Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của 3 loài: ngoại mộc tái (Allophylus Livescens Gagnep.), cày ri ta Hạ Long (Chirita Halongensis Kiew& T.H.Nguyen) và an điền lá thông [Oldenlandia Pinifolia (Wall. Ex G.Don) Kuntze] của Vi

(1H, d, J = 11,0 Hz, H-18); 3,70 (2H, d, J = 11,0 Hz, Ha-24); 3,46 (1H, d, J = 11,0 Hz, Hb-24). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 34,4 (C-1); 24,5 (C-2); 71,3 (C-3), 44,0 (C-4); 50,6 (C-5); 19,5 (C-6); 34,6 (C-7); 40,9 (C-8); 48,8 (C-9, C-17); 37,9 (C-10); 25,3 (C-11); 126,9 (C-12); 139,6 (C-13); 43,3 (C-14); 29,2 (C-15); 26,1 (C- 16); 54,4 (C-18); 40,5 (C-19); 40,4 (C-20); 30,7 (C-21); 38,1 (C-22); 22,8 (C-23); 66,32 (C-24); 16,3 (C-25); 17,6 (C-26); 24,1 (C-27); 181,6 (C-28); 17,7 (C-29); 21,6 (C-30). 3.2.2.3. Hợp chất ursolic acid (CH3) Chất bột màu trắng, Rf = 0,5 (CH2Cl2: MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 455,2 [M-H] - , công thức phân tử: C30H48O3 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 2,98 (1H, m, H-3), 5,11 (1H, m, H- 12); 2,09 (1H, d, J = 11,3 Hz, H-18); 0,88 (3H, s, Me-23); 0,66 (3H, s, Me-24); 51 0,85 (3H, s, Me-25); 0,73 (3H, s, Me-26); 1,02 (3H, s, Me-27); 0,79 (3H, d, J = 6,4 Hz, Me-29); 0,89 (3H, d, J = 8,7 Hz, Me-30). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 38,2 (C-1); 26,9 (C-2); 76,9 (C-3); 38,4 (C-4); 54,8 (C-5); 18,0 (C-6); 30,2 (C-7); 39,1 (C-8); 47,0 (C-9); 36,5 (C-10); 23,8 (C-11); 124,6 (C-12); 138,2 (C-13); 41,6 (C-14); 32,7 (C-15); 22,8 (C-16); 46,8 (C-17); 52,4 (C-18); 38,4 (C-19); 38,5 (C-20); 27,5 (C-21); 36,3 (C-22), 28,3 (C-23); 16,9 (C-24); 16,1 (C-25), 15,2 (C-26); 23,3 (C-27); 178,3 (C-28); 17,0 (C- 29); 21,1 (C-30). 3.2.2.4. Hợp chất oleanolic acid (CH4) Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2: MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 455,2 [M-H] - , công thức phân tử: C30H48O3. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 5,27 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12); 3,20 (1H, dd, J = 4,0; 11,0 Hz, H-3); 2,81 (1H, dd, J = 4,0; 13,5 Hz, H-18); 1,12; 0,97; 0,91; 0,90; 0,89; 0,76; 0,74 (mỗi tín hiệu 3H, s, Me-23, 24, 25, 26, 27, 29, 30). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 38,4 (C-1); 27,7 (C-2); 79,1 (C-3); 38,8 (C-4), 55,3 (C-5); 18,3 (C-6); 32,7 (C-7); 39,3 (C-8); 47,7 (C-9); 37,1 (C-10); 23,0 (C-11); 122,7 (C-12); 143,6 (C-13); 41,7 (C-14); 27,2 (C-15); 23,4 (C-16); 46,5 (C-17); 41,1 (C-18); 45,9 (C-19); 30,7 (C-20); 33,8 (C-21); 32,5 (C-22); 28,1 (C-23); 15,6 (C-24); 15,3 (C-25); 17,1 (C-26); 25,9 (C-27); 181,6 (C-28); 33,1 (C- 29); 23,6 (C-30). 3.2.2.5. Hợp chất 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl--D-glucopyranoside (CH5) Chất bột màu vàng nhạt, Rf =0,3 (EtOAc:MeOH:H2O = 4:0,5:0,1). ESI-MS m/z: 315,0 [M-H] - , công thức phân tử C14H20O8. 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,71 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2); 6,69 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5); 6,57 (1H, dd, J = 1,5 & 8,5 Hz, H-6); 2,80 (2H, m, H-α); 3,72 (2H, m, H-β); 4,05 (1H, m, H-β); 4,31 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’); 3,20 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-2’); 3,28 – 3,39 (3H, m, H-3’, 4’, 5’); 3,68 (1H, dd, J = 5,0 & 12,0 Hz, H-6’); 3,88 (1H, dd, J = 1,5 & 12,0 Hz, H-6’). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 131,6 (C-1); 117,1 (C-2); 146,1 (C- 52 3); 144,6 (C-4); 116,3 (C-5); 121,3 (C-6); 36,6 (C-7); 72,1 (C-8); 104,4 (Glc-1); 75,1 (Glc-2); 77,9 (Glc-3); 71,6 (Glc-4); 78,1 (Glc-5); 62,7 (Glc-6). 3.2.2.6. Hợp chất acteoside (CH6) Chất bột màu trắng, Rf =0,56 (CH2Cl2: MeOH: H2O = 3,75:1,0:0,1). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) (Bảng 4.3 và Bảng 4.4). 3.2.2.7. Hợp chất isoacteoside (CH7) Chất bột màu trắng, Rf =0,44 (CH2Cl2: MeOH: H2O = 3,75:1,0:0,1). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) (Bảng 4.3 và Bảng 4.4). 3.2.2.8. Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8) Chất bột màu trắng, Rf =0,56 (CH2Cl2: MeOH: H2O = 3,5:1,0:0,1). (-)-ESI- MS m/z: 461,0 [M-H] - , công thức phân tử: C20H30O12. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): (Bảng 4.3 và Bảng 4.4). 3.2.2.9. Hợp chất -hydroxyacteoside (CH9) Chất bột màu trắng, Rf =0,38 (CH2Cl2: MeOH: H2O = 3,5:1,0:0,5). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): (Bảng 4.3 và Bảng 4.4). 3.2.3. Thử hoạt tính độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được kiểm tra bằng mô hình MTT. Hoạt tính độc tế bào được thử nghiệm tại viện Công nghệ Sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào được trình bày trong phần 4.2.2. 3.3. Tách chiết, phân lập các chất từ cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia) 3.3.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 53 Mẫu cây An điền lá thông (2,1 kg) được sấy khô ở 40 0C, xay nhỏ và ngâm chiết 3 lần với bằng dung môi MeOH 95% ở nhiệt độ phòng Dung môi được cất loại dưới áp suất giảm, phần dịch nước được chiết lần lượt bằng dung môi n- hexane, ethyl acetate và n-butanol. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết tương ứng có khối lượng là 36,2 g; 34,2 g và 32,0 g. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cây An điền lá thông được trình bày ở hình 3.2. + Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane: tiến hành sắc ký cột silica gel 36,2 g cao chiết n-hexane (HPH) với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (100:0→1:1), thu được 10 phân đoạn H1-H10. Phân đoạn H6 (620 mg) được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (85:15), sau đó tiếp tục bằng Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được 12 mg chất HP1. Phân đoạn H7 (150 mg) được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane: EtOAc (15:1), sau đó tiếp tục được tinh chế bằng Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được 5 mg chất HP2. Phân đoạn H10 (410 mg) được phân tách bằng Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được HP3 (6 mg) và HP5 (11mg). + Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate: tiến hành sắc ký cột silica gel 34,2 g cao chiết ethyl acetate (HPE) với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (100:0→1:1), thu được 7 phân đoạn E1-E7. Phân đoạn E2 (4,42 g) được đưa lên cột silica gel, giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được HP6 (30 mg). Phân đoạn E3 (1,62 g) được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được HP7 (200 mg). Phân đoạn E4 (1,15 g) tiếp tục được tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (2:1), sau đó tiếp tục bằng cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được HP4 (10mg). + Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-butanol: cao chiết n-butanol (32 g) được đưa lên cột silica gel, giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH:H2O (9:1:04:1:0,12:1:0,1) thu được 12 phân đoạn (B1-B12). Tinh chế phân đoạn B3 (2,9 g) bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được 3 phân đoạn (B3.1-B3.3). Phân đoạn B3.2 tiếp tục được đưa lên cột sephadex LH-20, dung môi MeOH thu được HP8 (30 mg). Phân đoạn B6 (2,95) được phân 54 tách bằng sắc ký cột sephadex LH-20, dung môi MeOH thu được HP9 (11 mg). Sắc ký cột sephadex LH-20 phân đoạn B12 (1,5 g) với dung môi CH2Cl2: MeOH (1:9) thu được 2 phân đoạn (B12.1-B12.2). Chất HP10 (10 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn B12.2 trên cột sephadex LH-20, dung môi MeOH. Phân đoạn B5 (2,42 g) được đưa lên cột sephadex LH-20, dung môi CH2Cl2: MeOH (1:9) thu được 2 phân đoạn (B5.1-B5.2). Tiếp tục tinh chế phân đoạn B5.2 trên cột sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu được HP11 (16 mg). Phân đoạn B10 (1,5 g) được làm sạch bằng cột sephadex LH-20, dung môi CH2Cl2: MeOH (1:9) thu được 2 phân đoạn (B10.1-B10.2). Tinh chế phân đoạn B10.2 trên cột sephadex LH-20, MeOH thu được HP13 (10 mg). Chất HP12 (10 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn B4 (1,35 g) bằng sắc ký cột Sephadex LH-20, MeOH. Phân đoạn B9 (3,9 g) được phân tách bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được HP14 (40 mg). 55 Hình 3.3 Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây An điền lá thông 1. n-hexane/EtOAc,100/01/1 2. Sephadex LH-20, MeOH Bột khô Oldenlandia pinifolia (2,1 kg) Chiết MeOH 95% (4 x 3,0 L) Dịch tổng Chiết n-hexane HPH (9,0 g) Chiết EtOAc 1. n-hexane/EtOAc, grad. 2. Sephadex LH-20, DCM/MeOH, 1/9 HP1 12 mg HP2 5 mg HP3 6 mg HP5 11 mg HPE (34,2 g) HP6 30 mg HP7 200 mg HP4 10 mg Chiết n-BuOH Dịch nƣớc HPB 32,0 g 1. DCM/MeOH/H2O,4/1/03/1/0,1 2. Sephadex LH-20, MeOH HP8 30 mg HP9 11 mg HP10 10 mg HP11 16 mg HP12 10 mg HP13 10 mg HP14 40 mg 56 3.3.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông 3.3.2.1. Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1) Chất bột màu cam, Rf = 0.45 (n-hexane: CH2Cl2 4:1,v/v).HR-ESI-MS m/z = 269,0464 [M-H]-. Công thức phân tử C15H10O5. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3 + CD3OD); (500 MHz, DMSO-d6,) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3 + CD3OD); (125 MHz, DMSO-d6,)  (ppm) (Bảng 4.6). 3.3.2.2. Hợp chất 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2) Chất bột màu đỏ cam, Rf = 0,52 (n-hexane:EtOAc 4,5:1, v/v). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm) (Bảng 4.7) 3.3.2.3. Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3) Chất bột màu cam, Rf = 0,47 (n-hexane:CHCl3:EtOAc 1,0:1,5:1,0, v/v). (-)- ESI-MS m/z: 253,0 [M-H] - , công thức phân tử C15H10O4. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): H (ppm) 7,61 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-3); 7,55 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-4); 7,44 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5); 7,21 (1H, dd, J = 2,5; 8,5 Hz, H-7); 8,08 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-8); 13,08 (1H, s, 1-OH); 2,27 (3H, s, 2-CH3). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): C (ppm) 159,9 (C-1); 114,6 (C-2); 136,8 (C-3); 118,6 (C-4); 112,5 (C-5); 163,9 (C-6); 121,4 (C-7); 129,8 (C-8); 187,6 (C-9); 181,7 (C-10); 131,1 (C-4a); 124,4 (C-8a); 134,2 (C-9a); 135,6 (C-10a); 15,7 (2-CH3). 3.3.2.4. Hợp chất digiferruginol (HP4) Chất bột, màu vàng da cam, Rf = 0,5 (CH2Cl2: MeOH = 9:1, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 253,0 [M-H] - , công thức phân tử C15H10O4. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 7,77 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-3); 7,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-4); 8,20 (1H, m, H-5); 7,95 (1H, m, H-6); 7,92 (1H, m, H-7); 8,25 (1H, m, H-8); 4,66 (2H, d, J = 5,0 Hz, 2 -CH2OH); 5,46 (1H, t, J = 5,5 Hz, 2- CH2OH); 12,77 (1H, s, 1-OH). 13 C NMR (125 MHz, DMSO): C (ppm) 158,4 (C-1); 138,2 (C-2); 131,3 (C- 3); 118,8 (C-4); 126,8 (C-5); 134,5 (C-6); 135,1 (C-7); 126,6 (C-8); 188,7 (C-9); 181,8 (C-10); 133,6 (C-5a); 133,2 (C-8a); 114,9 (C-9a); 132,8 (C-10a); 57,4 57 (CH2OH). 3.3.2.5. Hợp chất lutein (HP5) Chất bột màu đỏ cam, Rf = 0,44 (n-hexane:EtOAc 3,75:1,25, v/v). (+)-ESI- MS m/z: 569,3 [M+H] + , công thức phân tử: C40H56O2. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm) (Bảng 4.8). 3.3.2.6. Hợp chất ursolic acid (HP6) Chất bột màu trắng, Rf = 0,5 (CH2Cl2:MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 455,2 [M-H] - , công thức phân tử: C30H48O3 3.3.2.7. Hợp chất oleanolic acid (HP7) Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2:MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 455,2 [M-H] - , công thức phân tử: C30H48O3. 3.3.2.8. Hợp chất asperuloside (HP8) Chất bột màu trắng, Rf = 0,54 (CH2Cl2:MeOH:H2O 4,0:1,0:0,1, v/v). ESI-MS m/z: 437,0 [M+Na] + , công thức phân tử: C18H22O11. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm) (Bảng 4.9). 3.3.2.9. Hợp chất deacetyl asperuloside (HP9) Chất bột màu trắng, Rf = 0,67 (CH2Cl2:MeOH 4:1, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 370,9 [M-H] - , công thức phân tử: C16H20O10. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): (Bảng 4.9). 3.3.2.10. Hợp chất asperulosidic acid (HP10) Chất bột màu trắng, Rf = 0,56 (CH2Cl2:MeOH 4:1, v/v). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): (Bảng 4.10). 3.3.2.11. Hợp chất scandoside methyl ester (HP11) Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2:MeOH 4,5:1, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 58 403,0 [M-H] - , công thức phân tử: C17H24O11 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): (Bảng 4.10). 3.3.2.11. Hợp chất afzelin (HP12) Chất bột màu vàng, Rf = 0,51 (CH2Cl2:MeOH 4,25:0,75, v/v). (-)-ESI-MS m/z: 430,9 [M-H] - , công thức phân tử: C21H20O10 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,22 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 7,79 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, 6’); 6,96 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, 5’); 5,40 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1”); 3,73 (1H, dd, J = 3,0; 9,0 Hz, H-2”); 3,36 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-3”); 3,35 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-4”); 4,24 (1H, dd, J = 2,0; 4,0 Hz, H-5”); 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6”) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 159,3 (C-2); 136,2 (C-3); 179,6 (C- 4); 163,2 (C-5); 99,9 (C-6); 166,1 (C-7); 94,8 (C-8); 158,6 (C-9); 105,9 (C-10); 122,7 (C-1’); 131,9 (C-2’, C-6’); 116,5 (C3’, C-5’); 161,6 (C-4’); 103,5 (C-1”); 72,0 (C-2”); 72,2 (C-3”); 73,2 (C-4”); 71,9 (C-5”); 17,6 (C-6”) 3.3.2.13. Hợp chất isorhamnetin-3-O--rutinoside (HP13) Chất bột màu vàng, Rf = 0,63 (CH2Cl2:MeOH:H2O 3,75:1:0,1, v/v). (-)-ESI- MS m/z: 623,2 [M-H] - , công thức phân tử: C28H32O16 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm) (Bảng 4.11). 3.3.2.14. Hợp chất rutin (HP14) Chất bột màu vàng, Rf = 0,4 (CH2Cl2:MeOH:H2O 2,75:1:0,1, v/v). (-)-ESI- MS m/z: 609,2 [M-H] - , 633,1 [M+Na] + công thức phân tử: C27H30O16 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm) (Bảng 4.11). 3.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các chất phân lập từ cây An điền lá thông 3.3.3.1. Thử hoạt tính gây cảm ứng apoptosis 59 Hoạt tính cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào K562 của cao chiết n-butanol và các hợp chất phân lập từ cao chiết này thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 được thử nghiệm tại viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hoạt tính cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào OCI-AML của cao chiết n-butanol thông qua phương pháp nhuộm nuclei bằng propidium iodide và phân tích tế bào theo dòng chảy được thử nghiệm tại trường Đại học Perugia, Italy. Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis được trình bày trong phần 4.3.2.1. 3.3.3.2. Thử hoạt tính độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và các hợp chất phân lập được kiểm tra bằng mô hình MTT. Hoạt tính độc tế bào được thử nghiệm tại viện Công nghệ Sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào được trình bày trong phần 4.3.2.2. 60 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu về cây Ngoại mộc tái 4.1.1. Các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens) Từ cây Ngoại mộc tái, một loài thuộc chi Allophylus lần đầu tiên được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, bằng phương pháp sắc ký cột nhiều lần trên cột silica gel và sephadex LH-20 đã phân lập được 5 hợp chất trong đó có 3 hợp chất từ cao n-hexan, 2 hợp chất từ cao ethyl acetate Sử dụng các phương pháp phổ MS và NMR đã xác định được cấu trúc của 1 diterpene (AL1), 1 flavonoid (AL2), 3 steroid (AL3-AL5) (Hình 4.1). OH 1 3 61012 15 161718 19 20 O OH OH OH OH OH 2 3 45 7 9 10 1' 3' 4' 6' OH 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 GlcO OH 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 AL1 AL2 AL3 AL4 1 3 4 5 10 9 6 7 8 14 11 12 13 15 16 17 18 19 20 21 22 23 25 26 27 24 29 28 AL5 Hình 4.1 Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ lá và cành cây Ngoại mộc tái 4.1.1.1. Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) OH 1 3 61012 15 16171819 20 OH Hình 4.2 Cấu trúc hóa học và một số tương tác chính trên phổ HMBC của AL1 61 Hợp chất AL1 (1,3 g) được phân lập dưới dạng dầu từ cao chiết n-hexane. Phổ khối ESI-MS ion dương cho pic ion giả phân tử ở m/z = 291 [M+H]+ và phân mảnh ở m/z = 273 [M-OH]+. Kết hợp với phổ 1H-, 13C-NMR dự đoán công thức phân tử là C20H34O (M = 290). Hình 4.3. Phổ ESI-MS của AL1 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của AL1 (CDCl3) Phổ 1H-NMR (Bảng 4.1) cho thấy tín hiệu của 6 proton olefinic trong vùng từ 5,05 đến 5,21 ppm, tín hiệu của 5 nhóm methyl ở H 1,27; 1,59; 1,68 (mỗi tín hiệu 3H, s) và 1,60 (s, 6H). Ngoài các tín hiệu trên còn quan sát được 12 proton béo ở vùng H 1,25 – 2,09 ppm. 62 Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của AL1 (CDCl3) Phổ 13C-NMR và DEPT (Bảng 4.1) của AL1 xuất hiện 20 nguyên tử carbon bao gồm 8 carbon olefin tại C 111,6 (C-1); 124,1 (C-10); 124,2 (C-14); 124,4 (C- 6); 131,2 (C-15); 135,0 (C-11); 135,5 (C-7) và 145,1 (C-2), tương ứng với 4 nối đôi. Phổ DEPT xác định có 3 carbon olefin bậc bốn, 4 carbon olefin bậc ba và 1 carbon olefin bậc 2. Một carbon bậc 4 gắn với nguyên tử oxy tại C 73,4 (C-3); 5 nhóm methyl tại C = 16,0; 16,0 17,6; 25,6 và 27,8 cùng với 6 nhóm methylen aliphatic. Hình 4.6. Phổ HMBC của AL1 63 Vị trí của nhóm hydroxyl gắn vào carbon C-3 được khẳng định qua tương tác xa của H-2 (H 5,91); H2-1 (H 5,05; 5,21); H2-4 (H 1,55); H2-5 (H 1,95 – 2,09) và H3-16 (H 1,27) với C-3 (C 73,41) trong phổ HMBC. Các số liệu phổ phân tích trên đây kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [101] xác định chất AL1 là 1,6,10,14- phytatetraene-3-ol hay là geranyl linalool. Việc gán các số liệu phổ 1H và 13C (Bảng 4.1.) của chất AL1 dựa vào việc phân tích phổ 1D-, 2D- NMR và so sánh với tài liệu tham khảo [102]. Giá trị []D = +13,06 (CH2Cl2, c 0,375), phù hợp với số liệu của (+)-(S)- geranyl linalool {[]20D = +18,2 (CHCl3, c 0,06)} trong tài liệu [102]. Chất này đã được phân lập trước đây từ nhiều chi khác nhau như Picea, Laurencia, [103]. Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H-và 13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của chất AL1 C 1H-NMR (H, ppm) 13 C 1H-NMR (H, ppm) 13 C AL1 (S)- geranyl linalool [113, CDCl3] 1 5,21 (d, 17,5) 5,05 (d, 11,0) 111,6 5,21 (bd, 17,3) 5,07 (bd, 10,7) 111,7 2 5,91 (dd, 10,5 & 17,5) 145,1 5,92 (dd, 10,7; 17,3) 145,1 3 - 73,4 - 73,5 4 1,55 (m) 42,1 1,60 - 2,06 (m) 42,1 5 1,95 – 2,09 (m) 22,7 1,60 - 2,06 (m) 22,7 6 5,14 (t, 7,0) 124,4 5,17 (bt, 6,6) 124,4 7 - 135,5 - 135,7 8 1,95 – 2,09 (m) 39,7 1,60 - 2,06 (m) 39,7 9 1,95 – 2,09 (m) 26,5 1,60 - 2,06 (m) 26,6 10 5,11 (t, 6,5) 124,1 5,10 (bt, 6,6) 124,2 11 - 135,0 - 135,6 12 1,95–2,09 (m) 39,7 1,60 - 2,06 (m) 39,7 13 1,95–2,09 (m) 26,7 1,60 - 2,06 (m) 26,8 14 5,11 (t, 6,5) 124,2 5,10 (bt, 6,6) 124,3 15 - 131,2 - 131,2 16 1,68 (s) 25,6 1,68 (s) 25,7 17 1,59 (s) 17,6 1,56 (s) 17,7 18 1,27 (s) 27,8 1,28 (s) 27,9 19 1,60 (s), 6H, 2xCH3 16,0 1,59 (s) 16,0 20 16,0 1,60 (s) 16,0 64 4.1.1.2. Hợp chất catechin (AL2) O OH OH OH OH OH 2 3 45 7 9 10 1' 3' 4' 6' Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của AL2 Hợp chất AL2 thu được dưới dạng bột màu vàng sẫm từ cao chiết ethylacetat. Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 proton vòng thơm ở vị trí meta với nhau tại H 5,88 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-6); 5,96 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8 và các tín hiệu của một vòng thơm kiểu ABX tại H 6,86 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2’); 6,79 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5’), 6,74 (1H, dd, J = 8,1; 1,9 Hz, H-6’) Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của hai nhóm oxy-methine tại H 4,60 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), và 4,00 (1H, m, H-3); một nhóm methylen tại 2,53 (1H, dd, J = 16,0; 8,1 Hz, H-4a); 2,87 (1H, dd, J = 16,0; 5,4 Hz, H-4b). 65 Hình 4.8. Phổ 13C-NMR của AL2 Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử carbon gồm 2 nhóm oxymethine tại C 82,8 và 68,8, phù hợp với vị trí C-2 và C-3 của khung 3- hydroxyflavan, 1 nhóm methylen tại C 28,5; 5 nhóm methine trong vùng 95,5 đến 120,0 ppm và 7 carbon bậc 4. So sánh các dữ kiện phổ của hợp chất AL2 với các dữ kiện phổ của chất catechin [104] thấy có sự phù hợp hoàn toàn. Catechin là một flavonoid rất phổ biến trong giới thực vật, có hoạt tính oxi hóa mạnh [104]. 4.1.1.3. Hợp chất stigmasterol và -sitosterol (AL3 và AL4) OH 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 OH 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 AL3 AL4 Chất AL3 và AL4 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H- NMR của AL3 và AL4 cho biết đây là hỗn hợp của stigmasterol và -sitosterol theo tỉ lệ 3:7, tương ứng Điều này được chứng minh qua các tín hiệu sau: hai tín hiệu ở H = 5,34 (m) và H = 3,51 (m) có cường độ (integral) tương đương 1 proton là tín 66 hiệu H-5 và H-3, tương ứng, của chất AL3 và AL4; tín hiệu ở H = 5,15 (dd, J = 8,5; 15,0 Hz) và 5,01 (dd, J = 8,5; 15,0) với integral tương đương 0,3 H là tín hiệu H-20 và H-21 của stigmasterol. Bên cạnh đó, tín hiệu 6 nhóm methyl của mỗi chất AL3 và AL4 cũng được quan sát thấy trên phổ, chúng gồm có 2 tín hiệu singlet của nhóm methyl bậc ba (CH3-28, CH3-29), 3 tín hiệu doublet của nhóm methyl bậc hai (CH3-19, CH3-26, CH3-27) và 1 tín hiệu triplet của nhóm methyl bậc một (CH3-24). Các số liệu phổ của chất AL3 và AL4 (mục 3.1.2.3 và 3.1.2.4) phân tích trên đây hoàn toàn phù hợp với số liệu trong tài liệu [105]. Stigmasterol và -sitosterol là 2 phytosterol tồn tại rất phổ biến trong thực vật, cấu trúc của chúng chỉ khác nhau ở một nối đôi nên khó tách từng chất riêng biệt, thường chúng được phân lập dưới dạng hỗn hợp với các tỉ lệ khác nhau. 4.1.1.4. Hợp chất -sitosterol glucoside (AL5) GlcO 1 3 4 5 10 9 6 7 8 14 11 12 13 15 16 17 18 19 20 21 22 23 25 26 27 24 29 28 Hợp chất AL5 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng, có Rf 0,5 với hệ dung môi DCM:MeOH (95/5, v/v) được xác định là -sitosterol glucoside, khi so sánh với chất chuẩn trên sắc ký lớp mỏng. -Sitosterol glucoside là một steroid tồn tại phổ biến trong giới thực vật. Các hợp chất catechin, stigmasterol, -sitosterol và -sitosterol glucoside là các hợp chất rất phổ biến trong giới thực vật và có nhiều công bố về hoạt tính sinh học nên chúng tôi chỉ thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất AL1 (geranyl linalool). 4.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của AL1 được phân lập từ cây Ngoại mộc tái Hợp chất AL1 (geranyl linalool) được tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của Likhiwitayawuid [106] và Skehan [107] trên các dòng tế bào ung thư ở người: Ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU- 1), ung thư vú (MCF-7), ung thư da (SK-Mel-2). Kết quả cho thấy chất AL1 không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Bảng 4.2). 67 Bảng 4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất AL1 STT Tên mẫu Giá trị IC50 (g/mL) trên các dòng tế bào KB HepG2 MCF7 LU-1 SK-Mel-2 1 AL1 >128 >128 >128 >128 >128 Ellipticine 0,40 0,41 0,48 0,45 0,45 Kết luận: Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Ngoại mộc tái được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới Từ cây Ngoại mộc tái đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 5 hợp chất gồm 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1), catechin (AL2), stigmasterol (AL3), β-sitosterol (AL4) và β-sitosterol glucoside (AL5) trong đó hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) và catechin (AL2) lần đầu tiên được phân lập từ chi Allophylus. Geranyl linalool (AL1) thể hiện kết quả âm tính khi thử hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư ở người (KB, HepG2, LU-1, MCF-7, SK-Mel-2). 4.2. Các nghiên cứu về cây Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis) 4.2.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được Từ cây Cày ri ta Hạ long, một loài thuộc chi Chirita, lần đầu tiên được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Bằng phương pháp sắc ký cột đã phân lập được 9 hợp chất trong đó từ cao n-hexane thu được 2 hợp chất, cao ethyl acetate thu được 2 hợp chất, cao n-butanol thu được 5 hợp chất. Sử dụng các phương pháp phổ MS và NMR đã xác định được cấu trúc của chúng là 1 anthraquinone (CH1), 3 triterpenoid (CH2-CH4), 5 phenylethanoid glycoside (CH5-CH9) (Hình 4.56) 68 O O OH 1 2 45 6 8 9 10 7 8a 9a 10a 4a CH1 3 CH2 R1 = -OH, R2 = R3 = CH3, R 4 = H, R 5 = CH2OH CH3 R1 = -OH, R 2 = R 3 = R5 = CH3, R 4 = H CH4 R1 = -OH, R 3 = H, R 2 = R4 = R 5 = CH3 COOH R 5 R 2 R 3 R 1 R 4 1 3 5 7 9 11 12 14 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 O OH OH OH O OH OH OH 1 3 4 CH5 O OH OH OR1 O OH O OR2 O OH OH OH R3 1"' 1" 1 3 4 CH6 R1 = Caffeoyl, R2 = R3 = H CH7 R2 = Caffeoyl, R1 = R3 = H CH8 R1 = R 2 = R3 = H CH6 R1 = Caffeoyl, R2 = H, R3 = OH Hình 4.9. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây Cày ri ta Hạ long 4.2.1.1. Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1) O O CH3OH 1 2 45 6 8 9 10 7 8a 9a 10a 4a 3 O O CH3OH HMBC Hình 4.10 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của CH1 Hình 4.11 Phổ 1H-NMR của CH1 (CD3OD) 69 Chất CH1 được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng từ cao chiết n- butanol. Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của anthraquinone gồm tín hiệu các proton vòng thơm tương tác kiểu ABX: 3 proton tại δH 8,07 (br s, H-1), 7,68 (dd, J = 1,0 & 8,0 Hz, H-3); 8,16 (d