Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học của 3 loài thuộc chi Polygonum, họ rau răm (Polygonaceae) thồm lồm gai (Polygonum Perfoliatum L.), nghể trắng (Polygonum Barbatum L.), mễ tử liễu (Polygonum Plebeium R.Br.)

u thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% ở các thang nồng độ gồm 5 nồng độ 1, 3, 10, 30, 50 μg/mL. Tamoxifen được sử dụng làm chứng dương. Quy trình nuôi cấy: Cho khoảng 2x104 tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy. Để 2 giếng trống làm chứng trắng (blank control). Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37oC và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Nuôi tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định. Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 10 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ được lặp lại ở 3 giếng. Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường. Ủ đĩa nuôi cấy từ 72 giờ (37oC, 5% CO2) cho phép thuốc phát huy tác dụng. Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi. Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml. Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy. Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa. Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy. Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO. Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn. Đọc mật độ quang ở bước sóng 550 nm. Mật độ quang sẽ phản 83 ánh số lượng tế bào (TB) sống sót. % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau: % TB sống = [OD540 của TB được xử lý]/[OD540 của TB không được xử lý thuốc] x 100% - Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Excel. 3.7.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 3.7.2.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết. Đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH Mẫu thử: Cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu được điều chế như mục 3.3.2. Tiến hành: theo tài liệu [133], chỉnh sửa nhỏ để phù hợp với điều kiện thực tế. Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,06 mM trong metanol. Dung dịch này không bền với ánh sáng, chỉ pha trước khi dùng. Pha các dung dịch thử trong metanol có nồng độ thích hợp (từ 20-150 µg/ml). Ống thử: 300µl dung dịch thử + 3ml dung dịch DPPH. Ống chứng: 300µl metanol + 3ml dung dịch DPPH. Lắc đều các ống trong 15 giây, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đo quang ở bước sóng 517 nm. Hoạt tính chống oxy hóa (I) được tính theo công thức: I% = (A chứng – A thử) / A chứng x 100. Trong đó: A là mật độ quang. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Sử dụng phương pháp đường chuẩn để tính IC50. Acid ascorbic được sử dụng làm chứng dương. Phương pháp định lượng ABTS•+ Dung dịch gốc ABTS•+ được pha từ 7mM ABTS•+ và 2,45 mM kali persulfat với tỉ lệ thể tích 1:1, sau đó được ủ trong tối trong vòng 16 giờ tại nhiệt độ phòng và được sử dụng trong vòng 2 ngày. Dung dịch thao tác phản ứng ABTS•+ được pha loãng từ dung dịch gốc trong đệm phosphate 7,4 tới độ hấp thụ 0,70 ± 0,05 tại 734 nm. Pha các dung dịch thử trong metanol có nồng độ thích hợp (từ 20-150 µg/ml). 84 Sau đó, 30 µL dung dịch mẫu thử được trộn với 3 mL dung dịch thao tác. Hỗn hợp này được ủ tại nhiệt độ phòng trong 6 phút. Đo độ hấp thụ ánh sáng của hỗn hợp này tại bước sóng 734 nm. Khả năng dọn gốc tự do được tính theo công thức: SA(%) = 100 x (A chứng – A thử) / A chứng Trong đó: A là mật độ quang. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng phương pháp đường chuẩn để tính IC50. Trolox được sử dụng làm chất chứng dương.Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SD, tính toán bằng Excel và phần mềm thống kê GraphPad Prism 6.0 3.7.2.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các chất tinh khiết Mẫu thử: Là 14 chất tinh khiết được chọn ra từ các chất phân lập của ba đối tượng nghiên cứu bao gồm 3T, 5T, 6T, 21T, 22T, 23T, 27N, 28N, 31N, 36N, 37N, 50M, 54M, 55M. Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong metanol. Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 256, 64, 16, 4, 1 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. Khả năng bắt gốc tự do DPPH (SC%) của mẫu thử được tính theo công thức sau: SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%). Trong đó: OD mẫu thử (trắng) là giá trị mật độ quang của giếng chứa mẫu thí nghiệm (mẫu trắng). EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3. Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ật đ ộ qu an g h ọc (O D ) 85 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CẶN CHIẾT 4.1.1. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các mẫu cặn chiết Theo tiêu chuẩn của U.S. National Cancer Institute một dịch chiết được xem có khả năng độc tế bào in vitro khi giá trị IC50 nhỏ hơn 20 μg/mL, trong khi với chất tinh khiết, giá trị này được tính là nhỏ hơn 10 μg/mL [25], [88]. Qua bảng 4.2. kết quả thử hoạt tính độc tế bào có thể nhận thấy toàn bộ 11 cặn chiết từ ba loài cây nghiên cứu đều cho tác dụng độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư ở người bao gồm HT-1080, MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR và Hela với giá trị IC50 trong khoảng 5,1-19,9 µg/mL. Giá trị IC50 này thể hiện tác dụng độc tế bào với năm dòng tế bào trên của các cặn chiết khá tốt. Bảng 4.1. Hiệu suất thu nhận cặn chiết từ cao tổng STT Cây Bộ phận Dung môi Hiệu suất (%) 1 P. barbatum thân rễ MeOH 5,1 2 P. barbatum thân rễ EtOH 90% 6,9 3 P. barbatum thân rễ H2O 7,2 4 P. barbatum lá MeOH 3,2 5 P. perfoliatum thân rễ MeOH 9,3 6 P .perfoliatum thân rễ EtOH 90% 19,3 7 P. perfoliatum thân rễ H2O 20,7 8 P. perfoliatum lá MeOH 13,2 9 P. plebeium toàn cây MeOH 8,7 10 P. plebeium toàn cây EtOH 90% 11,6 11 P. plebeium toàn cây H2O 6,6 Trong số các mẫu này, bốn cặn chiết từ cây P. barbatum (1-4) thể hiện khả năng gây độc tế bào trên năm dòng tế bào kể trên mạnh hơn cả với các giá trị IC50 chỉ từ 5,1 – 9,4 µg/mL, bốn mẫu P. perfoliatum (5-8) và ba mẫu P. plebeium (9-11) thể hiện tác dụng này yếu hơn với IC50 từ 9,1 -19,9 µg/mL Một điểm đáng chú ý là cặn chiết metanol của thân rễ P. barbatum có tác dụng độc tế bào mạnh hơn bộ phận lá cây này P. barbatum thể hiện qua các giá trị IC50 trên năm dòng tế bào ở thân rễ đều thấp hơn ở lá. Trong số các cặn chiết metanol, EtOH 90% và nước của cây P. barbatum, cặn chiết EtOH 90% bộ phận thân rễ P. 86 barbatum có tác dụng độc tế bào mạnh nhất (IC50 5,1 – 7,2 µg/mL) nằm trong khoảng tác dụng của chất tinh khiết. Bảng 4.2. Kết quả thử độc tế bào của các mẫu cao chiết trên 5 dòng tế bào ung thư IC50 (µg/mL) STT Mẫu HT-1080 MDA-MB 231 MCF-7/adr MCF-7/TAMR Hela 1 8.5 ± 0.3 5.5 ± 0.3 7.8 ± 0.2 8.1 ± 0.4 7.1 ± 0.5 2 5.1 ± 0.7 6.6 ± 0.5 5.9 ± 0.3 5.4 ± 0.3 7.2 ± 0.4 3 7.4 ± 0.5 8.2 ± 0.4 9.2 ± 0.4 7.1 ± 0.6 9.4 ± 0.5 4 11.5 ± 0.4 12.6 ± 0.5 12.5 ± 0.5 14.2 ± 0.6 13.2 ± 0.4 5 12.8 ± 0.6 13.7 ± 0.3 18.2 ± 0.7 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.4 6 12.9 ± 0.3 13.4 ± 0.4 14.5 ± 0.7 15.4 ± 0.5 15.4 ± 0.6 7 17.5 ± 0.4 16.4 ± 0.5 17.2 ± 0.3 19.9 ± 0.4 13.8 ± 0.5 8 11.1 ± 0.5 10.6 ± 0.4 11.9 ± 0.7 12.4 ± 0.9 10.3 ± 0.4 9 12.6 ± 0.9 10.2 ± 0.4 11.7 ± 0.3 11.5 ± 0.4 10.4 ± 0.6 10 14.3 ± 0.2 13.5 ± 0.3 12.6 ± 0.4 11.8 ± 0.6 10.9 ± 0.5 11 11.9 ± 0.8 9.1 ± 0.5 12.4 ± 0.4 11.9 ± 0.6 12.4 ± 0.5 Tamoxifen** - 12.4 ± 0.8 10.9 ± 1.1 11.1 ± 0.8 - * Kết quả được lấy trung bình của 3 lần thí nghiệm khác nhau; ** chứng dương - Không thử Tương tự như vậy, với hai cây còn lại P. perfoliatum và P. plebeium, các cao chiết EtOH 90% bộ phận thân rễ đều thể hiện tác dụng độc tế bào mạnh hơn các cao chiết còn lại của cùng một cây cũng như phụ thuộc vào từng dòng tế bào. Đây cũng là một trong những cơ sở để định hướng cho quá trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ ba loài cây này. Kết quả nghiên cứu độc tế bào của các cao chiết từ P. barbatum L., P. plebeium R.Br, P. perfoliatum L. trên các dòng tế bào khối u trung mô ác tính (HT- 1080), tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB 231, MCF-7/adr, MCF-7/TAMR), ung thư cổ tử cung ở người (Hela) trong luận án này lần đầu tiên được công bố. 4.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các cặn chiết Bảng 4.3. cho thấy cả ba cặn chiết EtOH 90% của ba đối tượng nghiên cứu đều có khả năng dọn gốc tự do DPPH, ABTS•+. Trong đó cây nghể trắng cho tác dụng quét gốc DPPH cao nhất với IC50 = 35,53 ± 2,41 µg/ml xấp xỉ bằng chất đối chứng là acid ascorbic IC50 = 34,08 ± 0,36 µg/ml, tiếp đó là cây mễ tử liễu với IC50 87 = 55,60 ± 3,92 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 107,50 ± 3,95 µg/ml. Trong khi đó cây mễ tử liễu cho khả năng dọn gốc tự do ABTS•+ cao nhất với IC50 = 26,50 ± 5,92 µg/ml, tiếp đó là cây nghể trắng với IC50 = 29,83 ± 6,60 µg/ml và cuối cùng là cây thồm lồm gai với IC50 = 48,57 ± 8,874 µg/ml, với chất đối chứng Trolox IC50 =9,47 ± 0,25 µg/ml. Bảng 4.3. Kết quả đánh giá khả năng loại gốc DPPH và ABTS của các cặn chiết IC50 (µg/ml) STT Tên mẫu DPPH ABTS 1 Cặn EtOH 90% cây thồm lồm gai 107,50 ± 3,95 48,57 ± 8,874 2 Cặn EtOH 90% cây nghể trắng 35,53 ± 2,41 29,83 ± 6,60 3 Cặn EtOH 90% cây mễ tử liễu 55,60 ± 3,92 26,50 ± 5,92 4 Chất đối chứng 34,08 ± 0,36 Acid ascorbic 9,47 ± 0,25 Trolox Qua kết quả định tính nhóm chất và kết quả khảo sát tác dụng độc tế bào, chống oxy hóa của các phần chiết khác nhau từ các bộ phận của cả ba loài nhận thấy cặn chiết etanol 90% bộ phận thân rễ của hai loài thồm lồm gai, nghể trắng và toàn cây mễ tử liễu cho thấy tác dụng độc tế bào và tác dụng quét gốc DPPH rõ rệt nhất. Hơn nữa dung môi chiết xuất etanol 90% là dung môi có thể chiết xuất được hầu hết các các nhóm chất có độ phân cực khác nhau có mặt trong cả ba loài. Vì vậy, luận án lựa chọn đối tượng nghiên cứu cụ thể cho quá trình phân lập các chất là thân rễ thồm lồm gai, thân rễ nghể trắng, toàn cây mễ tử liễu với dung môi chiết xuất là etanol 90%. 4.2. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT Các đối tượng cụ thể được nghiên cứu chiết xuất phân lập trong luận án là: 1) Cây thồm lồm gai (Polygonum perfoliatum L.): thân rễ; 2) Cây nghể trắng (Polygonum barbatum L.): thân rễ; 3) Cây mễ tử liễu (Polygonum plebeium R.Br): toàn bộ cây. Quy trình chiết được áp dụng chung cho cả ba mẫu thực vật nêu trên và được tóm tắt ở Sơ đồ 4.1. Kết quả thu được các phần chiết n-hexan, etyl axetat, n- butanol và phần còn lại tan trong nước: Hiệu suất chiết xem bảng 3.1 phần Thực nghiệm. 88 4.3. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHẦN CHIẾT 4.3.1. Phân tích các phần chiết từ cây thồm lồm gai 4.3.1.1. Phân tích phần chiết n-hexan (TLH) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết TLH là hệ n-hexan/axeton theo chương trình gradient. 4.3.1.2. Phân tích phần chiết etyl axetat (TLE) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký Mẫu nguyên liệu (TL 2,5 kg; NT 2,5 kg, MT 2,5 kg) Dịch nước Phần chiết n-hexan (TLH; 17,00 g, 0,68 %) (NTH; 40,29 g, 1,61 %) (MTH; 71,86 g, 2,87 %) Dịch nước Dịch nước Phần chiết n-butanol (TLB; 47,30 g, 1,89 %) (NTB; 35,76 g, 1,43 %) (MTB; 41,43 g, 1,66 %) Phần chiết nước (TLW; 105,00 g, 4,20 %) (NTW; 76,80 g, 3,07 %) (MTW; 96,00 g, 3,84 %) 1. Hòa vào nước cất 2. Chiết bằng n-hexan 3. Cất loại kiệt n-hexan, 60 °C 1. Ngâm chiết với EtOH 90% (4 ngày, 3 lần) 2. Lọc, cất loại EtOH 1. Chiết với EtOAc 2. Cất loại kiệt EtOAc, 60 °C Phần chiết EtOAc (TLE; 100,00 g, 4,00 %) (NTE; 50,97 g, 2,04 %) (MTE; 71,25 g, 2,85 %) 1. Chiết với n-butanol 2. Cất loại kiệt n-butanol, 70 °C Cất loại kiệt nước, 80°C Phần chiết tổng (TL; 290,00 g, 11,60 %) (NT; 207,26 g, 8,29 %) (MT; 289,85g, 11,59 %) Sơ đồ 4.1. Quy trình điều chế các phần chiết từ ba đối tượng nghiên cứu 89 cột cho phần chiết TLE là hệ etyl axetat/metanol theo chương trình gradient. 4.3.1.3. Phân tích phần chiết n-butanol (TLB) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết TLB là hệ điclometan/metanol/nước với tỷ lệ 9/1/0,1 và 3/1/0,1 . Kết quả khảo sát TLC của cặn chiết TLH, TLE, TLB được thể hiện qua hình 4.1. UV 254 UV 365 H2SO4, t UV254 UV365 H2SO4, t UV 254 UV 365 H2SO4, t Cặn chiết TLH n-hexan/axeton: 9/1 Cặn chiết TLE etyl axetat/ metanol: 10/1 Cặn chiết TLB điclometan/metanol/nước: 9/1/0,1 Hình 4.1. Kết quả khảo sát TLC của các cặn chiết từ cây thồm lồm gai 4.3.2. Phân tích các phần chiết từ cây nghể trắng 4.3.2.1. Phân tích phần chiết n-hexan (NTH) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết NTH là hệ n-hexan/axeton theo chương trình gradient. 4.3.2.2. Phân tích phần chiết etyl axetat (NTE) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết NTE là hệ etyl axetat/metanol theo chương trình gradient. 4.3.2.3. Phân tích phần chiết n-butanol (NTB) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết NTB là hệ CH2Cl2/MeOH/nước theo chương trình gradient. Kết quả khảo sát TLC của cặn chiết NTH, NTE, NTB được thể hiện qua hình 4.2. 90 UV 254 UV 365 H2SO4, t UV 254 UV 365 H2SO4, t UV 254 UV 365 H2SO4, t Cặn chiết NTH n-hexan/axeton 10/1 Cặn chiết NTE etyl axetat/ metanol 9/1 Cặn chiết NTB CH2Cl2/MeOH/nước 9/1/0,1 Hình 4.2. Kết quả khảo sát TLC của các cặn chiết cây nghể trắng 4.3.3. Phân tích các phần chiết từ cây mễ tử liễu 4.3.3.1. Phân tích phần chiết n-hexan (MTH) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết MTH là hệ n-hexan/axeton theo chương trình gradient. 4.3.3.2. Phân tích phần chiết etyl axetat (MTE) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết MTE là hệ etyl axetat/metanol theo chương trình gradient. 4.3.3.3. Phân tích phần chiết n-butanol (MTB) Quá trình khảo sát TLC cho thấy hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phần chiết MTB là hệ etyl axetat/metanol/nước theo chương trình gradient. Kết quả khảo sát TLC của cặn chiết MTH, MTE, MTB được thể hiện qua hình 4.3. 91 UV 254 UV 365 H2SO4, t UV 254 UV 365 H2SO4, t UV 254 UV 365 H2SO4, t Cặn chiết MTH n-hexan/axeton 7/1 Cặn chiết MTE etyl axetat/methanol 10/1 Cặn chiết MTB etyl axetat/metanol/nước 8/1/0,1 Hình 4.3. Kết quả khảo sát TLC của các cặn chiết cây mễ tử liễu 4.4. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT 4.4.1. Phân lập các hợp chất từ cây thồm lồm gai 4.4.1.1. Phân tách phần chiết n-hexan (TLH) Quá trình phân lập các hợp chất từ phần chiết n-hexan được miêu tả chi tiết trong mục 3.5.1. phần Thực nghiệm và được trình bày trong Sơ đồ 4.2. 4.4.1.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (TLE) Quá trình