Luận án Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)

u trên cũng phù hợp với kết quả xử lý trên giống cẩm chướng Trắng viền tím, Đỏ (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2019c). 3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Cocho cây hoa cẩm chướng in vitro 3.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng Để xác định mức độ ảnh hưởng của nồng độ EMS và liều lượng chiếu xạ đến khả năng sống, khả năng phát sinh chồi của các mẫu được xử lý, chúng tôi tiến hành xử lý EMS với các nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% kết hợp chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với mức hấp thu 10, 20, 30 Gγ. Sau 5 tuần nuôi cấy đo đếm các chỉ tiêu (bảng 3.14). Kết quả thí nghiệm cho thấy liều lượng xử lý có ảnh hưởng rất rõ đến khả năng sống và phát sinh chồi của các mẫu xử lý. Khi tăng liều xử lý lên thì tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần. Trong các công thức thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao nhất tại công thức CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công 81 thức CT12 (Tỷ lệ mẫu sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%). Số liệu cho thấy sự thay đổi liều lượng xử lý gamma nguồn 60Co có ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu chết lớn hơn sự thay đổi nồng độ EMS. Số liệu về chiều cao, số lá của chồi ở các công thức cho thấy, tác nhân gây đột biến không những ảnh hưởng đến khả năng sống, khả năng phát sinh chồi mà còn ảnh hưởng rất đến sự sinh trưởng phát triển của chồi. Khi tăng liều lượng xử lý EMS hoặc gamma thì chiều cao, số lá của chồi giảm. Ở các công thức xử lý liều cao, lóng của chồi ngắn hơn khi xử lý liều thấp. Bảng 3.14. Ảnh hưởng của liều lượng xử lý EMS và tia gamma nguồn 60Co đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi (sau 5 tuần nuôi cấy) Công thức Nồng độ EMS (%) Liều hấp thụ (Gγ) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (%) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá/chồi) ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 0 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 95,33 87,33 80,67 72,00 80,00 73,33 52,00 74,67 54,67 32,67 68,67 42,67 24,67 100,0 89,33 86,67 78,00 88,00 86,67 69,33 84,00 77,33 66,67 76,00 68,67 60,00 4,15 3,75 3,62 3,54 3,60 3,51 3,60 3,53 3,52 3,09 2,91 2,32 2,04 5,03 4,89 4,37 4,20 4,76 4,24 4,07 4,59 4,06 3,90 4,25 3,73 3,56 CV% LSD0,05 2,50 0,14 1,70 0,12 82 3.2.3.2. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính của tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sau xử lý chúng tôi đã phân lập 8 dạng chồi (hình 3.9): - Dạng A: Chồi phát triển bình thường. - Dạng F: Chồi sinh trưởng phát triển kém, thân lá màu vàng. - Dạng G: Chồi sinh trưởng phát triển mạnh, thân mập, lá màu xanh đậm, thân lá cứng. - Dạng L: Chồi mập, màu xanh đậm, các lá to, dầy, lá phần ngọn cuộn lại tạo hình ống. - Dạng M: Chồi bị thủy tinh hóa, thân lá mọng nước. - Dạng N: Chồi có khả năng đẻ nhánh mạnh, từ các đốt thân có rất nhiều chồi tạo như hình bông hoa, lá ngắn, thân lá màu xanh đậm. - Dạng O: Chồi thân nhỏ, mềm, lá ngắn mầu xanh vàng, tạo từng thành cụm. - Dạng P: Chồi có khả năng phát sinh chồi mạnh, lá to bản, dầy, các lá dính lại với nhau ở phần cuống lá. Số liệu cho thấy sự phân bố của các dạng chồi ở các công thức thí nghiệm không giống nhau. Ở đối chứng chỉ xuất hiện 2 dạng chồi là chồi dạng A và dạng chồi M. Sự biến động về số dạng chồi biến dị cũng có xu hướng tương tự như khi xử lý riêng rẽ EMS hoặc chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co. Khi tăng liều xử lý thì tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng tăng lên, tuy nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm ở các công thức xử lý với liều lượng cao. Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả năng sinh trưởng phát triển tốt) chỉ xuất hiện ở công thức CT4 đến CT10. Công thức CT5 (xử lý 0,2% EMS kết hợp chiếu xạ gamma nguồn 60Co ở liều hấp thu 20 Gγ) xuất hiện nhiều dạng chồi, trong đó dạng chồi tiềm năng có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%). Xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co xuất hiện nhiều dạng chồi biến dị hơn hơn so với xử lý riêng rẽ hai tác nhân này (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009a, 2009b, 2011b). 83 Dạng A Dạng F Dạng G Dạng L Dạng M Dạng N Dạng O Dạng P Hình 3.9. Các dạng chồi thu được sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co 84 Bảng 3.15. Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi in vitro sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co (sau 4 tuần nuôi cấy) Công thức Nồng độ EMS(%) Liều hấp thụ gamma (Gγ) Dạng A (%) Dạng F (%) Dạng G (%) Dạng L (%) Dạng M (%) Dạng N (%) Dạng O (%) Dạng P (%) Tỷ lệ chồi biến dị (%) ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 0,0 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,0 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 95,92 86,79 79,65 71,26 72,66 57,50 37,89 45,96 34,34 29,49 39,62 28,90 27,77 0,00 4,73 5,33 11,63 8,48 7,98 18,40 13,27 15,48 18,49 16,36 25,52 27,87 0,00 0,00 0,00 0,00 3,26 9,12 6,90 6,60 7,16 5,44 4,36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4,78 6,54 7,38 7,82 8,96 4,08 8,50 10,18 10,95 8,36 11,30 13,80 11,18 11,13 12,04 12,26 15,65 18,15 0,00 0,00 4,84 6,17 7,26 8,72 9,20 11,18 11,45 12,04 11,12 7,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,90 2,49 6,26 6,02 0,00 3,91 8,62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,37 6,90 9,32 9,39 9,95 8,90 10,36 8,62 4,08 13.21 20,35 28,74 27,34 42,50 62,11 54,04 65,66 70,51 60,38 71,10 72,23 8 4 4 85 3.3. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in vitro 3.3.1. Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý Các chồi được xử lý bằng tác nhân gây tạo đột biến được sàng lọc và nhân qua 5 thế hệ (M1V5) sau đó được cấy chuyển sang môi trường ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh (môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α- NAA). Kết quả sau 4 tuần theo dõi số liệu được ghi tại bảng 3.16. Bảng 3.16. Khả năng ra rễ của chồi in vitro sau xử lý (sau 4 tuần) Dạng chồi Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Thời gian xuất hiện (ngày) Chiều cao cây (cm) Số rễ (rễ/cây) Chiều dài rễ (cm) Dạng A 98,89 8,04 4,82 6,93 3,01 Dạng B 88,89 9,0 4,72 6,44 1,87 Dạng C 37,78 15,0 1,52 0,78 0,58 Dạng D 83,33 11,0 3,76 6,21 1,41 Dạng E 76,67 12,0 3,45 5,76 1,36 Dạng F 85,56 10,95 3,64 5,02 2,17 Dạng G 100,0 7,28 5,14 7,27 3,22 Dạng H 88,89 9,31 4,72 6,44 2,74 Dạng I 0,00 - - - - Dạng K 46,67 12,36 2,45 3,76 1,23 Dạng L 87,22 8,71 2,99 5,55 2,34 Dạng M 0,00 - - - - Dạng N 83,33 11,24 3,67 4,16 1,95 Dạng O 68,89 9,07 2,66 3,96 1,79 Dạng P 72,22 13,19 2,55 4,85 1,89 CV% 3,00 3,70 2,60 3,20 LSD0,05 0,52 0,22 0,23 0,11 86 Tỷ lệ chồi tạo rễ của các dạng chồi có sự khác nhau, cao nhất là dạng chồi G (100%), thấp nhất là dạng chồi C (37,78%). Tỷ lệ chồi tạo rễ của các dạng chồi B, C, D, E, F, H, K, L, N, O, P đều thấp hơn rất nhiều so với chồi bình thường (dạng chồi A), đặc biệt dạng chồi I và dạng chồi M không có khả năng sống khi cấy sang môi trường ra rễ. Các dạng chồi có khả năng sinh trưởng thân lá tốt thường có khả năng ra rễ tốt, số rễ trung bình của chồi G cao nhất đạt (7,27 rễ/chồi), thấp nhất là chồi C (0,78 rễ/chồi). Trong môi trường ra rễ, trừ dạng chồi G, các dạng chồi biến dị khác ra rễ muộn hơn rất nhiều so với dạng A. Khả năng ra rễ của các dạng đột biến có sự khác nhau. Chồi dạng B bắt đầu xuất hiện rễ sau 9 ngày, chồi dạng D bắt đầu xuất hiện rễ sau 11 ngày, dạng chồi E bắt đầu xuất hiện rễ sau 12 ngày và muộn nhất là chồi dạng C bắt đầu xuất hiện rễ sau 15 ngày, trong khi đó chồi dạng A chỉ sau 8 ngày đã xuất hiện rễ. Trừ dạng chồi G, các chồi đột biến không những xuất hiện rễ chậm, số rễ/chồi thấp mà chiều dài của rễ cũng ngắn hơn nhiều so với chồi bình thường. 3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh Để đánh giá khả năng sống và sinh trưởng của các dạng chồi phân lập lập được sau khi tạo cây hoàn chỉnh chúng tôi đã đưa cây ra ngoài vườn ươm và trồng bằng kỹ thuật khí canh. Dựa trên kết quả nghiên cứu của tác giả đã công bố (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010) trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng dung dịch Anthura nồng độ bằng ¾ dung dịch chuẩn với chế chu kỳ phun dinh dưỡng 15 phút 1 lần, mỗi lần 15 giây. Sau 2 tuần đo đếm các chỉ tiêu (bảng 3.17). Sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi rất khác nhau, các dạng chồi biến dị có khả năng sống và sinh trưởng thân lá thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi bình thường. Tỷ lệ sống của các dạng chồi rất khác nhau, cao nhất là chồi dạng G (100%) sau đó là chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K,. Chồi dạng C, K có khả năng sống rất thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%). Chồi dạng I, M, O không có khả năng sống ngay cả trong điều kiện vườn ươm. Một trong những nguyên nhân 87 chính là do số lượng rễ được tạo ra trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh của chồi dạng I, M, O, C, K rất thấp. Bảng 3.17. Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong điều kiện khí canh (sau 2 tuần) Dạng chồi Tỷ lệ cây sống (%) Chiều cao cây (cm) Số lá (lá/cây) Chất lượng Dạng A 98,89 5,61 7,06 +++ Dạng B 93,33 4,55 4,32 +++ Dạng C 3,33 3,37 3,27 + Dạng D 82,22 4,32 4,62 ++ Dạng E 76,67 4,03 4,01 ++ Dạng F 62,22 4,14 5,67 ++ Dạng G 100,0 6,42 7,37 +++ Dạng H 83,33 4,55 4,32 ++ Dạng K 13,33 2,03 3,26 + Dạng L 80,00 3,67 4,90 ++ Dạng N 65,56 4,19 4,22 ++ Dạng O 0,00 - - - Dạng P 45,56 3,25 5,16 ++ CV% 5,30 2,50 LSD0,05 0,33 0,21 Ghi chú: +++: Tốt (cây mập, lá xanh thẫm); ++: Trung bình (cây nhỏ, lá trung bình, màu xanh nhạt); +: Cây sinh trưởng phát triển kém (thân, lá nhỏ, mầu vàng). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi có khả năng sống trong điều kiện vườn ươm cũng có sự tương đồng với giai 88 đoạn tạo rễ. Những dạng chồi có tỷ lệ sống cao cũng là những dạng chồi sinh trưởng phát triển tốt. Như vậy khi sử dụng phương pháp gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro cho cây hoa cẩm chướng những dạng chồi có khả năng sinh trưởng phát triển, khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh kém ở giai đoạn nuôi cấy in vitro (như dạng I, M, O, C) chúng ta có thể loại ngay từ giai đoạn nuôi cấy in vitro. 3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Cây in vitro hoàn chỉnh đã được thích ứng với điều kiện tự nhiện bằng kỹ thuật khí canh được chuyển ra trồng trong nhà lưới có mái che. Sau 5 tuần theo dõi đo đếm số liệu (bảng 3.18). Bảng 3.18 Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong điều kiện ngoài đồng ruộng (sau 5 tuần) Dạng chồi Tỷ lệ cây sống (%) Chiều caoTB (cm) Số lá (lá/cây) Dạng A 89,67 12.28 10,65 Dạng B 78,33 11,83 10,57 Dạng C 0,00 - - Dạng D 62,67 11,86 10,63 Dạng E 55,22 10,67 10,27 Dạng F 41,33 10,69 10,09 Dạng G 96,67 14.83 12,91 Dạng H 63,78 10,01 9,54 Dạng K 0,00 - - Dạng L 45,33 9,75 9,13 Dạng N 65,67 10,33 9,67 Dạng P 0,00 - - CV% 2,20 2,80 LSD0,05 0,17 0,20 89 Sự sinh trưởng của các dạng chồi trong điều kiện đồng ruộng có sự khác nhau. Qua theo dõi cho thấy hầu hết các dạng chồi có khả năng thích ứng trong điều kiện vườn ươm kém (dạng C, K, P) đều bị chết sau khi trồng ra ngoài ruộng 1 tuần. Khả năng sống và sinh trưởng của các dạng chồi ở giai đoạn ngoài đồng ruộng cũng có sự tương đồng với giai đoạn trong phòng thí nghiệm và giai đoạn khí canh. Các dạng chồi sinh trưởng tốt ở giai đoạn nuôi cấy in vitro và khí canh khi đưa ra trồng ngoài đồng ruộng cũng sinh trưởng phát triển tốt hơn. Cụ thể dạng chồi G, A có khả năng sinh trưởng phát triển tương đối tốt, tỷ lệ sống cao đạt trên 80%, thân lá phát triển tốt. Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp (đạt từ 41,33 đến 65,67%). Điều này chứng tỏ sự tác động của tác nhân gây đột biến không những làm biến đổi về mặt hình thái mà còn ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng ở giai đoạn ngoài đồng ruộng. 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng Để đánh giá hiệu quả của sự tác động của các tác nhân gây đột biến chúng tôi đã tiến hành phân lập các dạng biến dị về mặt hình thái và khả năng sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng. Qua theo dõi chúng tôi đã phân lập được một số dạng biến dị về thời gian sinh trưởng, hình thái lá và màu sắc hoa và được phân thanh 3 nhóm (hình 3.10; 3.11) như sau: Nhóm 1: Biến dị về hình thái lá: lá xẻ thùy, lá hình ống. Nhóm 2: Chồi nách phát triển. Nhóm 3: Biến dị về màu sắc hoa, gồm 7 dạng: H1: Hoa màu tím. H2: Hoa màu phấn hồng viền tím. H3: Hoa màu trắng viền đỏ. H4: Hoa màu trắng sọc tím. H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, một số cánh hoa không có viền tím. 90 H6: Hoa trắng viền phấn hồng. H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm. Tỷ lệ các dạng biến dị ở các công thức xử lý khác nhau được ghi tại bảng 3.19, 3.20 và 3.21. Đối chứng Lá hình ống Đầu lá cuộn Chồi nách phát triển Hình 3.10. Một số dạng biến dị về hình thái thân lá 91 Đối chứng H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Hình 3.11. Hình ảnh một số dạng biến dị về màu sắc hoa 92 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của xử lý EMS đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Công thức Nồng độ EMS (%) Thời gian xử lý (giờ) Biến dị phát sinh (%) Hình thái lá Chồi nách phát triển Màu sắc hoa Tổng số Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 ĐC 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00 CT1 0,2 1 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,00 CT2 0,4 1 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 5,34 CT3 0,6 1 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 3,33 0,0 0,0 0,0 6,00 CT4 0,8 1 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 3,33 0,0 0,0 8,67 CT5 1,0 1 3,33 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 9,34 CT6 0,2 2 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,0 4,67 CT7 0,4 2 2,0 0,0 2,67 4,0 1,33 0,0 5,33 2,0 0,0 3,33 18,66 CT8 0,6 2 2,67 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 3,33 4,0 0,0 0,0 15,34 CT9 0,8 2 2,67 0,0 3,33 0,0 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 11,34 CT10 1,0 2 4,67 3,33 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 12,0 CT11 0,2 3 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 8,01 CT12 0,4 3 0,0 0,0 3,33 3,33 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 12,00 CT13 0,6 3 3,33 2,67 3,33 2,67 0,0 0,0 1,33 2,67 0,0 0,0 16,00 CT14 0,8 3 4,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,67 0,0 0,0 14,67 CT15 1,0 3 4,0 5,33 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,67 0,0 0,0 13,79 9 2 93 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của xử lý tian gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Công thức Liều hấp thụ (Gᵧ) Biến dị phát sinh (%) Hình thái lá Chồi nách phát triển Màu sắc hoa Tổng số Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 ĐC 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00 CT1 10 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 CT2 20 2,0 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,33 3,33 0,0 0,0 10,66 CT3 30 4,67 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 4,67 4,0 0,67 0,0 16,67 CT4 40 2,67 3,33 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 3,33 0,0 0,0 12,00 CT5 50 2,67 3,33 0,0 0,0 0,0 0,0 3,33 4,67 0,0 0,0 14,00 CT6 60 2,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 5,33 0,0 0,0 13,33 CT7 70 - - - - - - - - - - - 9 3 94 Bảng 3.21. Tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co giai đoạn ngoài đồng ruộng Công thức Nồng độ EMS (%) Liều hấp thụ (Gᵧ) Biến dị phát sinh (%) Hình thái lá Chồi nách phát triển Màu sắc hoa Tổng số Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 ĐC 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 CT1 0,1 10 1,33 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 0,0 4,00 CT2 0,1 20 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 2,0 0,0 0,0 6,67 CT3 0,1 30 2,67 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 10,67 CT4 0,2 10 3,33 2,0 1,33 1,33 0,0 0,0 4,0 3,33 0,0 0,0 15,33 CT5 0,2 20 3,33 2,0 2,67 4,0 0,0 0,0 5,33 5,33 0,0 2,0 24,66 CT6 0,2 30 3,33 5,33 0,0 3,33 0,0 1,33 4,67 3,33 0,0 0,0 21,32 CT7 0,3 10 5,33 4,67 0,67 2,67 0,0 0,0 2,0 6,0 0,0 0,0 21,34 CT8 0,3 20 6,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 6,0 0,0 0,0 18,67 CT9 0,3 30 4,0 3,33 3,33 2,67 0,0 0,0 3,33 4,67 0,0 0,0 21,33 CT10 0,4 10 4,67 5,33 0,0 2,67 0,0 0,0 4,0 5,33 0,0 0,0 22,01 CT11 0,4 20 4,0 4,0 2,67 1,33 0,0 0,0 2,67 6,0 0,0 0,0 20,66 CT12 0,4 30 6,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,67 8,0 0,0 0,0 18,67 9 4 95 Bảng 3.22. Tỷ lệ biến dị của các dạng chồi cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Dạng chồi Biến dị phát sinh (%) Hình thái lá Chồi nách phát triển Màu sắc hoa (%) Tổng số (%) Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 A 0,85 0,46 0,20 0,85 0,19 0,04 1,17 0,50 0,02 0,15 4,43 B 0,44 0,33 0,00 0,07 0,00 0,00 0,26 0,70 0,00 0,00 2,06 D 0,00 0,06 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,09 E 0,00 0,00 0,46 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,63 F 0,00 0,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,35 1,74 0,00 0,00 3,04 G 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00 0,00 0,00 0,20 H 0,24 0,24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,17 0,00 0,00 0,00 0,65 L 1,07 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,07 N 0,00 0,24 0,17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,24 0,00 0,00 0,00 9 5 96 3.4.1. Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng Khi xử lý EMS xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị về hình thái thân lá, chồi nách phát triển và mầu sắc hoa), trong đó có 5 dạng biến dị về màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không xuất hiện khi xử lý EMS. Ở các công thức thí nghiệm số cây biến dị tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian xử lý EMS. Tuy nhiên ở các công thức xử lý nồng độ cao và thời gian dài, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về mầu sắc hoa tăng chủ yếu ở dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Trong các công thức thí nghiệm công thức CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4% trong thời gian 2 giờ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất (15,99%). Đặc biệt dạng hoa H7 chỉ xuất hiện ở công thức này. 3.4.2. Ảnh hưởng của xử lý tia gamma nguồn 60Cođến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Khi xử lý tia gamma nguồn 60Co xuất hiện 2 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá và biến dị về màu sắc hoa), biến dị khả năng phát triển chồi nách mạnh không xuất hiện. Trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 3 dạng (H4, H5, H6), dạng H1, H2, H3 và H7 không xuất hiện khi xử lý tia gamma nguồn 60Co riêng rẽ. Ở các công thức thí nghiệm số cây biến dị tỷ có xu hướng tăng khi tăng liều lượng xử lý từ 10 - 30 Gγ sau đó lại giảm nếu tiếp tục tăng liều lượng xử lý. Tương tự như khi xử lý bằng EMS ở các công thức xử lý liều lượng cao, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về hoa tăng chủ yếu ở dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Tỷ lệ biến dị về mầu sắc hoa thu đươc khi xử lý tia gamma nguồn 60Co thấp hơn so với xử lý bằng EMS. Trong các công thức thí nghiệm công thức CT3 (xử lý liều 30 Gγ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất (9,34%). Đặc biệt là dạng hoa H6 chỉ xuất hiện ở công thức này. 3.4.3. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Cođến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Kết quả nghiên cứu cho thấy việc xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma nguồn 60Co đã làm tăng tỷ lệ biến dị lên rất nhiều so với xử lý riêng rẽ EMS hoặc gamma. Tỷ lệ biến dị đạt cao nhất tại công thức CT5 (24,66%) và thấp nhất tại 97 công thức CT1 (4,0%). Xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma nguồn 60Co cho kết quả xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá, biến dị về phát triển chồi nách và biến dị về màu sắc hoa). Tuy nhiên, trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 5 dạng (H1, H3, H4, H5 và H7), dạng H2 và H6 không xuất hiện. Ở các công thức thí nghiệm số cây biến dị tỷ có xu hướng tăng khi tăng liều lượng xử lý. Tương tự như khi xử lý riêng rẽ bằng EMS hoặc chiếu xạ gamma nguồn 60Co, ở các công thức xử lý chiếu xạ liều lượng cao, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về hoa tăng chủ yếu ở dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Sự tác động kết hợp giữa EMS và tia gamma nguồn 60Co đã làm xuất hiện thêm một dạng biến dị về mầu sắc hoa mới (dạng H3) so với xử lý riêng rẽ từng tác nhân. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện các dạng biến dị về mầu sắc hoa ở các công thức thí nghiệm cũng có sự tương đồng với giai đoạn nuôi cấy in vitro. Công thức thí nghiệm cho hiệu quả cao ở giai đoạn nuôi cấy in vitro cũng là công thức cho hiệu quả cao ở giai đoạn ngoài đồng ruộng. Để tìm hiểu mối quan hệ giữa các dạng chồi biến dị phân lập được sau xử lý ở giai đoạn nuôi cấy in vitro và các dạng biến dị sau xử lý ở giai đoạn ngoài đồng ruộng chúng tôi đã theo dõi và phân lập các dạng biến dị từ các dạng chồi này, kết quả được ghi tại bảng 3.22. Kết quả cho thấy, các dạng biến dị về màu sắc tập chung chủ yếu ở dạng chồi A (dạng chồi bình thường), một số ít xuất hiện ở dạng chồi B, F, G, H. Dạng biến dị H5 chiếm tỷ lệ cao ở dạng chồi F (dạng chồi sinh trưởng phát triển kém). Các dạng chồi D, E, L chỉ xuất hiện các biến dị về hình thái lá và khả năng phát triển chồi nách mạnh. 3.4.4. Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Về đặc điểm hình thái của một số dạng biến dị về màu sắc hoa ở các chỉ tiêu khác nhau có sự khác nhau. 98 Về chiều cao cây: Chiều cao cây của các dạng H1, H3, H4, H6, H7 và dạng đối chứng tương đối đồng đều. Dạng H5 có chiều cao cây trung bình thấp hơn (98 ± 9,23 cm) thân lá nhỏ. Qua theo dõi cho thấy trong các giai đoạn phát triển khác nhau, các cá thể trong các dòng đột biến có tốc độ tăng trưởng tương tự nhau. Trong giai đoạn chuyển sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực, các dòng bắt đầu có tốc độ phát triển khác nhau dẫn đến chiều cao trung bình của các dòng bắt đầu có sự thay đổi. Sự thay đổi chiều cao này liên quan trực tiếp đến các cá thể có quá trình chuyển biến từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Số cặp lá trên thân giữa các dạng biến dị và đối chứng không có sự khác biệt nhiều, số cặp lá dao động từ 31 đến 37 cặp lá, cao nhất là dạng H2 (37 cặp lá), thấp nhất là dạng H6 (31 cặp lá). Hình dạng lá của các dòng đột biến không có sự khác biệt so với đối chứng (hình elip). Về kích thước hoa khi nở dao động từ 5,2 đến 7,1 cm. Dạng H2, H3, H4 có kích thước lớn hơn dạng đối chứng và các dạng còn lại. Về cấu trúc cánh hoa có sự khác biệt: Bề mặt cánh hoa dạng đối chứng, H4 và H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề mặt cánh hoa phẳng; Rìa cánh hoa dạng H2 và dạng H7 có sự khác biệt so với đối chứng và các dạng còn lại (rìa cánh hoa răng cưa nhẹ, nông). Độ rộng của cánh hoa ngoài cùng của các dạng đột biến cũng có sự khác nhau, các dạng H2, H3 và H4 có độ rộng trên 3 cm, các dạng còn lại biến động từ 2,1 đến 2,8 cm. Về số lượng nhị ở các dạng không có sự khác nhau tuy nhiên độ dài của vòi nhị của dạng H1 và dạng H3 dài hơn. Số lương nhị hoa dao động từ 11 (dòng H5) đến 19 (dòng H1), trong đó dòng H2, H4, H6 không có sự khác biệt so với giống đối chứng. Quan quan sát đặc điểm hình thái của các dòng đột biến về mầu sắc (H1, H2, H3, H4, H5, H6 và H7) cho thấy dòng H2, H6 và H7 có hoa tương đối cân đối, Thân lá cứng, cây sinh trưởng phát triển tốt. 99 Bảng 3.23. Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng Dạng hoa Đặc điểm Đ/C H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 Chiều cao cây (cm) 114±6,11 107±6,23 121±4,61 113±5,73 118±8,61 98±9,23 115±4,31 116±6,61 Số cặp lá (cặp lá) 35±2,17 30±2,29 37±2,21 34±3,10 36±2,23 30±3,27 34±2,09 36±1,82 Chồi nách Không Không Không Không Có Không Không Không Tổng độ dài của 7 lóng dưới hoa (cm) 31,92±2,61 29,7±3,53 33,8±2,73 31,5±3,23 32,2±3,19 27,94±2,63 30,23 32,15±3,61 Độ dài của lóng thứ 5 dưới hoa (cm) 6,87±0,65 6,2± 0,69 7,48± 0,73 7,11± 0,71 7,23± 0,89 6,61±0,53 6,96 7,14± 0,78 Hình dạng lá Elip Elip Elip Elip Elip Elip Elip Elip Độ dài của lá tại đốt thứ 5 dưới hoa (cm) 7,73± 0,59 7,8± 0,53 7,58± 0,47 7,98± 0,62 8,3± 0,76