Luận án Nghiên cứu tăng cường tích luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây bá bệnh (eurycoma longifolia jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít

ợc xác định nhờ vào phần mềm máy tính ImageJ 1.50i . 2.2.5. Thực nghiệm và phương pháp định lượng các alkaloid thông qua phương pháp HPLC-DAD. Chiết mẫu thực vật Cân chính xác các mẫu cây Bá bệnh khô, chiết siêu âm trong MeOH ở 50oC trong thời gian 24 giờ. Lặp lại quá trình chiết 3 lần và gộp các dịch chiết lại. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm các mẫu dịch chiết thu được các cao chiết MeOH tương ứng. Chuẩn bị mẫu thử Cân khoảng 100 mg cao chiết MeOH mẫu Bá bệnh, chuyển vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH tới vạch mức, lắc đều. Dung dịch thu được được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi phân tích bằng HPLC Chuẩn bị mẫu chuẩn Các dung dịch chuẩn được pha từ các hợp chất (1), (2) và (3) tinh khiết trong MeOH ở các nồng độ tương ứng 10, 25, 50, 75, 125, 250 µg/ml và 0, 1 , 5, 10, 25, 50 µg/ml và được bảo quản tránh ánh sáng ở 40C cho đến khi phân tích. Thiết lập đường chuẩn định lượng. Phương pháp phân tích định lượng các hợp chất alkaloid của mẫu rễ tơ Bá bệnh được xây dựng trên cơ sở khảo sát mẫu dịch chiết rễ tơ kí hiệu là HR và các chất chuẩn (1), (2), (3). Qua tham khảo các tài liệu đã công bố và tiến hành khảo sát các yếu tố: bước sóng cho độ hấp thụ cực đại, loại cột sắc ký, nhiệt độ cột, tỷ lệ thành phần pha động, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng các hợp chất (1), (2) và (3) trong mẫu cây Bá bệnh được xây dựng như sau: Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh: kí hiệu ĐK-Bb Điều kiện phân tích: Cột sắc ký Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm) Detector DAD, bước sóng phát hiện 272 nm. Nhiệt độ cột 25oC 37 Tốc độ dòng 0,5 ml/ph Nồng độ mẫu 10 mg/ml Thể tích tiêm mẫu 10 µl Pha động ACN-H2O, chương trình gradient dung môi: Thời gian (phút) 0 10 35 45 60 ACN (% thể tích) 10 20 50 90 90 Định lượng các chất sạch (1), (2), (3) bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu thử với giá trị diện tích pic trên đường chuẩn. 2.2.6. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng và tích luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh trên bình tam giác 500 ml Điều kiện thí nghiệm Toàn bộ thí nghiệm được bố trí trong điều kiện phòng thí nghiệm. Độ pH của môi trường được điều chỉnh từ 5,8 ± 0,1 rồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oC trong 15 phút. Nhiệt độ buồng nuôi : 25oC ± 1oC Độ ẩm tương đối : 75-80 % Số lần nhắc lại của công thức thí nghiệm: 3 lần/ 1 công thức, mỗi lần 5 bình Phòng nuôi cấy thông thoáng, sạch sẽ và có lọc khí. Các thao tác thí nghiệm được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Các dụng cụ thí nghiệm được khủ trùng bằng nồi hấp khử trùng và đốt trên ngọn lửa đèn cồn. 2.2.6.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh Nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh, rễ tơ nuôi cấy trên môi trường thạch 3 tuần tuổi được cắt thành những đoạn ngắn và cân 0,3 g khối lượng tươi (KLT) , sau đó gắp những đoạn rễ này vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường kí hiệu là MR = SH + 1 g/l myo-niositol + 30 g/l sucrose Thí nghiệm được tiến hành theo công thức sau: CT1 = MR + 2,5 g/l gelrile (nuôi trong tủ tối) CT2 = MR + 0 g/l gelrile (lắc tốc độ 80 vòng/ phút). 38 Sau 30 và 50 ngày ghi nhận số liệu. => So sánh hai công thức, công thức có trạng thái môi trường tốt nhất cho khả năng sinh trưởng và phát triển của rễ tơ được ký hiệu là MR1. 2.2.6.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh Thí nghiệm được tiến hành theo công thức MR1 đã xác định được ở thí nghiệm 1 với điều kiện chiếu sáng và không chiếu sáng theo công thức sau: CT1 = MR1 + điều kiện chiếu sáng (2500-3000 lux) CT2 = MR1 + điều kiện nuôi trong tối Sau 30 ngày quan sát và ghi nhận số liệu. => Xác định được điều kiện chiếu sáng thích hợp cho sinh trưởng và phát triển rễ tơ được ký hiệu là MR2. 2.2.6.3. Ảnh hưởng chiều dài mẫu ban đầu đến khả năng sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh trong quá trình cấy chuyển. Thí nghiệm được tiến hành theo công thức MR2 đã xác định được ở thí nghiệm 2 với mẫu nuôi cấy được cắt với chiều dài khác nhau theo các công thức sau: CT1= MR2 + 0,2 - 0,4 cm CT2 = MR2 + 0,6 - 0,8 cm CT3 = MR2 + 1,0 - 1,2 cm Sau 30 ngày quan sát và ghi nhận số liệu => Xác định được chiều dài rễ phù hợp cho sinh trưởng và phát triển rễ tơ trong quá trình cấy chuyển được ký hiệu là MR3 2.2.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển ban đầu đến sự sinh trưởng và phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh trong 100 ml môi trường Thí nghiệm được tiến hành theo công thức nuôi cấy MR3 đã xác định được ở thí nghiệm mục 2.2.3.3 với khối lượng rễ ban đầu thay đổi theo các công thức sau: CT1 = MR3 + 0,1 g rễ tươi CT2= MR3+ 0,2 g rễ tươi CT3= MR3+ 0,3 g rễ tươi CT4= MR3+ 0,4 g rễ tươi Sau 30 ngày quan sát và ghi nhận số liệu 39 => Xác định được MR3 với khối lượng rễ ban đầu thích hợp cho sinh trưởng và phát triển rễ tơ trong quá trình cấy chuyển được ký hiệu là MR4. 2.2.6.5. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến sinh trưởng và tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) trong nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh Thí nghiệm được tiến hành theo công thức nuôi cấy MR4 đã xác định được ở thí nghiệm mục 2.2.3.4 với môi trường nuôi cấy thay đổi theo các công thức sau: CT1= MR4 + MS (Murashige & Skoog, 1962) CT2 = MR4 + WPM (McCown’s Woody Plant, 1981) CT3 = MR4 + SH + 1 g/l myo-inositol (Schenk and Hidebrandt, 1972) Sau 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ngày quan sát và ghi nhận số liệu. => Xác định được công thức MR4 với môi trường khoáng (ký hiệu là MR5) và thời gian nuôi cấy (T1) thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của rễ tơ. => Xác định được công thức MR4 với môi trường khoáng ( kí hiệu là MR6) và thời gian (T2, T3, T4) nuôi cấy thích hợp nhất cho tích luỹ tương ứng chất (1) 7-MCPA, chất (2) 9-methoxycathin-6-one, chất (3) 9-hydroxycathin-6-one. 2.2.6.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của jasmonic acid (JA) đến tăng cường tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) trong nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh Nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của JA đến tích luỹ các chất alkaloid tiến hành thí nghiệm theo công thức MR6 với hàm lượng JA thay đổi theo các công thức sau: CT1: MR6 + 1 mg/l JA CT2: MR6 + 4 mg/l JA CT3: MR6 + 8 mg/l JA CT4: MR6 + 16 mg/l JA JA được hoà trong nước cất và lọc qua màng lọc 0,025 µm Theo dõi và đánh giá số liệu theo thời gian T2, T3, T4 đã xác định được ở thí nghiệm mục 2.2.6.5 cho từng chất (1), (2), (3). Khối lượng khô được đánh giá theo thời gian T1 đã xác định ở mục 2.2.6.5 => Xác định được MR6 với lượng JA thích hợp cho tích luỹ chất (1), (2), (3) trong rễ tơ cây Bá bệnh. 2.2.6.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của salicylic acid (SA) đến tăng cường tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) trong nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh 40 Nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của SA đến tích luỹ các chất alkaloid 1, 2, 3 thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MR6 với hàm lượng SA thay đổi theo các công thức sau: CT1: MR6 + 5 mg/l SA CT2: MR6 + 10 mg/l SA CT3: MR6 + 20 mg/l SA CT4: MR6 + 40 mg/l SA Theo dõi và đánh giá số liệu theo thời gian T2, T3, T4 đã xác định được ở thí nghiệm mục 2.2.6.5 cho từng chất (1), (2), (3). Khối lượng khô được đánh giá theo thời gian T1 đã xác định ở mục 2.2.6.5 => Xác định được MR6 với lượng SA thích hợp cho tích luỹ chất (1), (2), (3) trong rễ tơ cây Bá bệnh 2.2.6.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của yeast extract (YE) đến tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) trong nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh Nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của YE đến tích luỹ các chất alkaloid (1), (2), (3) thí nghiệm được tiến hành theo công thức MR6 với hàm lượng YE thay đổi theo các công thức sau: CT1: MR6 + 0 mg/l YE CT2: MR6 + 10 mg/l YE CT3: MR6 + 20 mg/l YE CT4: MR6 + 40 mg/l YE CT5: MR6 + 80 mg/l YE Theo dõi và đánh giá số liệu theo thời gian T2, T3, T4 đã xác định được ở thí nghiệm mục 2.2.6.5 cho từng chất (1), (2), (3). Khối lượng khô được đánh giá theo thời gian T1 đã xác định ở mục 2.2.6.5 => Xác định được MR6 với lượng YE thích hợp cho tích luỹ chất (1), (2), (3) trong rễ tơ cây Bá bệnh. Chỉ tiêu theo dõi: Xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô rễ tơ (g/bình). Quan sát định kỳ (5 ngày/lần) Đánh giá kết quả nuôi cấy: 41 Tỷ lệ tăng trưởng của rễ = (Khối lượng rễ tươi/khô thu được)/(Khối lượng rễ tươi/khô ban đầu) Hàm lượng khô của rễ tơ (%) = (Khối lượng khô sau khi sấy x 100)/ khối lượng tươi Tỷ lệ mẫu rễ tơ sống sót (%) = số mẫu sống sau 10 ngày nuôi cấy x 100/ tổng số mẫu ban đầu Hàm lượng chất (1), (2), (3) có trong rễ tơ được tính theo phương pháp định lượng HPLC-DAD 2.2.7. Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh trên hệ thống Bioreactor 20 lít Dựa trên hệ thống bioreactor lên men vi sinh vật có sẵn thiết kế một số mẫu bioreactor sử dụng được cho các thí nghiệm nuôi cấy sinh khối với các dung tích 5 – 20 lit. Dựa vào tài liệu tham khảo [59], tôi lựa chọn mô hình bioreactor dạng sủi bọt dạng cầu để nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh. Bioreactor sủi bọt dạng cầu có cấu trúc đơn giản nhất trong các dạng bình bioreactor, chỉ bao gồm bình chứa chính là bình nhựa 20 lít, đường cung cấp khí vào, đường thoát khí, các màng lọc khí vào và khí ra để đảm bảo vô trùng, đầu sục khí, ống nối, dây buộc hệ thống kiểm soát các điều pH, nhiệt độ, độ oxy hòa tan tiến hành mua các chi tiết được minh hoạ như hình 2.5. Hình 2.5. Mô phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt dạng cầu tự tạo Bioreactor này ı́t tạo ra lực xé, phù hợp với việc nuôi cấy rễ tơ, và đơn giản khi tiến hành lắp ráp cũng như khử trùng một cách dễ dàng. Hệ thống bioreactor ở Việt Nam cũng đang được phát triển bởi một số tác giả như Nguyễn Hữu Hổ hay Dương Tấn Nhựt [27]. Bên cạnh đó, trên thế giới đặc biệt là Hàn Quốc [44] đất nước của các loài sâm cũng như ngành công nghiệp dược phẩm từ sâm thì hệ thống Màng lọc khíỐng tiếp môi trường Ống thoát khí Ống dẫn khí ống nối Đầu sục khí 42 bioreactor của họ đang sử dụng cũng là hệ thống nuôi cấy dạng bọt khí bên cạnh các cải tiến để tối ưu hoá các điều kiện sinh trưởng cho rễ tơ. 2.3. Phương pháp xử lý số liệu Mỗi thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Các kết quả và giá trị trung bình và ± SD của 3 lần lặp lại. Số liệu được phân tích bằng student t-test với p ≤ 0,05 bằng phần mềm Excel. 43 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được từ cao chiết alkaloid Chọn phần cao chiết alkaloid của rễ tơ để phân lập các chất, chúng tôi tiến hành quy trình phân lập các chất theo các bước đã được đưa ra trong phần thực nghiệm mục 2.1.2.2. Sắc ký cột silica-gel cao chiết alkaloid với hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp CH2Cl2/CH3OH theo tỷ lệ 25/1 (v/v) thu được các hợp chất (1), (2), (3). Hình 3.1. Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng một số phân đoạn của cao chiết alkaloid Chất (1) 7-MCPA: 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d 3.90 (3H, s, 7-OCH3), 6.13 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-2′), 6.95 (1H, dd, J = 2.0, 9.0 Hz, H-6), 7.04 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.56 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-1′), 8.19 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-5), 8.24 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-4), 8.37 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-3). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): d 133.3 (C-1), 133.7 (C-3), 115.8 (C-4), 123.5 (C- 44 5), 110.8 (C-6), 161.7 (C-7), 94.6 (C-8), 143.5 (C-9), 113.7(C-10), 131.8 (C-11), 134.8 (C-12), 128.9 (C-1′), 129.1 (C-2′), 166.8 (C-3′), 55.5 (7-OCH3). Hợp chất (1) thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng chanh. Phổ khối HR-ESI-MS cho pic ion phân tử [M +H]+ ở m/z 269.0929 tương ứng với công thức phân tử C15H13N2O3. Trên phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của vòng thơm hệ ABX tại dH 6.95 (1H, dd, J = 2,0; 9,0 Hz; H-6), 7,04 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 8), 8,19 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), một tín hiệu liên kết đôi dạng trans tại dH 6.13 (1H, d, J = 13,0 Hz, H-2 ') và 7,56 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-1') và 1 nhóm methoxy tại δH 3,90. Ngoài ra, hai tín hiệu proton olefinic trong vòng thơm xuất hiện trong vùng trường thấp tại δH 8,24 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-4), 8,37 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-3). Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy sự hiện diện của một nhóm methoxy, bảy nhóm methine và bảy cacbon bậc bốn. Một nhóm carboxylic (δC 166,8) và hai tín hiệu methine (δC 128,9 và 129,1) của hợp phần axit propenoic. Phần tín hiệu còn lại tương ứng khung với β-Carboline được tìm thấy trước đây ở Eurycoma sp [3, 60, 61]. Những dữ liệu này có nhiều điểm chung với dữ liệu phổ của 6-methoxy- (9H-β-carbolin-1-il) - (Z) axit -2-propenoic trong báo cáo của Nunomura et al 2012 [62]. Tuy nhiên, hằng số tương tác khá lớn (J = 13,0 Hz) của các proton olefinic là H-1' và H-2' cho thấy sự tồn tại liên kết đôi dạng trans trong hợp chất (1). Các phân tích mở rộng của tương quan HMBC khẳng định rằng nhóm methoxy gắn với C-7, do đó hợp chất (1) được khẳng định là 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-yl)-(E)-3-propenoic acid, là hợp chất mới chưa được công bố trên thế giới. Chất (2): 9-methoxycanthin-6-one 45 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d 6,88 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-5); 7,05 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-10); 7,84 (1H, s, H-8); 8,01 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11); 8,03 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-4); 8,08 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-1); 8,69 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-2). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): d 116,1 (C-1); 145,8 (C-2); 139,8 (C-4); 128,0 (C- 5); 158,8 (C-6); 100,6 (C-8); 161,1 (C-9); 113,0 (C-10); 124,1 (C-11); 116,8 (C-12); 140,1 (C-13); 129,3 (C-14); 131,5 (C-15); 135,0 (C-16); 55,7 (9-OCH3). Hợp chất (2) thu được dưới dạng chất bột vô định hình vàng cam.Trên phổ 1H- NMR xuất hiện các tín hiệu trong vùng trường yếu của vòng thơm tại dH 7,05 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-10), 7,84 (1H, s, H-8), 8.01 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11). Ngoài ra các tín hiệu proton trong vòng thơm chứa nguyên tố dị tố ni tơ tại dH 8,08 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-1); 8,69 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-2) và tín hiệu nối đôi tại dH 6.88 (H-3) / 8,03 (H- 4). Bên cạnh trong vùng trường trung bình xuất hiện tín hiệu của nhóm methoxy tại dH 55,7. Trên phổ 13C NMR và phổ DEPT cho thấy phân tử chứa 15 nguyên tử cacbon bao gồm 1 nhóm methoxy, 7 nhóm metin và 7 nguyên tử cacbon bậc bốn. Các píc tín hiệu biến đổi trong vùng trường trung bình từ dC 100.6 đến 145.8 đặc trưng cho các nhóm nguyên tử cacbon trong vòng thơm và nối đôi. Ngoài ra thấy hai píc tín hiệu tại vùng trường thấp hơn tại dC 158.8 của nhóm cacboxyl, giá trị thấp này do nhóm cacboxyl liên hợp với nối đôi, và tín hiệu dC 161.6 của nguyên tử cacbon gắn với nhóm oxymetyl. Hợp chất có khối lượng phân tử M = 250 do trên phổ khối lượng phun mù điện tử xuất hiện tín hiệu m/z: 251 [M+H]+. Qua phân tích trên cho dự đoán hợp chất trên thuộc nhóm chất ankaloid. Bên cạnh đó khi so sánh dữ liệu phổ ương ứng với hợp chất 9-methoxycathin-6-one trong tài liệu tham khảo thấy trùng nhau. Vậy kết luận được hợp chất (2) chính là 9- methoxycathin-6-one [7, 63]. Chất (3): 9-hydroxycanthin-6-one 46 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d 6,93 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-5); 6,98 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-10); 7,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 8,06 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-4); 8,08 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-1); 8,11 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11); 8,72 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-2). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): d 115,8 (C-1), 145,8 (C-2); 139,9 (C-4); 128,0 (C- 5); 158,9 (C-6); 102,9 (C-8); 160,4 (C-9); 114,0 (C-10); 124,5 (C-11); 115,5 (C-12), 140,5 (C-13); 128,9 (C-14); 131,6 (C-15); 135,0 (C-16). Hợp chất (3) thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu vàng. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu trong vùng trường yếu của vòng thơm và nối đôi, trong đó các tín hiệu đặc trưng cho vòng thơm hệ ABX tại dH 7,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8; 6,98 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-10) và 8,11 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11). Ngoài ra các tín hiệu proton trong vòng thơm chứa nguyên tố dị tố ni tơ tại dH 8,08 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-1) và 8,72 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-2) và tín hiệu nối đôi tại dH 6,93 (H-3) / 8,06 (H-4). Trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy phân tử chứa 14 nguyên tử cacbon bao gồm 7 nhóm metin và 7 nguyên tử cacbon bậc bốn. Các píc tín hiệu biến đổi trong vùng trường trung bình từ dC 102,9 đến 145,9 đặc trưng cho các nhóm nguyên tử cacbon trong vòng thơm và nối đôi. Ngoài ra thấy hai píc tín hiệu tại vùng trường thấp hơn tại dC 158,9 của nhóm cacboxyl, giá trị thấp này do nhóm cacboxyl liên hợp với nối đôi, và tín hiệu dC 160,5 của nguyên tử cacbon gắn với nhóm hydroxyl. Qua phân tích trên cho dự đoán hợp chất trên thuộc nhóm chất ankaloid. Phổ khối lượng phun mù điện tử xuất hiện tín hiệu m/z: 237 [M+H]+, do đó hợp chất có khối lượng phân tử M = 236. Bên cạnh đó khi so sánh dữ liệu phổ ương ứng với hợp chất 9-hydroxycathin- 6-one trong tài liệu tham khảo thấy trùng nhau. Vậy kết luận được hợp chất (3) chính là 9-hydroxycathin-6-one [7]. Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học của cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh được nghiên cứu. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao chiết alkaloid cho thấy cây có chứa các hợp chất β-Carboline alkaloids (7-methoxy- (9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid), hợp chất Canthin-6-one alkaloids (9- methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one) (hình 3.2). Qua kết quả thử hoạt tính sinh học và các tài liệu tham khảo về các nhóm chất trên, có thể hy vọng đây 47 chính là các hợp chất góp phần tạo nên hoạt tính của cây. Sau đây là kết quả khảo sát một vài hoạt tính của những chất mà chúng tôi phân lập được. Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng của chất (1), (2), (3) phân lập được từ cao chiết methanol của rễ tơ cây Bá bệnh . Sử dụng dung môi CH2Cl2-CH3OH (20:2 v/v) chạy bản mỏng, bắt UV 254 nm, đốt bản mỏng với H2SO4 10%. 3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập được từ cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh 3.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3) Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các chất thử (1), (2), (3) KB: Ung thư biểu mô; LU-1 ung thư phổi; MCF-7 ung thư vú; HepG2 ung thư gan STT Chất thử Dòng tế bào % ức chế tại nồng độ IC50 (µg/ml) 100 20 4 0,8 (µg/ml) 1 7-MCPA (1) MCF-7 98,8 90,6 27,7 2,9 6,3 9- methoxycanthin -6-one (2) KB 95,7 73,9 20,8 9,1 10,3 2 LU-1 97,0 76,5 25,2 9,3 8,6 MCF-7 98,2 72,8 29,8 8,5 8,4 HepG2 96,9 66,7 32,3 9,2 9,3 9- hydroxycanthin- 6-one (3) KB 95,4 47,2 14,2 0,1 23,5 3 LU-1 92,8 61,3 32,3 11,4 11,2 MCF-7 75,5 36,6 19,4 9,8 39,7 HepG2 84,2 39,9 15,1 9,2 34,2 48 Các chất sạch 7-MCPA, 9-methoxycanthin-6-one, 9-hydroxycanthin-6-one phân lập được từ cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh được kiểm tra hoạt gây độc tế bào ung thư ở nồng độ thử là (0,8; 4; 20; 100 µg/ml), thông qua phép thử độc tế bào với bốn dòng tế bào ung thư đặc trưng được lựa chọn là KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan). Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào được trình bày ở bảng 3.1 Từ bảng kết quả 3.1 ta nhận thấy: khả năng ức chế của chất mới 7-MCPA trên dòng tế bào ung MCF-7 là khá mạnh, thể hiện ở giá trị IC50 thấp đạt 6,3 (µg/ml). Chất đối chứng ellipticine thể hiện hoạt tính gây độc ổn định với giá trị IC50 là 0,38 (µg/ml). Chất 7-MCPA là chất mới phân lập được từ rễ tơ cây Bá bệnh nên đây là lần đầu chất này được khảo sát hoạt tính gây độc tế bào. Trong những nghiên cứu tiếp theo có thể tiếp tục khảo sát trên các dòng tế bào gây độc khác và có thể khảo sát sâu hơn về cơ chế tác dụng vì chất này thể hiện hoạt tính khá mạnh. Hợp chất (2) 9-methoxycanthin-6-one thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư khá tốt trên cả 4 dòng tế bào với IC50 trên dòng tế bào KB là 10,3; LU-1 là 8,6; MCF-7 là 8,4; HepG2 là 9,3 (µg/ml). Ở nồng chất thử > 20 µg/ml chất (2) đã ức chế trên 66,7 % số lượng tế bào ở cả bốn dòng thử nghiệm. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ chất thử lên 100 µg/ml chất (2) cũng ức chế hơn 96% lượng tế bào của bốn dòng thử nghiệm. Năm 2003, Kuo và cs đã tách được một số hợp chất từ rễ tự nhiên cây Bá bệnh. Trong đó, có alkaloid 9-methoxycanthin-6-one đã được chứng minh gây độc tế bào đáng kể chống lại ung thư phổi (A-549) và ung thư vú ở người (MCF-7), đạt giá trị IC50 lần lượt <2,5 và 4,5 (µg/ml) [4]. Một nghiên cứu khác, Nurhanan báo cáo 9-methoxycanthin-6-one có thể chống tăng sinh tế bào ung thư buồng trứng [ 16]. Như vậy, có thể thấy chất (2) là chất đã được khảo sát trên một số dòng gây độc tế bào ung thư nhưng chưa được nghiên cứu sâu. Chính vì vậy trong những nghiên cứu tiếp theo có thể khảo sát sâu hơn về cơ chế tác dụng. Hợp chất (3) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư LU-1 khá tốt, cũng ức chế 92,8 % lượng tế bào ở nồng độ chất thử là 100 (µg/ml) và đạt giá trị IC50 là 11,2 µg/ml. Trên dòng tế bào KB, MCF-7, HepG2, thì hoạt tính của chất (3) đều thấp hơn, giá trị IC50 chỉ đạt lần lượt là 23,5; 39,7; 34,2 (µg/ml). Qua sự rà soát các tài liệu tham khảo, tôi thấy hiện nay chưa có nghiên cứu nào được công bố về hoạt tính gây độc tế 49 bào ung thư của chất (3). Chất đối chứng ellipticine thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả bốn dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trên dòng tế bào KB là 0,46; LU-1 là 0,43; MCF-7 là 0,38; HepG2 là 0,51 (µg/ml). Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất 1 (7-MCPA) trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Hình 3.4. Ảnh hưởng của chất (2) (9-methoxycanthin-6-one) trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (Ảnh được chụp bằng kính hiển vi soi ngược Olympus, độ phóng đại 100 lần) Tóm lại, chất (1) và (3) thể hiện hoạt tính khá tốt ở dòng tế bào ung thư tương ứng MCF-7 và LU-1, chất (2) thể hiện hoạt tính tốt trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm. Chất (2) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tốt hơn chất (3) trên dòng KB, LU-1, MCF- 7, HepG2. So sánh cấu trúc hợp chất (2) và (3) cho thấy 2 chất này chỉ khác nhau nhóm methoxy và hydroxy gắn ở vị trí cacbon số 7. Có thể nói, nhóm chức methoxy có thể đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính ức chế dòng tế bào KB, MCF7, LU- 1, HepG2 của chất (2). Các kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư thực nghiệm trên đây cho thấy (1), (2) như là một hoạt chất có nguồn gốc thảo dược trong việc điều trị ung thư. 3.2.2. Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại thực bào chuột và người kích thích bởi LPS của chất (1), (2), (3) Các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính chống viêm từ lâu đã được 100 (µg/ml) 20 (µg/ml) 4 (µg/ml) 0,8 (µg/ml) !!!!!!!!!!!!!!100!(µg/ml)!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!20!(µg/ml)!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!4!(µg/ml)!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!0.8!(µg/ml)!100 (µg/ml) 20 /ml) 4 (µ ) 0,8 (µg/ml) 50 sử dụng như là một phương thuốc dân gian cho các triệu chứng viêm như sốt và đau. Trong quá trình viêm các cytokine gây viêm như IL-6 và TNF-α tiết ra từ đại thực bào đóng vai trò quan trọng. Thành phần của những sản phẩm này thường chứa một số hợp chất chính như terpenoid, flavonoid, phenolic, polyphenolic, hợp chất có lưu huỳnh và một số hợp chất alkaloid. Do đó, trong phần này tác dụng kháng viêm của các alkaloid (1), (2), (3) được phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh được nghiên cứu, xác định xem các chất này có ức chế sản xuất IL-6 và TNF-α trong dòng tế bào RAW264.7, ĐTB chuột và dòng tế bào người THP-1 hay không. Trước khi tiến hành thử nghiệm các chất thử được thử được tiến hành thử nghiệm xem có gây ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào hay không. Kết quả thử nghiệm cho thấy, sự sống sót của 3 loại tế bào RAW264.7, ĐTB của chuột và THP-1 không bị ảnh hưởng khi xử lý các chất (1), (2), (3) với các nồng độ khác nhau (1, 3, 10, 30 µM) (phần trăm sống sót của các dòng tế bào > 97 % so với đối chứng) (hình 3.5). Hình 3.5. Kết quả ảnh hưởng của chất (1), (2), (3) lên sự sống của tế bào đại thực bào chuột và người. Như vậy thí nghiệm thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên dòng các tế bào đại thực bào được tiến hành. Các dòng tế bào được xử lý với chất thử khác nhau ở nồng độ khác nhau (1, 3, 10, 30 µM) trong 30 phút trước khi kích thích bằng LPS (1 µg/ml). Dịch nuôi cấy tế bào được thu sau 24 h và xác định hàm lượng IL-6 và TNF-α tạo ra được xác định bằng ELISA. Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, chất (1) 7-MCPA đã ức chế việc sản xuất IL-6 và TNF-α ở dòng RAW264.7 ; ĐTB của chuột và dòng THP-1 với giá trị tương ứng IL- 6-IC50 là 4,5; 12,8 và 9,9 µM; TNF-α-IC50 là 6,6 ; 12,4 và 16,0 µM (Bảng 3.2). Những 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 Dòng tế bào ĐTB RAW146.7 của chuột Đại thực bào của chuột Dòng tế bào ĐTB THP-1 của người - 0 1 3 10 30 1 3 10 30 1 3 10 30 µM Chất (1) 7-MC