Luận án Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ - Hoàng Văn Trung

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU.1

1. Lí do chọn đề tài .1

2. Đối tượng nghiên cứu.2

3. Nhiệm vụ nghiên cứu .2

4. Phương pháp nghiên cứu.3

5. Những đóng góp mới của luận án .3

6. Cấu trúc của luận án .4

Chương 1: TỔNG QUAN .5

1.1. Nấm lớn .5

1.2. Thành phần dinh dưỡng của nấm .5

1.2.1. Hàm lượng chất khô .5

1.2.2. Protein và acid amin .6

1.2.3. Carbohydrate .8

1.2.4. Lipid.9

1.2.5. Vitamin .9

1.2.6. Khoáng chất.10

1.3. Chi Daldinia.11

1.3.1. Đặc điểm chung về hình thái.11

1.3.2. Thành phần hóa học.11

1.4. Nấm than (Daldinia concentrica).13

1.4.1. Đặc điểm hình thái và phân bố.13

1.4.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .13

1.5. Chi linh chi (Ganoderma) .15

1.5.1. Đặc điểm hình thái.15

1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .15

1.6. Nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) .27

1.6.1. Đặc điểm hình thái và phân bố.27

1.6.2. Thành phần hóa học.281.6.3. Hoạt tính sinh học.29

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM .30

2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu .30

2.1.1. Thu mẫu.30

2.1.2. Các phương pháp xử lý mẫu và chiết .30

2.1.3. Các phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp và phân lập các hợp chất.30

2.1.4. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất.30

2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị .30

2.2.1. Hoá chất.30

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị .31

2.3. Nghiên cứu thành phần các chất dinh dưỡng có trong các loài nấm lớn vùng Bắc

Trung Bộ.32

2.3.1. Xác định thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng. .32

2.3.2. Xác định hàm lượng acid amin.34

2.3.3. Xác định hàm lượng các vitamin A và E.36

2.4. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide .37

2.4.1. Chất chuẩn .37

2.4.2. Chiết các sterol .37

2.4.3. Phân tích bằng sắc ký (HPLC) .37

2.5. Nghiên cứu các hợp chất từ loài nấm than (D. concentrica).38

2.5.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được .38

2.5.2. Các dữ liệu vật lý.39

2.6. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) .43

2.6.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất.43

2.6.2. Các dữ kiện vật lý và phổ .43

2.7. Phương pháp thử hoạt tính .47

2.7.1. Gây độc tế bào .47

2.7.2. Kháng viêm.48

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.51

3.1. Kết quả xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng của một số loài nấm.51

3.1.1. Thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng.51

3.1.2. Hàm lượng các acid amin trong các mẫu nấm .53

3.1.3. Hàm lượng các vitamin trong các mẫu nấm.60

3.2. Hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide .62

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn của ergosterol và ergosterol peroxide.62

3.2.2. Kết quả phân tích.643.3. Nấm than (D. concentrica) .64

3.3.1. Kết quả phân lập hợp chất. .64

3.3.2. Xác định cấu trúc.65

3.3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học.97

3.4. Nấm linh chi (Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. ).98

3.4.1. Phân lập một số hợp chất.98

3.4.2. Xác định cấu trúc.98

KẾT LUẬN .106

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .108

TÀI LIỆU THAM KHẢO.109

PHỤ LỤC .121

pdf172 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 285 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ - Hoàng Văn Trung, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
h cầu và quay đến cạn. Hòa tan phần còn lại bằng 10ml pha động. Lọc dịch qua màng lọc 13mm, 0,45µm vào vial và tiến hành phân tích trên máy HPLC. Quy trình chuẩn bị mẫu được tóm tắt bằng sơ đồ 2.2. Sơ đồ 2.2. Quy trình xử lý mẫu định hàm lượng vitamin A và E Cân 15g mẫu nấm 40ml etanol, 3g KOH và 1g axit ascorbic Xà phòng hóa ở 70oC, 30 phút Chuyển sang bình tam giác, tráng bằng nước cất và cho vào phễu chiết Chiết 3 lần với diethyl ether (30ml/lần), lắc 30 phút, để yên 30 phút, chiết Loại bỏ dung dịch phần dưới Giữ lại dung dịch phía trên Lọc qua phễu có Na2SO4 khan Cất quay chân không đến cạn Dung dịch Màng lọc 0,45µm Mẫu bơm vào HPLC Rửa bằng 3 ml pha động 37 2.3.3.2. Tiến hành phân tích vitamin A trên máy HPLC - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. - Pha động: 100% ACN - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Detector: UV bước sóng λ =325 nm. 2.3.3.3. Tiến hành phân tích vitamin E trên máy HPLC - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. - Pha động: 1,4 dioxan: n-hexan 1,2 : 98,8 - Nhiệt độ cột: 300C - Detector: Đo huỳnh quang (FLD) bước sóng λEx= 292nm, λEm= 330 nm 2.4. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide 2.4.1. Chất chuẩn Các chất chuẩn ergosterol và ergosterol peroxide được phân lập từ loài Ganoderma lucidum. Cấu trúc của các chất này được xác định bằng các phổ 1H-, 13C- NMR, HSQC, HMBC, MS, UV và IR. 2.4.2. Chiết các sterol Phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo quy trình được mô tả bởi Villares et al. [110] với một số thay đổi nhỏ. Bột nấm khô (~ 2 g; độ ẩm 24%) được chiết với 20 mL hỗn hợp MeOH / MeCN (85:15, v / v) bằng cách khuấy trong bể siêu âm ở 4°C trong 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 3500 vòng / phút trong 10 phút. Phần còn lại được chiết hai lần, và các chất chiết được gộp lại. Các mẫu được lưu trữ (4°C trong bóng tối) cho đến khi phân tích HPLC. Trước khi phân tích HPLC, các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 μm. 2.4.3. Phân tích bằng sắc ký (HPLC) 2.4.3.1 . Tiến hành phân tích ergosterol - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Dung dịch pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v ) - Nhiệt độ cột : 300C - Detector: UV bước sóng λ = 290 nm - Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút 2.4.3.2. Tiến hành phân tích ergosterol peroxide - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 38 - Pha động: Me0H 100% - Nhiệt độ cột: 35cC - Detector: UV bước sóng λ = 290 nm - Tốc độ dòng: 1ml/ phút 2.5. Nghiên cứu các hợp chất từ loài nấm than (D. concentrica) 2.5.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Quả thể nấm than (D. concentrica) (8,6 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng, thu được dịch chiết được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao methanol (180g). Cao methanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi ethylacetate, chưng cất chân không thu được hai phần: cao ethylacetate (105g) và dịch chiết nước. Cao ethylacetate được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexane- acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 7:1; 5:1) và hệ dung môi CHCl3:CH3OH (100:0; 6:1; 3:1; 2:1; 1:1) thu được 7 phân đoạn chính (kí hiệu từ F1 đến F7) (sơ đồ 2.1). Phân đoạn F1 (8,6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1), mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu được 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7). Phân đoạn F1.4 (1,0 g) đã được sắc ký trên cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml) thu được hợp chất DCM7 (153 mg). Phân đoạn F1.6 (0,3g) được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1) thu được hợp chất DCM3 (5mg). Phân đoạn F1.7 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 (100 gam, 60x3cm) với hệ dung môi giải hấp CH3OH:H2O thu được DCM1 (134 mg). Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) với hệ dung môi rủa giải hexane:acetone (9:1 ; 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6). Phân đoạn F2.6 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) được giải hấp với hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM6 (41 mg). Phân đoạn F3 (2,7 g) được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm) được rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (9:1; 6:1; 4:1; 1:1, mỗi hệ dung sử dụng 250ml) để thu được bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4). Phân đoạn F3.2 (0,5 g) 39 tiếp tục được sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x 3 cm) giải hấp bằng hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM2 (31 mg). Phân đoạn F4 (4,7 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5cm) được rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1; 10:1; 6:1; 4:1; 2:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu được 5 phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5). Phân đoạn F4.1 tiếp tục được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3 cm) rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1; 16:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM4 (10 mg) và hợp chất DCM8 (21 mg). Phân đoạn F5 (1,5 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3cm) được rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM9 (43 mg). Phân đoạn F6 (1,2 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM6 (13 mg). 2.5.2. Các dữ liệu vật lý 2.5.2.1. Hợp chất DCM1 Tinh thể không màu (CHCl3), đ.n.c.216-217 °C; : +47 (c 0.05, MeOH). IR (KBr) max: 3386, 2950, 2847, 1723, 1664, 1450, 1037 cm-1. UV (MeOH) λ max (log ε): 206 nm (2.90). HR-ESI-MS m/z 546.2834 [M+Na]+ ( C31H41O6NNa, cal. m/z 546.2832); 1H-NMR (700MHz, Pyridine-d5) 7.28 (2H, m, H-3', -5'), 7.25 (1H, m, H- 4'), 7.19 (2H, m, H-2', -6'), 6.57 (1H, m, H-13), 5.45 (1H, m, H-12b), 5.12 (1H, m, H- 14), 5.12 (1H, s, H-12a), 4.89 (1H, d, J = 19.6, H-2), 4.74 (1H, d, J = 11.2 Hz, H-7), 3.75 (3H, s, OCH3), 3.66 (1H, d, J= 5.6, H-19), 3.63 (1H, m, H-3), 3.21 (1H, t, J = 9,8 Hz, H-8), 3.15 (1H, t, J = 6.3 Hz, H-4), 3.11 (1H, d, J = 6.3 Hz, H-5), 2.92 (1H, m, H- 17a), 2.69 (2H, d, J = 6.3 Hz, H-10), 2.26 (3H, s, COCH3), 1.93 (1H, m, H-15a), 1.67 (1H, m, H-15b), 1.51 (3H, s, H-23), 1.41 (1H, m, H-17b), 1.17 (1H, m, H-16), 0.89 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-11), 0.94 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-22); 13C-NMR (175MHz, Pyridine-d5) (ppm)  213.2 (C-21), 177.4 (OCO), 175.5 (C-1), 151.8 (C-6), 137.6 (C- 1'), 133.8 (C-14), 131.7 (C-13), 130.1 (C-2', -6'), 129.0 (C-3', -5'), 127.1 (C-4'), 113.0 (C-12), 80.9 (C-19), 76.0 (C-18), 72.1 (C-7), 64.8 (C-9), 58.8 (OCH3), 53.3 (C-3), 52.8 (C-8), 47.6 (C-4), 45.6 (C-17), 43.8 (C-10), 43.1 (C-15), 32.8 (C-5), 30.0 (C-16), 29.7 (C-20), 25.1 (C-22), 24.3 (C-23), 24.0 (COCH3), 13.1 (C-11). 40 Quả thể nấm D. concentica (8,6kg) Cao methanol (180 g) Ngâm chiết với MeOH (3x10l) ethyl acetate, nước Cao ethyl axetat (105g) Dịch nước F1 8,6(g) (8,6 g) F1.4 (1g) (1g) RP-18 Methanol, / nước CC, Silica gel Hexane: acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) Sơ đồ 2.3. Phân lập các hợp chất từ nấm than (D. concentrica) CC, Silica gel Hexane: acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1) DCM7 (153mg) (1g) CC, Silica gel Hexane: acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1) F1.6 (3g) (1g) CC, Silica gel Hexane: acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1) DCM3 (5mg) (1g) F1.7 (0,5g) (1g) DCM1 (134mg) (1g) F2 (2,3g) (g) (8,6 g) F2.6 (0,5g) (1g) CC, Silica gel Hexane: acetone (9:1, 6:1) LH-20 Methanol, / nước DCM6 (41mg) (1g) F3 (2,7g) (g) (8,6 g) F3.2 (0,5g) (1g) DCM2 (31mg) (1g) CC, Silica gel Hexane: acetone (9:1, 6:1, 4:1, 1:1) RP-18 Methanol, / nước F4 (4,7g) (g) (8,6 g) CC, Silica gel chlorofom :methanol 20:1 10:1, 6:1, 4:1, 2:1) F4.1 CC, Silica gel chlorofom :methanol (19:1, 16:1) DCM4 (10mg) (1g) DCM8 (21mg) (1g) F5 (1,5g) (g) (8,6 g) CC, Silica gel chlorofom:methanol (9:1, 6:1) DCM9 (43mg) (1g) F6 (1,2g) (g) (8,6 g) DCM5 (13mg) (1g) CC, Silica gel chlorofom :methanol (9:1, 6:1) F7 (g) (8,6 g) 41 2.5.2.2. Hợp chất DCM 2 Tinh thể không màu, (CHCl3), đ.n.c.216-217°C; HR-ESI-MS m/z 467.2669 [M]+ (C28H37O5N, cal. m/z 467.2672); Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) có ( ppm): 7.28 (2H, m, H-3’,5’), 7.25 (1H, m, H-4’), 7.13 (2H, m, H-2’,6’), 6.67 (1H, m, H-13), 6.35 (1H, br s, H-2), 5.50 (1H, m, H-14), 5.43 (1H, s, H-12b), 5.10 (1H, s, H-12a), 5.01 (1H, s, H-20a), 4.76 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-7), 4.31 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-19), 3.59 (1H, m, H-3), 3.25 (1H, d, J = 4.5 Hz, H-4), 3.15 (1H, m, H-8), 3.10 (1H, m, H-5), 2.71 (1H, m, H-10a), 2.65 (1H,s, H- 20b), 2.62 (1H, m, H-10b), 2.25 (1H, s, H-17a), 1.95 (1H,m, H-15a), 1.73 (1H, m, H- 15b), 1.63 (3H, s, H-23), 1.52 (1H, dd, J = 4.0, 5.5 Hz, H-17b), 1.39 (1H, s, H-16), 0.91 (3H, m, H-11), 0.92 (3H, s, H-22); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) có ( ppm): 212.3 (C-21), 173.1 (C-1), 148.5 (C- 6), 136.5 (C-1’), 136.0 (C-14), 129.6 (C-2’,6’), 128.9 (C-13), 128.8 (C-3’,5’), 127.1 (C-4'), 114.4 (C-12), 75.4 (C-18), 71.5 (C-7), 71.4 (C-19), 63.7 (C-9), 52.5 (C-3), 51.5 (C-8), 45.2 (C-4), 45.1 (C-17), 43.7 (C-10), 43.0 (C-15), 42.8 (C-20), 31.9 (C-5), 29.9 (C-16), 25.7 (C-22), 23.1 (C-23), 13.1 (C-11). 2.5.2.3. Hợp chất DCM 3 Tinh thể không màu,(CHCl3), đ.n.c.120-121°C; HR-ESI-MS m/z 451.2717 [M]+ (C28H37O4N, cal.m/z 451.2712); Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm): 7.30 (2H, m, H-3’,5’), 7.24 (1H, m, H-4’), 7.08 (2H, m, H-2’,6’), 6.07 (1H, dd, J = 8.5, 15.5 Hz, H-13), 5.64 (1H, br s, H- 2), 5.36 (1H, ddd, J = 4.5, 11.0, 11.0 Hz, H-14), 5.25 (1H, s, H-12a), 5.07 (1H, s, H- 12b), 4.12 (1H, br d, J = 10.0 Hz, H-7), 3.70 (1H, ddd, J = 18.5, 9.5 Hz, H-20a), 3.31 (1H, m, H-3), 2.97 (1H, dd, J = 6.5, 2.0 Hz, H-4), 2.84 (1H, brqd, H-5), 2.64 (1H, dd, J = 13.5, 5.0, H-10a), 2.47 (1H, dd, J = 10.8, 6.5 Hz, H-10b), 2.46 (1H, t, J = 10.0 Hz, H-8), 2.03 (1H, dd, J = 4.5, 12.5 Hz, H-15a), 1.93 (1H, br d, J = 13.5 Hz, H-17a), 1.82 (1H, dt, J = 18.5, 9.5 Hz, H-20b), 1.80 (1H, m, H-15b), 1.65 (2H, m, H-19), 1.19 (3H, s, H-23), 1.13 (1H, m, H-16), 1.09 (1H, brddd, J = 13.5, 5.0, 1.5 Hz, H-17b), 1.03 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-22), 0.97 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-11); Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): 211.0 (C-21), 174.0 (C-1), 148.8 (C- 6), 136.6 (C-1’), 135.8 (C-14), 129.5 (C-2’,6’), 128.8 (C-3’,5’), 128.4 (C-13), 127.0 (C-4'), 114.3 (C-12), 73.2 (C-18), 71.7 (C-7), 63.8 (C-9), 52.6 (C-3), 51.4 (C-8), 46.3 42 (C-4), 45.1 (C-17), 43.9 (C-10), 43.0 (C-15), 34.3 (C-20), 31.8 (C-5), 31.1 (C-19), 30.5 (C-16), 28.2 (C-23), 25.5 (C-22), 12.9 s(C-11). 2.5.2.4. Hợp chất DCM4 Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c.182-184oC; EI-MS m/z (%): 220 (M+, C12H12O4); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 6,20 (1H, s, H-3), 2,40 (3H, s, 2- CH3), 2,22 (3H, s, 6-CH3), 2,13 (3H, s, 8-CH3); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) (ppm). 2.5.2.5. Hợp chất DCM5 Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c.227-229oC; EI-MS m/z (%): 206 (M+, C11H10O4); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 6,38 (1H, s, H-8), 6,00 (1H, s, H-3), 2,34 (3H, s, 2-CH3), 2,09 (3H, s, 6-CH3); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) (ppm). 2.5.2.6. Hợp chất DCM6 Chất bột màu nâu nhạt, đ.n.c. 310-3110C ; 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 10,98 (1H, br s), 10,81 (1H, br s), 7,37 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6), 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5). 2.5.2.7. Hợp chất DCM7 Chất bột không màu, đ.n.c. 166-1680C; 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 4,40 (2H, d, J = 5,0 Hz, 2,5-OH), 4,31 (2H, t, J = 5,5 Hz, 1,6-OH), 4,12 (2H, d, J = 7,0 Hz, 3,5-OH), 3,61 (2H, m, H-1b, -6b), 3,53 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-3,-4), 3,45 (1H, m, H-2,-5), 3,37 (2H, dd, J = 6,0, 11,5 Hz, H-1a, -6a); 2.5.2.8. Hợp chất Ergosterol DCM8 Chất bột màu trắng; đ.n.c: 165-1670C; Phổ UV (MeOH) max nm: 211, 285; IR (KBr) max (cm-1): 3433, 2959, 1726, 1090; EI-MS m/z 396 [M]+; Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm): 5,49 (1H, m, H-7); 5,35 (1H, m, H-6); 5,28 (1H, dd, J = 15,5, 7,5 Hz, H-22); 5,25 (1H, dd, J = 15,5, 7,0 Hz, H-23); 3,48 (1H, m, H-3); 1,05 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-28); 0,96 (3H, s, H-19); 0,93 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27); 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26); 0,82 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21); 0,61 (3H, s, H- 18); Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): 140,3 (C-5); 139,8 (C-8); 135,0 (C- 23); 131,2 (C-22); 118,2 (C-6); 115,8 (C-7); 68,3 (C-3); 55,0 (C-17); 53,6 (C-14); 45,5 (C-9); 42,2 (C-13); 41,8 (C-24); 40,4 (C-4); 40,0 (C-20); 39,0 (C-1); 38,2 (C-12); 37,7 43 (C-10); 32,2 (C-25); 31,5 (C-2); 27,4 (C-16); 22,2 (C-15); 20,6 (C-11); 20,4 (C-27); 19,4 (C-26); 19,1 (C-21); 17,0 (C-28); 15,8 (C-19); 11,5 (C-18). 2.5.2.9. Hợp chất Ergosterol peroxide DCM9 Bột màu trắng (CHCl3); đ.n.c: 172-174°C ; [α]D25 -14.4 (c = 0.08, CHCl3); EI-MS (rel. int.): m/z 396 ([M]+, 100); IR (KBr) νmax: 3417, 2954, 1458 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) (δ ppm): 6,49 (1H, d, J=8,5Hz, H-7); 6,23 (1H, d, J=8,5Hz, H-6); 5,17 (1H, dd, J=15,1, 7,5Hz, H-23); 5,12 (1H, dd, J=15,1, 8,0Hz, H- 22); 3,94 (1H, m, H-3); 1,09 (3H, s, H-19); 0,98 (3H, d, J=5,6Hz, H-21); 0,89 (3H, d, J=6,7Hz, H-28); 0,87 (3H, s, H-19); 0,83 (3H, d, J=8,4Hz, H-26); 0,81 (3H, s, H-27); 0,80 (3H, d, J=3,6Hz, H-18). 2.6. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) 2.6.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất Quả thể nấm linh chi (G. applanatum) (3,0 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10Lx3) ở nhiệt độ phòng, sau đó lọc và dịch lọc được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao metanol (128,0g). Sau đó cao thô được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi, chưng cất chân không thu được: ethyl acetate (32g), butanol (33g) và dịch chiết nước (55g). Cao chiết ethyl acetate được tiến hành trên sắc ký cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi hexane và acetone tăng dần độ phân cực (từ 100:0 đến 2:1) thu được các phân đoạn nhỏ, sử dụng TLC gộp được 10 phân đoạn (Frs. G1-G10). Tinh chế phân đoạn G1 (1.2g) bằng sắc ký cột silica gel rửa giải với hexane và acetone (15:1) thu được hợp chất 1 (123 mg). Phân đoạn G3 (2.6g) cũng được tiến hành trên silica gel với hệ dung môi hexane và ethyl acetate (15:1) thu được chất 4 (38 mg). Phân đoạn G4 (2,5g) đã được sắc ký cột silica gel rửa giải với hỗn hợp hexane và acetone (9: 1) thu được hợp chất 2 (10 mg) và 3 (31 mg). G6 (2,9g) đã được sắc ký cột silica gel giải hấp với chlorofom và hỗn hợp dung môi methanol (10: 1) và tiếp tục kết tinh lại để thu được hợp chất 5 (30 mg). 2.6.2. Các dữ kiện vật lý và phổ 2.6.2.1. Ergosterol (GAM1) 44 Hợp chất GAM1 có cấu trúc giống với hợp chất DCM8 số liệu phổ và biện luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.8 đã chứng minh được đây là ergosterol. 2.6.2.2 Ergosterol peroxide (GAM2) Hợp chất GAM2 có cấu trúc giống với hợp chất DCM9 số liệu phổ và biện luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.9 đã chứng minh được đây là ergosterol peroxide . 2.6.2.3 Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) Tinh thể không màu; (CHCl3); [α]D20 -5 (c = 0.85, CHCl3); đ.n.c.185.5-187°C ; EI-MS (rel. int.): m/z 398([M]+, 4), 217(8), 255(9), 107(15), 69(24), 43(100); IR (KBr) νmax: 3341, 2951, 2928, 2870, 1663, 1458, 1377, 1044, 970 cm-1 ; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (δ ppm): 5.22 (1H, dd, J =15.0, 7.5 Hz, H-22), 5.16 (1H, m, H-7), 5.19 (1H, dd, J =15.0, 8.0 Hz, H-23), 3.59 (1H, m, H-3), 1.01 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-21), 0.91 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-28), 0.83 (3H, d, J = 7.5 Hz, H-27), 0.80 (3H, d, J = 8.0 Hz, H- 26), 0.79 (3H, s, H-19), 0.55 (3H, s, H-18); 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (δ ppm):139.6 (C-8), 135.7 (C-22), 131.9 (C-23), 117.5 (C-7), 71.1 (C-3), 56.0 (C-17), 55.1 (C-14), 49.5 (C-9), 43.3 (C-13), 42.8 (C-24), 40.5 (C-20), 40.3 (C-5), 39.5 (C- 12), 38.0 (C-4), 37.2 (C-1), 34.2 (C-10), 33.1 (C-25), 31.5 (C-2), 29.7 (C-6), 28.1 (C- 16), 22.9 (C-15), 21.6 (C-11), 21.1 (C-21), 20.0 (C-27), 19.7 (C-26), 17.6 (C-28), 13.0 (C-19), 12.1 (C-18). 2.6.2.4. Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) Tinh thể không màu; đ.n.c. 171-1720C. EI-MS m/z 440 [M]+; EI-MS m/z 412 [M-H2O]+ (13), 397(6), 394(19), 383(10), 379(21), 376(15), 269(15), 251(57), 69(100); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (δ ppm): 5.46 (1H, s, H-7); 5.32 (1H, d, J = 13.5 Hz, H-11); 5.32 (1H, d, J = 13.5 Hz, H-24); 3.76(2H, d, J = 4.0 Hz, H-26); 3.00 (1H, d, J = 3.5Hz, H-3); 2.15(1H, s); 2.08 (1H, s, H-12); 2.08 (3H, s, H-19); 2.08(3H, s, H- 29); 1.54 (1H, s, H-17); 1.54 (3H, s, H-27); 1.54 (3H, s, H-28);1.36 (2H, m, H-15); 1.36 (2H, m, H-1); 1.27 (2H, m, H-2); 1.27 (2H, m, H-20); 1.05 (2H, d, J = 8.5Hz, H- 22); 0.98 (1H, d, J = 8.5Hz, H-5); 0.91 (2H, s, H-6); 0.91 (2H, s, H-16); 0.91 (3H, s, H-21); 0.84 (2H, s, H-23); 0.77 (3H, s, H-30); 0.53 (3H, s, H-18); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (δ ppm): 142.7(C-8); 146.0 (C-9); 134.4(C-25); 127.0(C-24); 120.2(C- 7); 116.3(C-11); 79.0(C-3); 69.1(C-26); 50.9(C-17); 50.3(C-14); 49.2(C-5); 43.8(C- 13); 37.9(C-12); 38.7(C-4); 35.9(C-22); 35.7(C-1); 37.4(C-10); 36.1(C-20); 31.5(C- 45 15) ;27.9(C-16); 27.8(C-2); 25.6(C-28); 22.8(C-19); 24.6(C-23); 28.2(C-29); 23.0(C- 6); 15.8(C-30); 15.7(C-18); 18.4(C-21); 13.7(C-27). 2.6.2.5. Acid 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic (GAM5) Tinh thể hình kim; đ.n.c 243-244oC; ESI-MS m/z 453 [M-H]- ; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (δ ppm): 6.75 (1H, t, J = 7.0 Hz, H-24); 5.42 (1H, s, H-7); 5.26 (1H, s, H-11); 3.18 (1H, dd, J = 4.7, 11.2 Hz, H-3); 1.76 (3H, s, H-27); 0.93 (3H, s, H-19); 0.92 (3H, s, H-29); 0.87 (3H, d, J = 5.6 Hz, H-21); 0.81 (6H, s, H-18, H-28); 0.50 (3H, s, H-30); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (δ ppm): 170.9 (C-26); 146.0 (C-9); 144.0 (C-24); 142.6 (C-8); 127.2 (C-25); 120.3 (C-7); 116.2 (C-11); 78.8 (C-3); 50.9 (C-17); 50.3 (C-14); 48.7 (C-5); 43.8 (C-13); 38.7 (C-4); 37.8 (C-12); 37.4 (C-10); 36.2 (C-20); 35.8 (C-1); 34.9 (C-22); 31.5 (C- 16); 28.1 (C-29); 27.9 (C-2); 27.5 (C-15); 25.8 (C-23); 25.5 (C-28); 23.0 (C-6); 22.7 (C-19); 18.3 (C-21); 15.7 (C-18); 15.8 (C-30); 12.1 (C-27). H-1); 1,17 (3H, s, CH3- 20); 1,00 (3H, s, CH3-19); 0,95 (3H, d, J = 5,5 Hz, CH3-24); 0,92 (3H, s, CH3-22); 0,88 (3H, s, CH3-18); 0,66 (3H, s, CH3-21); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (δ ppm): 199,0(C-7), 172,2(C-26), 164,7(C-9), 145,5(C-24), 138,9(C-8), 126,6(C-25), 78,0(C-3), 49,9(C-5), 47,8(C-14), 49,0(C-17), 45,0(C-13), 39,8(C-10), 38,9(C-4), 36,6(C-6), 36,2(C-20), 34,9(C-1), 34,8(C-22), 32,0(C-15), 30,2(C-12), 28,8(C-16), 27,5(C-2), 27,5(C-29), 25,9(C-23), 25,0(C-28), 23,7(C-11), 18,6(C-21), 18,4(C-19), 15,8(C-18), 15,3(C-30), 12,0(C-27). 46 Quả thể G. applanatum (3,0 kg) Cao methanol (128,0 g) - Ngâm chiết với methanol (3x10L ) - Hòa tan trong nước - Chiết với butanol, ethyl acetate -Chiết với clorofom Cao ethyl acetate (52g ) Cao butanol (33g) G-1 (1,2g) GAM1 (123mg) Sơ đồ 2.4. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (G. applanatum) G-3 (2,6g) G-4 (2,5g) G10 (4,8g) - CC, Silica gel - hexane: acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) - cloroform:methanol (10:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) -Chiết với clorofom - CC, Silica gel - hexane:acetone (15:1) -Chiết với clorofom GAM4 (38mg) GAM2 (10mg) GAM3 (31mg) - CC, Silica gel - hexane:ethylacetate (15:1) -Chiết với clorofom GAM5 (30mg) Dịch chiết H2O (55g) - CC, Silica gel - hexane:acetone (9:1) -Chiết với clorofom G-6 (2,9g) - CC, Silica gel - clorofom:methanol (10:1) -Chiết với clorofom 47 2.7. Phương pháp thử hoạt tính 2.7.1. Gây độc tế bào - FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma) - Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máyđọc ELISA 96 giếng (Bio-rad) - Chất tham khảo: Ellipticine - Các hóa chất thông thường khác - Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp. Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang (OD-Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể - Chất thử được pha thành các dải nồng độ thích hợp. - Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. - Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa ( 96 giếng ), thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 200 µg/ml; 40 µg/ml; 8 µg/ml và 1,6 µg/ml . Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid-TCA. - Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acid axetic rồi để khô ở nhiệt độ phòng. - 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã nhuộm, lắc nhẹ trong 10 phút. - Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio- 48 Rad). - Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: - Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0,4 µg/ml; 0,08 µg/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương; - DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. - Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50 ≤ 20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 ≤ 5 μM [Hughes JP, (2011)] [18,77]. 2.7.2. Kháng viêm 2.7.2.1. Vật liệu Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia- coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) của hãng Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA). Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride và dimethyl sulphoxide (DMSO) của hãng Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v. Dòng tế bào: RAW 264.7 do GS. TS. Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp. 2.7.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro - Dòng tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). - Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. 49 2.7.2.3. Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 274.7 - Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h. - Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h. - Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h. - Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG-Methyl-L- arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/ml. - Nitrite (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) axit phosphoric và 50 μL 0,1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước. - Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank). Hàm lượng nitrite của từng mẫu t

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_thanh_phan_dinh_duong_va_hop_chat_co_hoat.pdf
Tài liệu liên quan