Luận án Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

ông qua hoạt độ enzym phytaza (cơ chất chứa Phosphat hữu cơ) bằng dung dịch màu amonium molypdate (phụ lục 2). *Khả năng đồng hóa Phospho (PO4 3-) trong nước thải. + Xác định hạt volutin (poly-P) trong tế bào vi sinh vật (Szabó và cs, 2011) - Nguyên tắc: Dựa vào khả năng bắt màu của hạt volutin (hạt poly-P) với thuốc thử Neisser (phụ lục 1) tạo thành các hạt màu đen xanh trong tế bào vi sinh vật. -Tiến hành: Nuôi cấy khuẩn lạc thuần trong 100 ml môi trƣờng nƣớc thải (phụ lục 1) trên máy lắc 150v/p trong 5 ngày ở 250C. Lấy mẫu, sử dùng thuốc thử Neisser để nhuộn tế bào, sau đó quan sát dƣới kính hiển vi quang học. +Xác định nồng độ Phospho trong tế bào vi sinh vật (Bosch và Cloete, 1993). Khuẩn lạc thuần đƣợc nuôi cấy trong 10ml môi trƣờng NB ở 250C trong 24giờ. Lấy 4 ml dịch nuôi cấy cho vào bình nón chứa 96 ml môi trƣờng nƣớc thải (nồng độ P ban đầu đã đƣợc xác định). Bình đã đƣợc đậy kín và ủ kỵ khí 250C trong 2 giờ, sau đó để ở điều kiện hiếu khí trong 5 giờ bằng cách đặt trên máy lắc 150 v/p ở 250C, lƣu ý pH 7.5. Dịch nuôi cấy đƣợc lọc qua phin lọc kích thƣớc 0,22 μm để loại bỏ tế bào, xác định nồng độ P bằng máy quang phổ với bƣớc sóng 660 nm. 52 P hấp thu trong tế bào (mg/l) = [P môi trƣờng ban đầu (mg/l) - P dịch nuôi cấy vsv (mg/l)] / [mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy (tế bào/ml)x1000]. *Xác định mật độ tế bào (Nguyễn Lân Dũng, 1983) Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch (phần 2.3.3.1) 2.3.3.4. Đánh giá khả năng chuyển hóa chất ô nhiễm trong nƣớc thải CBTBS của vi sinh vật phân lập Dịch nuôi cấy vi sinh vật phân lập đƣợc bổ sung vào bình tam giác chứa 100ml nƣớc thải CBTBS, sao cho mật độ tế bào đạt khoảng 105CFU/ml. Đối chứng là nƣớc thải CBTBS không bổ sung dịch vi sinh vật. Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng, trên máy lắc với tốc độ 150v/p. Sau thời gian nuôi cấy 3-5 ngày, xác định các chỉ số COD, BOD5, Nts, Pts trong nƣớc thải CBTBS ở công thức thí nghiệm và đối chứng. Hiệu quả xử lý (COD, BOD5, Nts, Pts) so với đối chứng = chỉ số (COD, BOD5, Nts, Pts) trong công thức thí nghiệm giảm đi /chỉ số (COD, BOD5, Nts, Pts) trong công thức đối chứng x 100 (%). 2.3.4. Định danh vi sinh vật tuyển chọn 2.3.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống. Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá và khoá phân loại của Bergey (Niall A. và cs, 2009); chƣơng trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (E.B. Shirling và cs, 1966) đối với xạ khuẩn; khóa phân loại Bergey (Stanley T. và cs, 1989; Holt J.G. và cs, 2000; Holt J.G. và cs, 1994) đối với vi khuẩn. * Xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá: Đặc điểm khuẩn lạc, khả năng hình thành bào tử, phản ứng catalaza, nhu cầu oxy, các đặc điểm sinh hoá đƣợc thực hiện theo các phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học thông thƣờng. Hình ảnh tế bào đƣợc quan sát trên kính hiển vi điện tử. * Xác định khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trƣờng cơ bản đặc hiệu từng chủng (dạng dịch thể) ở điều kiện thích hợp, thay thế các nguồn hydratcacbon khác nhau. Dựa vào sự chuyển biến màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng dƣơng tính hay âm tính. 53 2.3.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử Là phƣơng pháp phân loại dựa trên giải trình tự gien 16S rADN. Xác định trình tự 16S rADN của các chủng vi sinh vật theo phƣơng pháp của Sakiyama và cs năm 2009. Chi tiết các bƣớc đƣợc trình bày trong phụ lục 3. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM®3100-Avant Gienetic Analyzer-Mỹ). Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý trên phần mềm Clustal X. Các trình tự đƣợc so sánh với trình tự 16S rADN của các loài đã đƣợc công bố từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GienBank. Xây dựng cây phát sinh chủng loại, phân tích Bootstrap đƣợc thực hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên. Tên loài vi sinh vật đƣợc xác định với xác suất tƣơng đồng cao nhất 2.3.5. Nhân sinh khối vi sinh vật bằng kỹ thuật lên men chìm *Xác định nhiệt độ tối ưu Các chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể, pH thích hợp, điều kiện lắc 150v/p. Nhiệt độ nuôi cấy đƣợc điều chỉnh trong khoảng từ 20-550C. Sau thời gian nuôi cấy phù hợp với từng chủng, xác định mật độ tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy để xác định ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng phát triển các chủng vi sinh vật. *Xác định pH tối ưu Môi trƣờng nuôi cấy có các độ pH khác nhau từ 5-9, khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 1210C trong thời gian 20 phút. Nuôi cấy vi sinh vật ở 300C và lắc với tốc độ 150v/p. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp tiến hành kiểm tra mật độ vi sinh vật. Xác định pH thích hợp cho sinh trƣởng phát triển của vi sinh vật. *Thời gian nhân sinh khối Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trƣờng dịch thể, pH, nhiệt độ thích hợp với từng chủng, ở điều kiện lắc 150v/p. Sau khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau (1-7 ngày), tiến hành kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy. * Ảnh hưởng của môi trường nhân sinh khối 54 Các chủng vi sinh vật đƣợc lên men ở môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau, điều kiện lắc 150v/p, ở nhiệt độ, pH, thời gian phù hợp với từng chủng. Kiểm tra mật độ tế bào có trong các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau và xác định môi trƣờng lên men thích hợp nhất cho các chủng vi sinh vật. *Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống Các chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc nuôi cấy cấp 1 trong bình tam giác 250 ml ở môi trƣờng dinh dƣỡng đặc hiệu, pH và nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Sau 24-48 giờ nuôi cấy, vi sinh vật đƣợc cấy truyền sang nuôi sinh khối cấp 2 trong thiết bị lên men 5 lít trong môi trƣờng lựa chọn ở trên với các tỷ lệ tiếp giống thay đổi trong khoảng từ 3-10%. Kết thúc quá trình nuôi cấy kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật để lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp nhất. * Ảnh hưởng của tốc độ cấp khí Các chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng, tỷ lệ tiếp giống thích hợp lựa chọn ở trên, pH, nhiệt độ thích hợp với từng chủng trong thiết bị lên men 5 lít có kiểm soát lƣợng không khí sục vào thay đổi từ 0,25-1,0 lít không khí/lít môi trƣờng/phút. Kết thúc quá trình nuôi cấy kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật để lựa chọn chế độ cấp không khí thích hợp nhất. * Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy theo phương pháp bề mặt đáp ứng Phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface methodology) sử dụng kỹ thuật mô hình thống kê thực nghiệm, để phân tích hồi quy đa điểm bằng phần mềm (Design Expert Version 9.0.6.2). Tập hợp dữ liệu định lƣợng nhận từ thiết kế các yếu tố, nhằm giải quyết đồng thời sự tác động của các yếu tố bằng phƣơng trình đa biến. Các thành phần môi trƣờng đã lựa chọn có ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym đƣợc tối ƣu hóa sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm điểm. Theo thiết kế này, tổng số các phƣơng án kết hợp xử lý là 2k+ 2k + n0. Trong đó k là số biến độc lập và n0 là số lặp lại thí nghiệm ở tâm. Để tính toán thống kê, các biến Xi đƣợc mã hóa là xi theo phép biến đổi sau: xi = Xi –Xo/δX Trong đó xi là giá trị đƣợc mã hóa vô hƣớng của biến số Xi, Xo là giá trị của Xi tại tâm điểm và δX là bƣớc thay đổi (bƣớc nhảy). Để tối ƣu thành phần môi 55 trƣờng, ngƣời ta sử dụng thiết kế có 2k yếu tố. Phƣơng trình tối ƣu các thành phần môi trƣờng đƣợc đƣa ra dựa trên cơ sở của phƣơng trình bậc hai sau: Y= β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj Trong đó Y là kết quả dự đoán, β0 là giới hạn bị chặn, βi là ảnh hƣởng tuyến tính, βii là ảnh hƣởng bậc hai và βij là sự tƣơng tác qua lại. Phƣơng trình hồi quy tối ƣu cho giá trị lớn nhất nhận đƣợc ở các điều kiện tối ƣu sử dụng DX8. + Xây dựng mô hình toán học Y= β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj + Xác định các biến ảnh hƣởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ các tài liệu công bố và xây dựng trên cơ sở khảo sát thực nghiệm. + Xây dựng các biến số và khoảng chạy + Lập ma trận thực nghiệm và thu kết quả + Kiểm tra mức độ phù hợp của mô hình đã xây dựng và sự có nghĩa của các hệ số hồi qui. + Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher. + Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phƣơng pháp hàm mong đợi. 2.3.6. Nhân sinh khối vi sinh vật trên giá thể rắn *Lựa chọn và xử lý chất mang - Chất mang: sử dụng tinh bột sắn, cao lanh có kích thƣớc hạt ≤ 0,1mm, với các hạt kích thƣớc lớn thì phải nghiền nhỏ, để kích thƣớc chất mang đồng đều và tăng diện tích dính bám với vi sinh vật. - Tinh bột sắn bổ sung 1% rỉ đƣờng, hỗn hợp đƣợc khử trùng ƣớt ở 0,8 at trong thời gian 15 phút; - Cao lanh bổ sung 1% CaC03 để pH ở trạng thái kiềm nhẹ (pH 7,8), sau đó sấy khô hỗn hợp ở 1300C trong 60 phút để khử trùng và giảm độ ẩm của chất mang. -Thử nghiệm lựa chọn chất mang đƣợc tiến hành bằng cách phối trộn dịch lên men của mỗi chủng với cao lanh hoặc tinh bột theo tỉ lệ 1:10 trong các thùng vô trùng, rồi đem ủ trong buồng sinh trƣởng. Xác định mật độ tế bào sau thời gian 5 ngày lên men xốp. *Xác định tỉ lệ tiếp giống trong lên men xốp 56 Để xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp, dịch sinh khối các chủng vi sinh vật phối trộn với chất mang theo các tỷ lệ khác nhau: 5/100; 10/100; 15/100 và 20/100. Nuôi cấy vi sinh vật trên chất mang trong thùng vô trùng và ủ trong buồng sinh trƣởng. Xác định mật độ tế bào sau thời gian 5 ngày nhân nuôi. *Xác định thời gian nhân nuôi trong lên men xốp Thí nghiệm phối trộn dịch sinh khối của từng chủng với chất mang theo tỉ lệ 1:10 trong các thùng vô trùng, rồi đem ủ trong buồng sinh trƣởng. Xác định mật độ tế bào sau thời gian nhân nuôi 1-5 ngày. 2.3.7. Tạo chế phẩm và đánh giá chất lƣợng chế phẩm Chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy riêng rẽ trên chất mang dạng bột, sau thời gian nhân nuôi 2-4 ngày, phối trộn với nhau theo tỉ lệ 1:1:1. Xác định khả năng sống sót của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm ở điều kiện riêng lẻ và hỗn hợp bằng cách xác định mật độ tế bào sau thời gian 0, 7, 15, 30, 60 và 90 ngày bảo quản. 2.3.8. Phƣơng pháp xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi sinh vật (Xử lý gián đoạn) Sử dụng thùng chứa có dung tích 80 lít, cho lƣợng nƣớc thải nhất định vào thùng (2/3 thùng), đồng thời thả vòi sục khí vào để cấp khí. Bổ sung chế phẩm vi sinh vật. Xác định BOD, COD, Nts, Pts ban đầu và các ngày thí nghiệm tiếp theo. * Ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến hiệu suất xử lý Oxy đƣợc cung cấp bằng máy sục 1 vòi, với oxy hòa tan trong nƣớc khoảng 3,9±0,2 mg/l (tƣơng đƣơng với 0,5 lít không khí/lít nƣớc thải/phút) và máy sục 2 vòi, với oxy hòa tan trong nƣớc khoảng 6,0±0,3 mg/l (tƣơng đƣơng với 0,8 lít không khí/lít nƣớc thải/phút). Các điều kiện xử lý khác không thay đổi, Tính toán hiệu suất xử lý thông qua chỉ số COD với thời gian sục khí 0, 4, 6, 8 giờ. * Ảnh hƣởng của thời gian lƣu nƣớc thải đến hiệu suất xử lý Thí nghiệm thay đổi thời gian lƣu nƣớc từ 24, 36, 48, 60, 72 giờ; các điều kiện khác không thay đổi. Tính toán hiệu suất xử lý thông qua chỉ số COD với thời gian lƣu nƣớc khác nhau. * Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm bổ sung 57 Bổ sung chế phẩm vào nƣớc thải xử lý tƣơng ứng với hàm lƣợng 1, 10, 100 và 1000 g chế phẩm/m3 nƣớc thải để mật độ vi khuẩn đƣợc bổ sung là 102, 103, 104 và 105 CFU/ml. Các thông số khác không thay đổi. Xác định chỉ số COD ở công thức bổ sung chế phẩm khác nhau sau thời gian xử lý 3 ngày. 2.3.9. Đánh giá hiệu quả xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của chế phẩm vi sinh vật * Hiệu quả xử lý qui mô phòng thí nghiệm Hệ thống gồm 3 thùng: thùng chứa nƣớc thải (80 lít), thùng xử lý (200 lít) và thùng lắng (80 lít). Các thùng đƣợc nối với nhau bằng ống dẫn, có van điều chỉnh lƣu lƣợng nƣớc chảy. Đƣa nƣớc thải cần xử lý vào thùng xử lý (quy mô 200 lít có lắp thêm cánh khuấy). Điều chỉnh van cấp nƣớc từ thùng chứa đi vào thùng xử lý và từ thùng xử lý đi vào thùng lắng cho lƣu lƣợng bằng nhau, luôn đảm bảo thể tích nƣớc thải nhất định trong thùng xử lý và thời gian lƣu của nƣớc thải trong thùng xử lý là 36 giờ. Đƣa vòi cấp khí vào trong thùng xử lý, điều chỉnh lƣợng khí cấp cần thiết. -Hệ thống không bổ sung chế phẩm (đối chứng): cung cấp oxy để nƣớc thải đƣợc làm sạch nhờ hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc thải. -Hệ thống có bổ sung chế phẩm (thí nghiệm): cung cấp oxy để nƣớc thải đƣợc làm sạch nhờ hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc thải và vi sinh vật trong chế phẩm bổ sung vào. Bổ sung 100 g chế phẩm/m3 nƣớc thải tƣơng đƣơng mật độ 104 CFU/ml và cấp khí cƣỡng bức có khuấy trong thời gian 8 giờ trƣớc khi dẫn vào thùng lắng. Lƣợng khí cấp tƣơng đƣơng nồng độ oxy hòa tan 6 mg/lít nƣớc thải. Hai hệ thống hoạt động song song, chất lƣợng nƣớc thải đầu vào giống nhau, cùng điều kiện hoạt động và không cho bùn hoạt tính khởi động ban đầu. Phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng nƣớc thải ở đầu ra của hệ thống xử lý có chế phẩm và không có chế phẩm (phân tích, đánh giá các chỉ tiêu nƣớc thải theo phƣơng pháp ở phần 2.3.2). Hiệu quả xử lý (tính theo các chỉ tiêu BOD, COD, Nts, Pts) = hàm lƣợng các chỉ tiêu (mg/l) giảm đi/tổng hàm lƣợng các chỉ tiêu ban đầu x 100 (%). 58 * Hiệu quả xử lý tại nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình Thử nghiệm trên hệ thống xử lý nƣớc thải của nhà máy chế biến tinh bột sắn Elmaco Ninh bình có công suất 100 tấn tinh bột/ngày với lƣợng nƣớc thải trung bình là 1400-1500 m3/ngày. Nƣớc thải đƣợc xử lý thông qua hệ thống biogas, hệ thống bể sục và bể lắng đọng. Thí nghiệm sử dụng 100 g chế phẩm cho 1 m3 nƣớc thải ở công đoạn xử lý hiếu khí trong bể sục khí của nhà máy. Nƣớc thải của nhà máy sau xử lý biogas sẽ đƣợc bơm vào hệ thống xử lý hiếu khí. Chế phẩm vi sinh vật đƣợc bổ sung vào nƣớc thải tại bể sục khí của hệ thống. Trƣớc tiên nƣớc thải đƣợc bơm vào bể sục khí, thời gian chờ 2-3 ngày để hoạt hóa hệ vi sinh vật có trong nƣớc thải và khi lƣợng nƣớc trong bể xử lý đã tƣơng đối ổn định, thì bắt đầu bơm dịch chế phẩm MIC-CAS 02 đã đƣợc hoạt hóa và điều chỉnh nƣớc thải để phù hợp với lƣợng chế phẩm đã bơm vào bể. Thời gian lƣu nƣớc trong bể xử lý là 36 giờ. Phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng nƣớc thải trƣớc và sau xử lý bằng chế phẩm VSV (phân tích, đánh giá các chỉ tiêu nƣớc thải theo phƣơng pháp ở phần 2.3.2) Hiệu quả xử lý (tính theo các chỉ tiêu BOD, COD, Nts, Pts) = hàm lƣợng các chỉ tiêu (mg/l) giảm đi/tổng hàm lƣợng các chỉ tiêu ban đầu x 100 (%). 2.3.10. Kiểm tra sự sống sót của vi sinh vật bằng kỹ thuật DGGE -Nguyên tắc: Kỹ thuật DGGE hay điện di gel gradient biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis) cho phép phân biệt các trình tự ADN khác nhau dựa trên sự khác nhau về tỷ lệ (G+C)/(A+T) giữa các trình tự. Khi đƣợc điện di trên một gel có građien chất biến tính, tùy theo thành phần nucleotit mà một phân tử ADN sẽ dừng lại ở một vị trí nhất định đặc trƣng. Trong phân tử càng nhiều G và C thì phân tử càng lâu bị biến tính và do đó càng lâu dừng lại trên gel điện di. Vì vậy, vị trí khác nhau trên điện di đồ DGGE phản ánh sự khác nhau về trình tự của các đoạn ADN đƣợc phân tích. Trong từng trƣờng hợp cụ thể, mỗi vị trí có thể đặc trƣng cho một trình tự ADN và phản ánh sự có mặt của một loài hay cá thể trong quần xã đƣợc phân tích. -Tiến hành: 59 * Tách chiết ADN tổng số (Zhou J., Bruns M. A., Tiedje J. M., 1996) - Lấy bùn hoặc mẫu nƣớc vào ống falcon 50 ml. Ly tâm 5000 v/p trong 5 phút, loại nƣớc, lấy cặn. - Lấy 0,25 g cặn cho vào ống effendorf 2 ml. - Bổ sung 625 µl ADN đệm tách (100mM Tris-HCl pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 100mM Na-phosphat pH 8, 1.5M NaCl, 1% CTAB). - Bổ sung 50 µl lysozym (14,2 mg/ml). Trộn đều, ủ ở 370C trong 30 phút. - Thêm 50 µl proteaza K (10 mg/ml) để phân hủy proteinase. Trộn đều và ủ ở 370C trong 30 phút. - Bổ sung 75 µl SDS 20% và ủ ở 650C trong 2 giờ. - Bổ sung 600 µl hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1). Trộn đều và ủ ở 650C trong 20 phút. - Trộn đều và ly tâm ở 10.000 v/p trong 10 phút. Chuyển dịch nổi trên cùng sang effendorf mới. - Thêm Rnase A 100 µg/ml vào dịch để đạt nồng độ 10 µg/ml để loại bỏ ARN. Ủ ở 37 0C trong 30 phút. - Bổ sung hỗn hợp chloroform:isoamylalcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1. Trộn đều, ly tâm ở 10.000 v/p, 10 phút. Chuyển dịch nổi trên cùng sang effendorf mới. - Kết tủa ADN bằng cách bổ sung 0,6 thể tích isopropanol và để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó ly tâm ở 10.000 v/p trong 20 phút, loại bỏ dịch nổi. Rửa phần tủa bằng ethano l70% lạnh. Làm khô và hòa tan trong 30 µl TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA). * Điện di ADN trên gel agarose (Quyền Đình Thi, 2005) Việc phân ly dựa trên độ lớn và hình thái các chất trong điện trƣờng, do tích điện âm nên các phân tử ADN dịch chuyển về phía anode (cực dƣơng) với tốc độ tỷ lệ nghịch với khối lƣợng phân tử. Vì vậy các đoạn ADN càng lớn thì dịch chuyển càng chậm, sau một khoảng thời gian di chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân tử có kích thƣớc khác nhau sẽ tách xa vị trí bắt đầu di chuyển những khoảng khác nhau. Do đó, chúng đƣợc tách nhau ra. Quy trình (cho gel agarose 1%) nhƣ sau: 60 - Cân 1g agarose cho vào 100 ml TAE 1X và đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45-500C rồi đổ vào khuôn gel đã đƣợc chuẩn bị sẵn. Sau 20-30 phút, khi gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm. - Tra mẫu: ADN đƣợc trộn với đệm mẫu 6X và tra vào các giếng trên gel. - Chạy điện di: chế độ chạy 100 V và 90 mA. - Nhuộm gel: trong dung dịch EtBr 0,5 µg/ml trong 5-10 phút, rửa lại bằng nƣớc trƣớc khi soi gel. - Quan sát: gel soi dƣới ánh đèn tử ngoại, ADN sẽ đƣợc phát sáng nhờ liên kết với EtBr. * Khuếch đại một đoạn ADN bằng phản ứng PCR (Muyzer G. và cs, 1993) Thành phần phản ứng (µl) H2O đủ tới 25 l Đệm 10x 2,5 Mg 2+ 2,5 dNTP 2,5 BSA 0,5 Mồi GM5F-GC Mồi 907R 0,5 0,5 Mẫu ADN template 1 ng Taq polymerase 0,2 Chu trình nhiệt: Taq polymerase đƣợc đƣa vào phản ứng ở nhiệt độ 800C (sau bƣớc biến tính đầu tiên). Nhiệt độ gắn mồi đƣợc đặt cao hơn 100C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 650C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,50C cho tới khi đạt tới 550C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ nữa. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút. Chu kỳ cuối thực hiện ở 720C trong 5 phút. Kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuống 40C. 61 * Điện di trên gel gradient biến tính DGGE (Muyzer G. và cs, 1993) Sản phẩm PCR đƣợc tra vào gel polyacrylamide 6% trong dung dịch TAE 1X (20 mM Tris, 10mM acetate, 0,5 mM EDTA-pH 7,4). Gel polyacrylamide đƣợc làm trong vùng gradient nồng độ các chất biến tính với dải biến tính urea formanide từ 20-70%. Quá trình điện di đƣợc thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (Biorad). Quá trình điện di DGGE đƣợc tiến hành ở 600C, 200V, trong 3,5 giờ. Sau khi kết thúc điện di, gel DGGE đƣợc nhuộm trong ethidium bromide sau 20 phút và chụp ảnh trên ánh sáng đèn tử ngoại. 2.3.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Excel, phân tích phƣơng sai (ANOVA) để tính sự khác biệt có ý nghĩa, vẽ đồ thị. 62 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hiện trạng nƣớc thải nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình. Khảo sát nhà máy chế biến tinh bột sắn thuộc công ty TNHH MTV Elmaco, địa chỉ xã Sơn Lai, huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình cho thấy nhà máy có dây chuyền thiết bị sản xuất nhập khẩu từ Thái Lan, sử dụng 350-400 tấn sắn củ/ngày để sản xuất 100 tấn tinh bột sắn/ngày. Nhà máy đi vào hoạt động từ năm 2004. Thời gian sản xuất từ tháng 10 năm trƣớc đến tháng 3, 4 năm sau, trung bình 6-7 tháng/năm. Theo thiết kế, mỗi ngày nhà máy sử dụng 1200-1400 m3 nƣớc cho quá trình chế biến tinh bột sắn, trên thực tế lƣợng nƣớc sử dụng khoảng 700-800 m 3/ngày. Hiện tại, nhà máy đang áp dụng hai công nghệ xử lý nƣớc thải, gồm hệ thống xử lý kị khí (bể biogas) và hệ thống xử lý hiếu khí (bể sục khí). Sơ đồ hệ thống xử lý nƣớc thải của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở hình 3.1. Hình 3.1. Sơ đồ hệ thống xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình Nƣớc thải chế biến tinh bột sắn gồm 90% từ dây chuyền sản xuất tinh bột sắn, và 10% từ việc rửa sàng, thiết bị, nƣớc sinh hoạt của nhà máy. Toàn bộ nƣớc thải đƣợc dẫn tới hệ thống xử lý kị khí gồm 5 bể biogas với qui mô 9.000-32.500 Xả thải Hệ thống hiếu khí (5 bể sục khí) Hệ thống kỵ khí (5 bể biogas) Nƣớc thải Bể lắng Bể lọc Bể lọc 63 m 3/bể. Tại các bể biogas diễn ra quá trình phân giải chất hữu cơ, tạo ra khí biogas phục vụ cho nhu cầu của nhà máy. Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ trong bể biogas đƣợc thực hiện trong thời gian 3-4 tháng. Sau quá trình xử lý kị khí, nƣớc thải đƣợc bơm vào hệ thống xử lý hiếu khí là các bể sục khí dung tích 150 m3/bể ứng với 5 bể biogas. Thời gian sục khí là 6 giờ, tiếp đó nƣớc thải đƣợc dẫn tới bể lắng. Tại bể lắng với sự trợ giúp của chất trợ lắng là phèn hoặc C525, các hợp chất lơ lửng của nƣớc thải đƣợc làm lắng và nƣớc trong đƣợc thiết kế chảy tràn sang bể lọc cơ học với vật liệu lọc là cát. Cuối cùng, nƣớc thải đƣợc thu hồi dẫn tới hồ chứa nƣớc và xả thải ra môi trƣờng. Bảng 3.1. Hiện trạng nƣớc nƣớc thải chế biến tinh bột sắn trƣớc và sau xử lý kỵ khí tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, năm 2012 TT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả phân tích Hiệu quả Biogas (%) QCVN 40:2011/ BTNMT (cột B) Trƣớc Biogas Sau biogas 1 BOD5 mg/l 7232 423,3 94,1 50 2 COD mg/l 13610 651,3 95,2 150 3 TSS mg/l 1226 153,7 87,5 100 4 Nts mg/l 135,8 98,0 27,9 40 5 N-NH4 - mg/l 52,13 10 6 N-NO2 - mg/l 64,85 - 7 N-NO3 - mg/l 0,99 - 8 Pts mg/l 25,4 17,8 29,6 6 9 Sufua mg/l 0,32 0,047 0,5 10 Xyanua(CN - ) mg/l < 0,01 < 0,01 0,1 11 pH 5,6 7,6 5,5-9 12 Tinh bột mg/l 5600 90 98,4 - 13 Coliform Vi khuẩn /100ml Kph Kph 5000 Ghi chú: (-) không quy định; Kph: không phát hiện ở nồng độ pha loãng 10-1 64 Kết quả khảo sát chất lƣợng nƣớc thải của từng công đoạn chế biến tinh bột sắn tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình vào mùa cao điểm sản xuất tinh bột sắn đƣợc tổng hợp trong bảng 3.1, cho thấy các chỉ tiêu BOD5, COD, chất rắn lơ lửng, Nts, Pts trong nƣớc thải sau quá trình sản xuất tinh bột sắn (trƣớc biogas) vƣợt rất nhiều lần so với qui chuẩn Việt Nam (QCVN) 40:2011/BTNMT. Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Trung tâm Sản xuất sạch Việt Nam năm 2010. Hiệu quả tích cực về môi trƣờng của hệ thống biogas là không thể phủ nhận, tuy nhiên các bể biogas tại các cơ sở chế biến tinh bột sắn do không đáp ứng đầu vào, cơ chế vận hành chƣa tốt, cũng nhƣ điều kiện thời tiết mà hệ thống biogas chƣa phải là hệ thống xử lý sau cùng để đảm bảo đủ điều kiện xả thải an toàn vào môi trƣờng (Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu, 2012). Mặc dù nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình đã đƣợc xử lý bằng hệ thống biogas, song chất lƣợng nƣớc thải sau biogas vẫn không đảm bảo yêu cầu đối với nƣớc thải cột B theo QCVN 40:2011/BTNMT. Số liệu bảng 3.1 cho thấy các chỉ số BOD, COD, tổng chất rắn lơ lửng (TSS), hàm lƣợng Nts, Pts giảm đi rất nhiều so với nƣớc thải chƣa xử lý (COD giảm 94,1%, BOD5 giảm 95,2%, TSS giảm 87,5%, tinh bột giảm 98,4%, Nts giảm 27,9%, Pts giảm 29,6%) nhƣng vẫn vƣợt quá giới hạn cho phép. Kết quả khảo sát cũng xác định hàm lƣợng xyanua trong nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn trƣớc và sau xử lý kỵ khí tại công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình đều dƣới ngƣỡng cho phép, đảm bảo yêu cầu xả thải ra môi trƣờng. Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Tôn, Lại Thị Cúc, Nguyễn Văn Duy (2008) và kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu (2012). Theo báo cáo của Vũ Đình Tôn, Lại Thị Cúc, Nguyễn Văn Duy việc xử lý chất thải bằng hệ thống hầm biogas của một số trang trại ở đồng bằng sông Hồng cho thấy nồng độ BOD5 trong nƣớc thải ở chuồng lợn nái giảm 75-80,8%, nồng độ COD giảm 66,85%, Nts giảm 10,1-27,46%. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu về đánh giá hiệu quả xử lý 65 nƣớc thải chăn nuôi lợn bằng hầm biogas qui mô hộ gia đình ở Thừa Thiên Huế cho thấy COD giảm 84,7%, BOD5 giảm 76,3%, chất rắn lơ lửng giảm 86,1%, Nts giảm 11,8% và Pts giảm 7,0%. Có sự chênh lệch về kết quả phân tích là do khác nhau về đối tƣợng và qui mô hệ thống xử lý biogas. Để đáp ứng tiêu chuẩn xả thải ra môi trƣờng, công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình đã đầu tƣ xây dựng hệ thống xử lý nƣớc thải hiếu khí và hệ thống tách lọc bùn lắng, song kết quả xử lý vẫn chƣa ổn định. Tại thời điểm khảo sát năm 2012, chất lƣợng nƣớc thải sau xử lý hiếu khí vẫn cón một số chỉ tiêu vƣợt giới hạn cho phép (bảng 3.2). Với sự trợ giúp của phèn hoặc C525, các chất rắn lơ lửng đã đƣợc kết tủa và tách lọc ra khỏi nƣớc thả