Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây hồng quân (Flacourtia Rukam Zoll. et mor.)

tại C-18 (δC 179,5), 2 carbon nhóm methylen tại C-17 (δC 34,0) và C-15 (δC 28,0). Từ các dữ liệu phân tích phổ cho thấy hợp chất (2) có dạng acid béo gắn với một vòng năm cạnh chưa no. Tiến hành so sánh với tài liệu tham khảo, thấy hợp chất (2) có nhiều điểm tương đồng với hợp chất acid chaulmoogric. Do đó cấu trúc hợp 86 chất (2) được xác định Hình 3.17. Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) của hợp chất (2) với acid chaumoogric (CDCl3 399,65 MHz; CDCl3 100,4 MHz) Vị trí Loại carbon Hợp chất (2) (CDCl3) Acid chaulmoogric [23] H (ppm) (J, Hz) COSY ( 1 H- 1 H) HMBC ( 1 H- 13 C) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 1 =CH– 5,68; 1H; m 2 3; 5 135,5 5,68 135,45 2 =CH– 5,68; 1H; m 3 3; 4; 5 130,0 5,68 129,97 3 –CH2– 2,28; 2H; m 1; 2 1; 2; 4 32,0 31,96 4 –CH2– 2,02 (2H; dtd, J = 13,0; 8,6 và 4,6 Hz) 3 29,9 29,87 5 >CH– 2,61 (1H, tq, J = 6,8 và 2,4 Hz) 6 4; 6 45,6 2,60 45,58 6 –CH2– 1,37; 1H; m 1,26; 1H; m 5 36,2 36,15 7 –CH2– 1,26; 2H; m 29,9 29,23 8 –CH2– 1,26; 2H; m 7; 9 29,1 29,12 9 –CH2– 1,30; 2H; m 8; 10 29,7 29,76 10 –CH2– 1,30; 2H; m 29,6 29,84 11 –CH2– 1,30; 2H; m 29,5 29,62 12 –CH2– 1,30; 2H; m 13 29,4 29,62 13 –CH2– 1,33; 2H; m 12 29,3 29,56 14 –CH2– 1,30; 2H; m 12; 13 29,2 29,43 15 –CH2– 1,39; 2H; m 16; 17 17; 18 28,0 27,97 16 –CH2– 1,63 (2H, q, J = 7,5 Hz) 15; 17 15; 17; 18 24,7 1,61 24,93 17 –CH2– 2,34 (2H, t, J = 7,5 Hz) 15; 16; 17 34,0 2,30 34,1 18 COOH 179,5 174,4 Từ những thông tin trên phổ hợp chất (2) được đề nghị là acid 13-(cyclopent-2-en-1- yl) tridecanoic (acid chaulmoogric) có công thức phân tử C18H32O2 cấu trúc như sau: Hình 3.17. Công thức hợp chất (2) - Acid chaulmoogric 87 3.4.3.3. Hợp chất (3): Poliothrysosid Hợp chất (3) là chất bột màu trắng ngà, tắt quang trên UV 254 nm, cho màu vàng với thuốc thử VS. Phổ khối lượng (ESI-MS) thấy xuất hiện tín hiệu chính có đỉnh m/z [M+H]+ = 406,9. Tương ứng với khối lượng của chất là 406 g/mol (C20H22O9). Độ bất bão hòa  = 10 (Phụ lục 20). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) kết hợp với phổ DEPT-NMR (Phụ lục 22, Phụ lục 26) cho thấy có 18 tín hiệu tương ứng với 20 carbon, trong đó có 5 carbon bậc IV, 11 carbon bậc III và 2 carbon bậc II. Trong đó có 2 tín hiệu carbon ở 129,1 ppm và 128,7 ppm có cường độ cao bất thường thể hiện dấu hiệu carbon đối xứng. Dữ liệu phổ 13C-NMR cũng cho thấy có các tín hiệu của đường glucose ở vùng 60 - 80 ppm và 100 ppm, 1 tín hiệu nhóm cacbonyl ở 165,5 ppm dự đoán có thể là carbonyl của acid hoặc este. Dữ liệu 13C-NMR cho thấy các tín hiệu đường ở δC 102,4 (C-1'), δC 73,4 (C-2'), 76,3 (C-3'), δC 70,2 (C-4'), δC 73,7 (C-5'), và δC 64,3 (C-6') và mười bốn tín hiệu khác cho nhóm aglycon. Phổ DEPT và HSQC cho thấy mười bốn tín hiệu carbon của aglycon được quy cho hai tín hiệu methylen, tám tín hiệu methin và bốn carbon bậc bốn. Trong các tín hiệu C thu được từ phổ 13C-NMR cho thấy có 10 tín hiệu tại vùng carbon thơm trong đó có 2 tín hiệu đối xứng dự đoán là 1 vòng thơm có hoặc không có nhóm thế ở vị trí para, và 1 vòng thơm còn lại có nhóm thế khác vị trí para. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), cho thấy sự hiện diện của một nhân benzen mang 3 nhóm thế 1, 3, 4 (nhân A) đặc trưng bởi ba tín hiệu proton ghép với nhau tại δH ppm = 6,90 (1H; d; J = 8,7 Hz; H-6); 6,78 (1H; d; J = 3,0 Hz; H-2); một nhân benzen thứ hai có một nhóm thế (vòng B) đặc trưng bởi 5 proton ghép với nhau tại δH ppm = 7,97 (2H; m; H-2”); 7,69 (1H; m; H-4”); 7,56 (2H; t; J = 7,8 Hz; –CH=); vùng từ trường 3,25 – 4,64 ppm, cho thấy sự hiện diện proton nhóm đường glucose (Phụ lục 21). 88 Dữ liệu phổ HMBC và COSY cho thấy không có tương tác nối kết giữa 2 vòng thơm này cho biết 2 vòng thơm này cùng gắn vào đường glucose. Kết hợp với phổ 1H-NMR cho thấy thêm 2 tín hiệu của 2 nhóm hydroxyl không phải của đường (Phụ lục 24, Phụ lục 25). Từ các dữ liệu trên kết hợp với tài liệu tham khảo cho thấy được rằng hợp chất (3) có có cấu trúc của nhóm phenolic glycosid. So sánh với tài liệu đã công bố xác định hợp chất (3) là poliothrysosid [45], [88]. Hợp chất này đã tìm thấy trong loài F. indica, F. rukam , Poliothrysis sinensis, Homalium brachybotrys, Xylosma flexuosum [26], [45], [46], [87], [88]. Cấu trúc hợp chất (3) thể hiện Hình 3.18. Bảng 3.15. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR của hợp chất (3) và poliothrysosid (CDCl3 500 MHz,  CDCl3 125 MHz) Vị trí Loại carbon Hợp chất (3) (MeOD) Poliothrysosid [88] H (ppm) (J, Hz) COSY ( 1 H- 1 H) HMBC ( 1 H- 13 C) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 1 =C< 147,2 150,2 2 =CH– 6,78 (d, J = 3,0 Hz) 1; 3; 5; 7 113,9 6,82 116,0 3 =C< 152,4 153,2 4 =C< 133,2 134,0 5 =CH– 6,37 (dd, J = 8,7 và 3,1 Hz) 6 1; 3; 6 113,0 6,54 115,0 6 =CH– 6,90 (d, J = 8,7 Hz) 5 1; 2; 3; 4; 7 116,9 7,11 119,2 7 –CH2– 4,60 – 4,64 (m) 4,39 (dd, J = 4,6 và 14,5 Hz) 1; 4; 5 58,2 4,3 61,1 1 >CH– 4,60 – 4,64 (m) 102,4 4,77 104,5 2 >CH– 3,27 (m) 1; 7 73,4 3,55 74,9 3 >CH– 3,28 (m) 2; 4 76,3 3,55 77,9 4 >CH– 3,25 (m) 3 3 70,2 3,55 71,6 5 >CH– 3,66 (m) 6 4 73,7 3,83 75,1 6 –CH2– 4,56 (dd, J = 4,0 và 14,5 Hz) 4,29 (dd, J = 4,5 và 11,7 Hz) 5 4; 5; 7 64,3 4,76 và 4,45 65,1 1 =C< 129,7 131,2 2 =CH– 7,97 (m) 3 1; 4; 7 129,1 8,09 130,3 3 =CH– 7,56 (t, J = 7,8 Hz) 2; 4 1; 2; 4; 5; 6 128,7 7,56 129,4 4 =CH– 7,69 (m) 3 2; 6 133,3 7,68 134,0 89 5 =CH– 7,56 (t, J = 7,8 Hz) 6 1; 2; 3; 4; 6 128,7 7,56 129,4 6 =CH– 7,97 (m) 5 1; 4; 7 129,1 8,09 130,3 7 =C< 165,5 166,6 1–OH 8,94 (s) 7–OH 4,90 (s) 7 2–OH 5,38 (s) 2 3–OH 5,16 (d, J = 2,0 Hz) 3 4–OH 5,32 (s) 4 Hình 3.18. Cấu trúc hợp chất (3) – Poliothrysosid 3.4.3.4. Hợp chất (4): 3,4,5-trimethoxyphenyl β-D-glucopyranosid (Koabursid) Hợp chất (4) là chất bột màu trắng, tắt quang trên UV 254 nm, không phát quang trên UV 365 nm, cho màu hồng với thuốc thử VS. Phổ khối lượng (ESI-MS) thấy xuất hiện tín hiệu m/z [M+H]+ = 347,34. Tương ứng với khối lượng của chất là 346 g/mol (C15H22O9). Độ bất bão hòa  = 5 (Phụ lục 28). Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) kết hợp với phổ DEPT (Phụ lục 29, Phụ lục 33) cho thấy có 12 tín hiệu tương ứng với 15 carbon. Trong đó có 4 carbon bậc bốn tại δC ppm [153,9 C-1); 153,1 (C-3, C-5); 132,4 (C-4)]. Có 7 nhóm methin, trong đó có hai nhóm thuộc vòng thơm tại δC ppm [94,4 (C-2, C-6)] và 5 nhóm thuộc phân tử đường glucose tại δC ppm [101,0 (C-1); 77,3 (C-5); 76,8 (C-3); 73,2 (C-2); 70,1 ( C-4)]. Có 1 nhóm methylen của phân tử đường glucose tại δC ppm [60,9 (C-6)]. Ba nhóm methoxy gắn ở vị trí C-3, C-4, C-5 trên vòng benzen tại δC ppm [60,1, - OCH3, C-8); 55,7 (–OCH3, C-7, C-9)]. 90 Ngoài ra, phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC (Phụ lục 30) còn cho thấy tín hiệu của một carbon anomer tại C-1’ (δC 101,0) và 5 carbon liên kết với oxygen tại C-5’ (δC 77,3); 76,8 (C-3’); 73,2 (C-2’); 70,1 (C-4’); 60,9 (C-6’) là dấu hiệu của phân tử đường D-glucose. Phổ 13C-NMR còn cho thấy sự hiện diện của nhóm methoxy cộng hưởng tại δC ppm = 60,1 (–OCH3); 55,7 (–OCH3). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO), cho thấy một tín hiệu proton thơm có cường độ bằng 2 tại δH ppm = 6,34 (2H, s) và 3 nhóm methoxy tại δH ppm = 3,71 (6H, s); 3,59 (3H, s, –CH3). Điều này chứng tỏ hợp chất FRE13 có một nhân benzen đối xứng mang ba nhóm thế methoxy ở vị trí C-3, C-4, C-5. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy các tín hiệu của một phân tử đường D-glucose trong vùng từ trường 3,08 – 5,24 ppm. Phổ COSY cho thấy ba nhóm methoxy gắn trên vòng benzen có sự tương quan proton với nhau như proton của carbon thứ 7 và thứ 9 tại δH ppm = 3,71 tương quan với proton của carbon thứ 8 tại δH ppm = 3,59. Trong phân tử đường cũng có sự tương quan proton của C- 2 tại δH ppm = 4,63 tương quan với proton của C- 3 tại δH ppm = 3,75 (Phụ lục 32). Phổ HMBC (Phụ lục 31) cho thấy sự liên kết của nhân benzen và phân tử đường D-glucose được xác định tại C-1’-O-C-1 bằng tương quan HMBC của H2→C1’ và của H1’→C2. Từ các dữ liệu phân tích phổ cho thấy hợp chất FRE13 có nối đôi liên hợp đặc trưng của nhân benzen. Dự đoán hợp chất (4) là một hợp chất glycoside có nhân benzen gắn với một phân tử đường glucose. Tiến hành so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất (4) có nhiều điểm tương đồng với hợp chất 3,4,5-trimethoxyphenyl β-D- glucopyranosid (Koabursid) [97]. Bảng 3.16. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) của hợp chất (4) với Koabursid ( DMSO-d6: 400 MHz, DMSO-d6: 100 MHz) Vị trí Loại carbon Hợp chất (4) (DMSO-d6) Koabursid (DMSO-d6) [97] 91 H (ppm) (J, Hz) COSY ( 1 H- 1 H) HMBC ( 1 H- 13 C) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 1 =C< 153,9 154,4 2 =CH– 6,34; 1H; s 1, 3, 4, 5, 6 94,4 6,38 95,1 3 =C< 153,1 153,6 4 =C< 132,4 133,1 5 =C< 153,1 153,6 6 =CH– 6,34; 1H; s 1, 3, 4, 5, 6 94,4 6,38 95,1 7 –OCH3 3,71; 3H; s 8 2, 3, 5, 6, 8 55,7 3,74 56,3 8 –OCH3 3,59; 1H; s 7, 9 4, 9 60,1 3,59 60,1 9 –OCH3 3,71; 3H; s 8 2, 3, 5, 6, 8 55,7 3,74 56,3 1 >CH– 5,24; 1H; s 1, 3, 5 101,0 101,6 2 >CH– 4,63; 1H; (t, J = 5,5 Hz) 3, 6 1, 4 73,2 73,7 3 >CH– 3,75; 1H; s 2 1, 5 76,8 77,7 4 >CH– 3,40 – 3,45; 1H; m 5 2, 3, 5, 6 70,1 70,6 5 >CH– 3,40 – 3,45; 1H; m 4 3, 6 77,3 77,3 6 –CH2– 3,08 – 3,33; 2H; m 2 4, 5 60,9 61,4 2–OH 5,01; 1H; s 3–OH 4,78; 1H; (d, J = 9,5 Hz) 4–OH 5,07; 1H; s 5,05 6–OH 3,73; 1H; s Từ những thông tin trên đề nghị hợp chất (4) là 3,4,5-trimethoxyphenyl β-D- glucopyranosid (Koabursid) có công thức phân tử C15H22O9 và cấu trúc như sau: Hình 3.19. Cấu trúc hợp chất (4) - Koabursid 3.4.3.5. Hợp chất (5): Daucosterol 92 Hợp chất (5) là bột vô định hình màu trắng, trong MeOH. Hợp chất (5) không hấp thu UV ở 254 nm và UV 365 nm và cho vết màu hồng tím sau chuyển thành màu nâu với thuốc thử VS. Phổ khối lượng (LC-MS) có m/z [M+H]+ = 577. Tương ứng với khối lượng của chất là 576 g/mol (C35H60O6). Độ bất bão hòa là  = 6. Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO) kết hợp với phổ DEPT-NMR (Phụ lục 36) cho thấy hợp chất có 35 carbon, trong đó có: 3 carbon bậc IV (gồm 1 >C= và 2 >C<), 14 carbon dạng methin (13 carbon loại >CH– và 1 carbon loại =CH–), 12 carbon dạng methylen (12 carbon loại –CH2–) và 6 carbon dạng methyl (CH3–) (Phụ lục 35). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO), cho thấy 1 nhóm methin olefin ở vị trí δH 5,31 [(1H, d, J = 2,5 Hz, H-6)]. Tại vị trí δH 3,62 [(1H, m, >CH–O–, H-3)] là oxymethin. Ở vùng trường cao δH ppm = 0,69 – 2,50 là proton của các nhóm >CH–, –CH2–, –CH3 bão hòa, đặc trưng của hợp chất sterol. Một phân tử đường glucose liên kết glycosid với phần sterol, các proton trong phân tử đường có các tần số tương ứng tại δH ppm [4,22 (1H, d, J = 7,5 Hz; H-1); 4,21 (1H, dd, J = 3,0 Hz, J = 9,0 Hz, H- 6a); 3,62 (1H, dd, J = 6,0 Hz, J = 12,0 Hz, H-6b); 3,62 (1H, m, H-3); 3,13 (1H, m, H-5); 3,03 (1H, m, H-4); 2,90 (1H, m, H-2). Từ những dữ liệu trên dự đoán hợp chất (5) có khung cơ bản là sterol gắn với một phân tử đường glucose (Phụ lục 34). Từ các kết quả trên dự đoán hợp chất (5) là một sterol và có thể là β-sitosterol 3-O-β- glucopyranosid, tiến hành so sánh với tài liệu tham khảo [88]. Kết quả so sánh các dữ liệu trình bày ở Bảng 3.17. Hợp chất (5) được xác định là daucosterol. Công thức được trình bày ở Hình 3.20. Daucosterol đã được phân lập từ F. indica. Bảng 3.17. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C -NMR hợp chất (5) với daucosterol ( DMSO- d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) Vị trí C Loại carbon Hợp chất (5) (DMSO-d6) Daucosterol (DMSO- d6) [88] H (ppm), (J, Hz) C (ppm) C (ppm) 93 1 –CH2– 36,9 36,8 2 –CH2– 29,4 29,2 3 >CH–OH 3,62 m 76,8 78,6 4 –CH2– 39,0 39,3 5 >C= 140,6 140,4 6 =CH– 5,31 d (2,5) 121,4 121,2 7 –CH2– 31,5 31,4 8 >CH– 31,6 31,3 9 >CH– 49,8 49,6 10 >C< 36,4 36,2 11 –CH2– 20,7 20,6 12 –CH2– 39,2 38,3 13 >C< 42,0 41,8 14 >CH– 56,3 56,1 15 –CH2– 24,0 23,8 16 –CH2– 27,9 27,8 17 >CH– 55,6 55,4 18 –CH3 11,8 11,6 19 –CH3 19,1 19,1 20 >CH– 35,6 35,4 21 –CH3 18,8 18,6 22 –CH2– 33,5 33,3 23 –CH2– 25,6 25,4 24 –CH< 45,3 45,1 25 –CH< 28,9 28,6 26 –CH3 19,2 19,7 27 –CH3 19,9 18,9 28 –CH2– 22,8 22,1 29 –CH3 11,9 11,7 1 –CH< 4,22 (1H, d, J= 7,5 Hz) 100,9 100,7 2 –CH< 2,90 (1H, m) 73,6 73,4 3 –CH< 3,62 (1H, m) 76,9 76,9 4 –CH< 3,03 (1H, m) 70,3 70,0 5 –CH< 3,13 (1H, m) 77,2 76,7 6 –CH2– 4,21 (1H, dd, J= 3,0; J = 9,0) 61,2 62,8 3,62 (1H, dd, J= 6,0; J= 12,0) Hình 3.20. Công thức hợp chất (5) - Daucosterol 94 3.4.3.6. Hợp chất (6): 3α-Acetoxy-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lacton Hợp chất (6) là bột vô định hình, màu trắng, tan trong CHCl3, không tắt quang UV 254 nm, UV 365 nm, cho vết màu tím với thuốc thử VS trên SKLM. Phổ khối lượng (LC-MS) thấy xuất hiện tín hiệu chính có đỉnh m/z [M+Na]+ = 521,3608, tương ứng với khối lượng của chất là 498 g/mol (C32H50O4). Độ bất bảo hòa của hợp chất (6)  = 9 (Phụ lục 37). Phổ 13C NMR kết hợp với phổ HSQC (Phụ lục 39, Phụ lục 40), cho thấy 32 tín hiệu carbon bao gồm hai carbon carboxyl ester (δC 177,1 và 171,2), hai oxymethin (δC 83,6 và 75,1), bốn nhóm methin, mười nhóm methylen, tám nhóm methyl và sáu nguyên tử carbon bậc bốn. Các dữ liệu quang phổ trên chỉ ra rằng hợp chất FRHC12 có khung friedo-oleanan triterpen. Sự hiện diện của nhóm acetoxy tại C-1 được xác định bằng tương quan HMBC của H-3 (δH 4,60) với C-4, C-5 và C-31; H-23 (δH 0,73) với C-3 và C-5; và H-32 (δH 2,01) đến C-31. Phổ 1H NMR và HSQC của FRHC12 cho thấy tám nhóm metyl [sáu bậc ba (δH 0,82, 0,84, 0,92, 0,98, 1,17, 1,19), một thứ cấp (δH 0,73, 3H, d, J = 5,2 Hz), một nhóm acetoxyl (δH 2,01)], và hai nhóm oxymethin (δH 4,60, dt, J = 8,8, 4,8 Hz và 3,96, t, J = 2,4 Hz). Sự hiện diện của vòng lacton giữa C-13 và C-16 được xác định bằng tương quan HMBC của H-16 (δH 3,96) với C-27 (δC 177,1); H-15 (δH 1.85 và 1,79) đến C-13 (δC 51,6), C-16 (δC 83,6), C-17 (δC 36,1), và C-27 (tương quan 4J); H-18 (δH 1,95) đến C-13, C-16 và C-27; và H-28 (δH 1,19) đến C-16, C-17 và C-18 (Hình 3.21). Hình 3.21. Tương quan HMBC của FRHC12 95 Dữ liệu NMR của hớp chất FRHC12 rất giống với dữ liệu của D: A-Friedo-oleanan- 27,16-lacton triterpen được báo cáo trước đây [121], [131]. Các cấu hình tương đối của C-3 và C-16 được xác định bằng cách phân tích các hằng số ghép nối và tương quan NOESY. Hằng số ghép nối nhỏ (J = 2,4 Hz) của H-16 cho biết vị trí xích đạo của nó, trong khi giá trị J lớn (8,8 Hz) của H-3 cho biết vị trí trục của nó. Phát hiện này đã được xác nhận thêm bởi tương quan NOESY giữa H-3/H-23, H-3/H-24, H- 23/H-24, H-24/H-25, H-25/H-26, H-26/H-16 và H-16/H-28 (Hình 3.22). Vì hằng số ghép J của H-3 chẻ mũi ba (triplet) là 8,8 Hz nên phải ghép cặp với H-4 và H-2 ở vị trí trục. Vì vậy H-3 ở vị trí trục hay nhóm OAc ở vị trí xích đạo (Phụ lục 43). Hình 3.22. Tương quan NOESY của hợp chất (6) Bảng 3.18. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR hợp chất (6) (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) Vị trí Loại carbon Hợp chất (6) (CDCl3) H (ppm) (J, Hz) COSY ( 1 H- 1 H) HMBC ( 1 H- 13 C) C (ppm) 1 –CH2– 1,92; 1H; m 1,27; 1H; m 2 21,7 2 –CH2– 2,02; 1H; m 1,24; 1H; m 3 31 32,5 3 >CH– 4,60; 1H; (dt, J = 8,8 và 4,8 Hz) 2; 4 1; 2; 31; 32 75,1 4 >CH– 1,23; 1H; m 3 23 49,7 5 >C< 38,2 6 –CH2– 1,74; 1H; m 1,00; 1H; m 7 8; 10 40,6 7 –CH2– 1,44; 2H; m 6; 8 18,6 8 >CH– 0,83; 1H; m 7 10 57,6 9 >C< 34,7 10 >CH– 0,93; 1H; m 11 9 58,9 96 11 –CH2– 1,71; 1H; m 1,51; 1H; m 10; 12 9; 12 36,2 12 –CH2– 1,60; 1H; m 1,34; 1H; m 11 11; 13 19,4 13 >C< 51,6 14 >C< 38,6 15 –CH2– 1,85; 1H; m 1,79; 1H; m 16 39,6 16 >CH– 3,96; 1H; (t, J = 2,4 Hz) 15 18; 27 83,6 17 >C< 36,1 18 >CH– 1,95; 1H; m 19 16; 27 39,2 19 –CH2– 1,43; 1H; m 1,40; 1H; m 18 31,6 20 >C< 28,1 21 –CH2– 1,16; 1H; m 0,99; 1H; m 22 22 36,6 22 –CH2– 1,95; 1H; m 0,87; 1H; m 21 21 30,2 23 –CH3 0,73; 3H; (d, J = 5,2 Hz) 4; 5; 24 10,0 24 –CH3 0,82; 3H; s 4; 5; 23 18,1 25 –CH3 0,84; 3H; s 18,1 26 –CH3 1,17; 3H; s 20,5 27 =C< 177,1 28 –CH3 1,19; 3H; s 23,5 29 –CH3 0,98; 3H; s 20; 21; 22; 30 30,7 30 –CH3 0,92; 3H; s 20; 21; 22; 29 34,8 31 =C< 171,2 32 –CH3 2,01; 3H; s 31 21,5 Từ những thông tin trên đề nghị hợp chất (6) là 3α-Acetoxy-D:A-friedo- oleanan-27,16α-lacton có cấu trúc như sau: Hình 3.23. Công thức hợp chất (6) 97 Cấu trúc hóa học đã được xác nhận so với dữ liệu báo cáo về các hợp chất liên quan trong tài liệu [131]. Đây là lần đầu tiên dữ liệu 1D- và 2D-NMR hoàn chỉnh của hợp chất (6) được báo cáo với hóa học lập thể tương đối của nó. Hợp chất này trước đây đã được phân lập từ Gynocardia odorata bởi Gosh và cộng sự (2014) nhưng dữ liệu NMR của hợp chất chưa được truy cập [44]. 3.4.3.7. Hợp chất (7): 4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-O-benzoyl-β-D- glucopyranosid Hợp chất (7) dạng bột vô định hình màu trắng, tan trong MeOH. Hợp chất (7) hấp thụ UV ở 254 nm và UV 365 nm và cho màu nâu sẫm với thuốc thử VS trên SKLM.   25 Dα +100 (c 0.1, MeOH). Phổ HR-ESI-MS m/z 427,1029 = [M+Na]+ và xác định công thức C20H20O9 tương ứng với khối lượng mol là 404 g/mol, với độ bất bão hòa  = 11 (Phụ lục 46). Phổ 1H NMR và HSQC (Phụ lục 48, Phụ lục 49) của hợp chất (7) cho thấy một nhóm aldehyd, một vòng benzen (vòng A) [δH 7,96 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,55 (2H, dd, J = 8,5, 7,5 Hz) và 7,70 (1H, t, J = 7,5 Hz)], một nhóm hydroxy, một vòng benzen (vòng B) [δH 7,01 (1H, d, J = 3,0 Hz), 7,15 (1H, d, J = 8,5 Hz) và 6,85 (1H, dd, J = 8,5, 3,0 Hz)], và một đơn vị đường glucose có tín hiệu trong khoảng δH 3,30-5,52. Phổ 13C-NMR ((Phụ lục 48)) kết hợp với phổ DEPT-NMR cho thấy có 18 tín hiệu tương ứng với 20 carbon. Trong đó có 6 carbon bậc 4, một carbon aldehyd (δC 190,0), một carbon carbonyl este (δC 165,4), hai vòng benzen trong khoảng 110-153 ppm và một góc glucose (δC 102,0, carbon anomeric). Có 13 nhóm methine là các nhóm của hai nhân benzene tại δC 133,3 (C-4); 129,1 (C-2 và C-6); 128,7 (C-3 và C-5); 122,8 (C-6); 119,0 (C-5); 111,3 (C-2)] và phân tử đường glucose tại δC [102,0 (C-1); 73,2 (C-2); 76,0 (C-3); 70,0 (C-4); 73,8 (C-5)]. Có 1 nhóm methylen của phân tử đường glucose tại δC 64,1 (C-6). Tất cả dữ liệu quang phổ ở trên chỉ ra hợp chất (7) là một phenolic glycosid. 98 Phổ HMBC (Phụ lục 50) cho thấy mối tương quan của H2-6 của đơn vị glucopyranose và carbon C-7’của vòng benzen A (δC 165,4), cho thấy sự liên kết của vòng C với đơn vị đường bằng liên kết este (Hình 3.24). Hình 3.24. Tương quan HMBC của FRE11 Tương tự, đỉnh chéo HMBC của proton anomeric H-1 và C-4” (δC 152,8) của vòng benzen B xác định liên kết glucosidic của góc glucose và vòng B. Ngoài ra, hydroxy 3” -OH (δH 9,51), điều đó tạo ra mối tương quan HMBC với C-3” (δC 152,8) và C-2” (δC 111,3); và tương quan 4J HMBC tầm xa của proton H-7” với C-3” (Hình 3.24), cũng hỗ trợ đặc điểm cấu trúc của hợp chất (7). Kết hợp các dữ liệu, hợp chất (7) được làm sáng tỏ dưới dạng 4-formyl-2-hydroxyphenyl 6-O-benzoyl-β-D- glucopyranosid. Hợp chất này được tổng hợp từ sự acyl hóa của 4-formyl-2- hydroxyphenyl β-D-glucopyranosid và benzoyl clorua bởi Krohn và Thiem (1977) [10], tuy nhiên đây là một hợp chất tự nhiên mới với phổ 1D- và 2D-NMR hoàn chỉnh. Bảng 3.19. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) của hợp chất (7) Vị trí Loại carbon Hợp chất (7) (DMSO-d6) H (ppm) (J, Hz) COSY ( 1 H- 1 H) HMBC ( 1 H- 13 C) C (ppm) 1 >CH– 4,86 (d, J = 7,5 Hz) 2 4 102,0 2 >CH– 3,30 – 3,40 (m) 1, 3 73,2 3 >CH– 3,30 – 3,40 (m) 2, 4 76,0 4 >CH– 3,30 – 3,40 (m) 3, 5 70,0 5 >CH– 3,75 (m) 4, 6 73,8 6 –CH2– 4,62 (dd, J = 11,5 và 2,0 Hz) 4,31 (dd, J = 11,5 và 7,5 Hz) 5, 6 5, 7 64,1 99 1 =C< 129,6 2 =CH– 7,96 (d, J = 8,5 Hz) 3 3, 4, 5, 7 129,1 3 =CH– 7,55 (dd, J = 8,5 và 7,5 Hz) 2, 4 2, 4, 5 128,7 4 =CH– 7,70 (t, J = 7,5 Hz) 3 133,3 5 =CH– 7,96 (d, J = 8,5 Hz) 6 4, 6, 7 129,1 6 =CH– 7,55 (dd, J = 8,5 và 7,5 Hz) 5 7 128,7 7 =C< 165,4 1 =C< 126,1 2 =CH– 7,01 (d, J = 3,0 Hz) 1, 3, 4, 7 111,3 3 =C< 152,5 4 =C< 152,8 5 =CH– 7,15 (d, J = 8,5 Hz) 6 1, 2, 3, 4, 7 119,0 6 =CH– 6,85 (dd, J = 8,5 và 3,0 Hz) 5 2, 3, 4 122,8 7 –CHO 10,39 (s) 1, 2, 4 190,0 3–OH 9,51 (s) 2, 4, 6 2–OH 5,22 (d, J = 3,5 Hz) 3, 5 3–OH 5,52 (d, J = 4,0 Hz) 2, 4 4–OH 5,37 (d, J = 5,0 Hz) Từ những thông tin trên xác định hợp chất (7) là 4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-O- benzoyl-β-D-glucopyranosid, công thức phân tử C20H20O9 có cấu trúc như sau: Hình 3.25. Cấu trúc hợp chất (7) Hợp chất (7) đã được Krohn và Thiem tổng hợp vào năm 1977 [68], đến nay chưa tìm thấy tài liệu nào khác đề cập hợp chất (7), vì vậy hợp chất (7) là hợp chất tự nhiên mới lần đầu tiên được báo cáo [68]. Dữ liệu đã được kiểm tra trên Schifider vào tháng 11/2021. 3.4.3.8. Hợp chất (8): Acid vanilic 100 Hợp chất (8) là bột màu trắng, tắt quang trên UV 254 nm, không hiện màu với thuốc thử VS. Phổ ESI-MS- cho tín hiệu [M-H]- ở m/z = 166,88. Xác định được công thức phân tử của hợp chất (8) là C8H8O4, khối lượng phân tử là 168 g/mol (Phụ lục 53). Dữ liệu phổ 1H-NMR (Phụ lục 54) cho thấy 1 tín hiệu H ở 12,44 ppm vậy tín hiệu 167,1 ppm, trên phổ 13C-NMR (Phụ lục 55) là tín hiệu của nhóm carbonyl của acid, đồng thời trên phổ 1H-NMR còn cho thấy 1 tín hiệu của nhóm hydroxyl. 6 tín hiệu C còn lại ở vùng tín hiệu của carbon thơm. Vậy cấu trúc của hợp chất (8) được dự đoán có khung chính là 1 vòng thơm với 1 nhóm chức acid, 1 nhóm thế methoxy tại δC 55,5 (-OCH3) và 1 nhóm hydroxyl. So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất (8) và acid vanilic được thể hiện ở Bảng 3.20, xác định hợp chất (8) là acid vanilic có cấu trúc như Hình 3.26. Bảng 3.20. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) của hợp chất (8) và acid vanilic Vị trí C Loại carbon Hợp chất (8) (DMSO-d6, 125/500 MHz) Acid vanilic [16] (DMSO-d6, 125/500 MHz) H (ppm) mult., (J, Hz) C (ppm) H (ppm) mult., (J, Hz) C (ppm) 1 >C= 121,6 121,54 2 =CH– 7,4; 1H; (d, J = 7,5 Hz) 112,7 7,44 112,72 3 >C= 147,2 147,24 4 >C= 151,2 151,12 5 =CH– 6,8; 1H; (d, J = 8,5 Hz) 115,0 6,86 115,05 6 =CH– 7,4; 1H; (d, J = 7,5 Hz) 123,4 7,44 123,51 –COOH 12,44; 1H; s 167,1 12,47 167,26 –CH3 3,8; 3H; s 55,5 3,92 55,55 –OH 9,8 (1H, s, –OH) 9,8 101 s Hình 3.26. Cấu trúc của hợp chất (8) – Acid vanilic 3.4.3.9. Hợp chất (9): Stigmasterol Hợp chất (9) là tinh thể hình kim không màu, không tắt quang dưới UV 254 nm, không phát quang dưới UV 365 nm, trên SKLM cho vết màu tím hồng với thuốc thử VS. Độ bất bão hòa  = 6. Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) kết hợp với phổ DEPT-NMR (Phụ lục 57, Phụ lục 58) cho thấy hợp chất có 29 carbon. Trong đó có 3 carbon bậc bốn (1 carbon loại >C= và 2 carbon loại >CCH– và 3 carbon loại =CH–), 9 carbon methylen và 6 carbon methyl. Một số tín hiện cho thấy ở vùng δC ppm [140,8 (C-5); 121,7 (C-6)] và cặp tín hiệu ở δC ppm [138,3 (C-22); 129,1 (C- 23)] đây là hai liên kết đôi >C=CH– và –HC=CH là cặp tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của khung stigmasta–5,22–diene. Ngoài ra, có đỉnh cộng hưởng ở C-3 (δC 71,8) được cho là carbon mang nhóm hydroxyl. Từ δC 12,3 đến δC 56,9 là các carbon bão hòa. Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) (Phụ lục 56), cho thấy sự hiện diện của proton gắn trên carbon mang nối đôi ở các vị trí δH ppm [5,35 (1H, dd, J = 2,0 Hz và J = 2,0 Hz, H-6); 5,17 (1H, dd, J = 8,5 và 15,1 Hz; H-22); 5,04 (1H, dd, J = 8,5 và 15,1 Hz; H-23)]. Tại vị trí δH ppm [3,53 (1H, m, H-3)] là proton của carbon nối với nhóm hydroxyl. Ở vùng δH ppm = 0,69 – 2,31 là proton của các nhóm >CH–, –CH2–, –CH3 bão hòa, đặc trưng của hợp chất sterol. Từ những dữ liệu trên dự đoán hợp chất (9) có khung cơ bản là sterol mà cụ thể đó chính là khung stigmastan. Dự đoán hợp chất (9) là một sterol và có thể là stigmasterol, tiến hành so sánh với tài liệu tham khảo. Kết quả so sánh các số liệu phù hợp với Bảng 3.21. 102 Bảng 3.21. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6 500 MHz, DMSO-d6 125MHz) của hợp chất (9) với stigmasterol (CDCl3 100 MHz) Vị trí C Loại carbon Hợp chất (9) (DMSO-d6) Stigmasterol [7], [