bỏ sót và dẫn đến việc chào đời bé thể nặng hoặc đánh giá sai về thể bệnh ảnh hưởng điều trị cho bệnh nhân . Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 105 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH 5.2.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến theo các nhóm dân tộc khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long Kết quả nghiên cứu ghi nhận: có sự khác nhau về số lượng người mang 2 đột biến với một ĐB theo từng dân tộc. Điều này là do quá trình chọn thuận tiện các đối tượng mắc bệnh β-Thal nhập viện trong thời gian thực hiện nghiên cứu tại nơi lấy mẫu (Bảng 4.7 . Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện số lượng và tỷ lệ các kiểu ĐB không giống nhau ở từng nhóm dân tộc nghiên cứu. Trong 4 dân tộc khảo sát ở khu vực ĐBSCL, dân tộc Kinh có số lượng các kiểu ĐB nhiều nhất. Có đến 16 kiểu ĐB được xác định, trong đó 97,5% ĐB thuộc 8 kiểu phổ biến ở Việt Nam, có 8 kiểu ĐB khác thuộc dạng không phổ biến chiếm 2,5%. Như vậy, các ĐB không phổ biến và ĐB mới trong nghiên cứu đều tập trung ở dân tộc này. Điều này có thể do 88% số lượng mẫu nghiên cứu được chọn là bệnh nhân β-Thal có dân tộc Kinh. Cỡ mẫu khá lớn đã tạo điều kiện cho sự xuất hiện các ĐB hiếm. Theo ghi nhận của nghiên cứu có 8/9 kiểu ĐB hiếm gặp được tìm thấy ở dân tộc Kinh. Trong khi, ở dân tộc Hoa chỉ có 4 kiểu ĐB xuất hiện: βCd41/42, βIVS2.654, β-28và βHbE và 100% là ĐB phổ biến. Đây cũng là các ĐB phổ biến của người Trung Quốc (Bảng 5.3 . Người Hoa ở miền nam Việt Nam đều do người Trung Quốc di cư sang. Do vậy, có thể lý giải sự xuất hiện các ĐB trong dân tộc này một phần là do sự di truyền từ tổ tiên. Dân tộc Khmer, ngoại trừ βCd15 là kiểu ĐB không phổ biến duy nhất tìm gặp và chiếm 2,6%. Có 4/5 kiểu thuộc dạng ĐB phổ biến: βHbE, βCd41/42, βCd17 và βIVS2.654 chiếm 97,4%. Trong đó, kiểu βHbE, βCd41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 48,7% và 33,3%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu 2011 của chúng tôi, tỷ lệ mang gen bệnh HbE trong cộng đồng dân tộc Khmer rất cao (31% . Khi thực hiện ARMS-PCR cho các bệnh nhân mang gen β-Thal, đột biến βCd41/42 cũng là ĐB duy nhất được phát hiện. Tuy tỷ lệ từng kiểu ĐB khác nhau ở mỗi dân tộc, nhưng nghiên cứu ghi nhận được ở cả 3 dân tộc: Kinh, Khmer, Hoa, 2 kiểu đột biến: βHbE, βCd41/42 luôn chiếm tỷ lệ cao nhất, bên cạnh sự xuất hiện các ĐB phổ biến khác. Ở khu vực ĐBSCL, dân tộc Hoa, Khmer sống ở rất nhiều tỉnh và thường co c m ở huyện xã riêng. Việc kết hôn cùng tộc vẫn còn xảy ra, thời gian gần đây, với sự hòa nhập các cộng đồng dân tộc các cuộc hôn nhân giữa dân tộc Hoa với các dân tộc Kinh, Khmer đã xuất hiện nhiều hơn. Điều này đã góp phần lan rộng các kiểu ĐB gây bệnh từ cộng đồng dân tộc này sang dân tộc khác. Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ sinh học 106 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH Trong khi các ĐB phổ biến xuất hiện hầu hết trên các nhóm dân tộc nghiên cứu, thì chỉ có 2 kiểu đột biến: βHbE và ()del được tìm thấy ở người Chăm. Đây là dân tộc có ít kiểu ĐB nhất trong 4 nhóm mà nghiên cứu ghi nhận được. Do đặc điểm sống tập trung dọc theo sông Hậu thuộc địa bàn các xã Châu Phong (huyện Tân Châu , xã Phú Hiệp (Phú Tân , xã Khánh Hoà (Châu Phú ,... của tỉnh An Giang. Để thuận tiện lấy mẫu bệnh nhân β-Thal người Chăm, nghiên cứu đã chọn bệnh viện đa khoa Châu Đốc, bệnh viện đa khoa trung tâm An Giang và cả bệnh viện Nhi Đồng 1 thành phố Hồ Chí Minh, bệnh viện nhi tuyến cuối của khu vực ĐBSCL. Tuy nhiên, trong suốt thời gian từ tháng 1/6/2013 đến 30/6/2016, nghiên cứu không ghi nhận được bất cứ trường hợp mắc bệnh β-Thal thể nặng nào. Tất cả các bệnh nhân tham gia xác định kiểu ĐB chỉ là người mang gen hoặc người mắc HbE ở trạng thái đồng hợp tử, chỉ có một bệnh nhân mang gen β-Thal do ĐB mất cả gen β-globin và một phần gen HbD, đối tượng này cũng đã chọn để nghiên cứu phả hệ. Các đối tượng không có dấu hiệu thiếu máu trên lâm sàng. Bệnh nhân nhập viện do mang bệnh lý khác và tình cờ phát hiện thiếu máu dạng β-Thal thể nhẹ. Khác với các dân tộc Kinh, Hoa, Khmer có thể kết hôn với dân tộc khác. Người Chăm chỉ kết hôn với người của dân tộc mình do cộng đồng người Chăm tại An Giang theo Hồi giáo Islam. Tín đồ theo đạo Islam thực hiện nghiêm túc giáo luật của Hồi giáo chính thống. Điều này đã tạo ra các tập t c truyền thống đặc biệt của người Chăm, giới hạn họ kết hôn với người khác dân tộc. Và có thể trong nguồn gốc di truyền, người Chăm không có nhiều các ĐB gây bệnh β-Thal như các dân tộc khác tại Việt Nam, nên dù tỷ lệ mang HbE nhiều (88,9% nhưng khó tìm được ĐB khác để kết hợp với HbE tạo ra β-Thal thể nặng. Kết quả nghiên cứu trên người Chăm ở khu vực ĐBSCL, khá giống với dân tộc Êđê và M’Nông tỉnh Đắc Lắc trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Minh, 2015. Trên 2 nhóm dân tộc này thiếu máu di truyền chủ yếu vẫn là HbE, có đến 148/561 bệnh nhân có HbE ở dân tộc M’Nông và 163/588 ở dân tộc Êđê, trong khi tỷ lệ đột biến β-Thal rất thấp. Tỷ lệ này lần lượt là 0,3% và 0,2% trên 2 nhóm M’Nông và Êđê. Đặt biệt, khi xác định kiểu ĐB, chỉ có βCd41/42 được tìm gặp. Như vậy, bệnh β-Thal không phải luôn phổ biến ở các dân tộc ít người. Tuy nhiên, nghiên cứu chỉ thực hiện trên một số lượng mẫu rất nhỏ và chỉ lấy mẫu tại các bệnh viện, nên vấn đề người Ch

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_su_di_truyen_cac_dot_bien_gay_benh_o_benh.pdf
Tài liệu liên quan