Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (carica papaya l.)

LỜI CAM ĐOAN . i

LỜI CẢM ƠN. ii

MỤC LỤC. iii

TRANG THÔNG TIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ. vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT . viii

DANH MỤC CÁC BẢNG . xi

DANH MỤC CÁC HÌNH . xiii

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC.xv

MỞ ĐẦU .1

1. Đ t vấn đ .1

2. M c đ ch nghiên cứu .2

3. Đối tượng và ph m vi nghiên cứu .2

4. Nội dung nghiên cứu .3

5. Phương pháp nghiên cứu .3

6. ngh a khoa học và thực ti n của nghiên cứu.3

7. Những đóng góp mới của luận án.4

8. Cấu trúc của luận án .4

CHưƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.5

1.1. Giới thiệu v cây đu đủ .5

1.2. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ .6

1.2.1. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ trong nước.7

1.2.2. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ trên thế

giới .8

1.3. Tình hình nghiên cứu v ho t tính sinh học của cây đu đủ.15

1.3.1. Tác d ng trị giun sán .15

1.3.2. Tác d ng h huyết áp.16

1.3.3. Tác d ng kháng sinh, kháng nấm .16

1.3.4. Tác d ng trị u bướu, ung thư .17

1.3.5. Tác d ng chống oxy hóa.25

1.3.6. Các tác d ng dược l khác.26

1.4. Giới thiệu v enzyme tyrosinase .27

1.4.1. Khái niệm và vai trò của enzyme tyrosinase.27

1.4.2. Các chất ức chế enzyme tyrosinase .28

CHưƠNG 2. ĐỐI TưỢNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHI N CỨU .30

2.1. Đối tượng nghiên cứu.30

2.2. Hóa chất, d ng c và thiết bị.31

2.3. Phương pháp nghiên cứu.31

pdf147 trang | Chia sẻ: honganh20 | Ngày: 16/02/2022 | Lượt xem: 462 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (carica papaya l.), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Phân đo n CPET1 (2,0 g) được cho lên cột sắc k silica gel pha đảo, rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (3/2, v/v) thu được hợp chất CPE1 (40 mg). Phân đo n CPET2 (2,4 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo, rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (1,3/1, v/v) thu được hai phân đo n CPET2A (60 mg) và CPET2B (820 mg). Hợp chất CPE2 (18 mg) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) từ phân đo n CPET2A (60 mg). Phân đo n CPET3 (1,6 g) được cho lên cột sắc ký silica gel pha đảo, rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (1,2/1, v/v) thu được hai phân đo n CPET3A (25 mg) và CPET3B (37 mg). Phân đo n CPET3A (25 mg) được tinh chế qua cột 43 Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) thu được hợp chất CPE3 (11 mg). Hợp chất CPE4 (9,2 mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH- 20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) từ phân đo n CPET3B (37 mg). Phân đo n CPET4 (6,2 g) được cho lên cột sắc ký silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v) thu được hai phân đo n CPET4A (300 mg) và CPET4B (410 mg). Phân đo n CPET4A (300 mg) được tinh chế tiếp qua cột silica gel với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước (3/1/0,2, v/v/v) thu được hai phân đo n CPET4A1 (58 mg) và CPET4A2 (42 mg). Phân đo n CPET4A1 (58 mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) thu được hợp chất CPE5 (9,0 mg). Hợp chất CPE6 (8,1 mg) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v) từ phân đo n CPET4A2 (42 mg). Phân tách phân đo n CPET4B (410 mg) trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước (3,5/1/0,15, v/v/v) thu được hai phân đo n CPET4B1 (62 mg) và CPET4B2 (71 mg). Phân đo n CPET4B1 (62 mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) thu được hợp chất CPE7 (9,6 mg). Hợp chất CPE8 (8,7 mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v) từ phân đo n CPET4B2 (71 mg) (Hình 3.4 và Bảng 3.3). Bảng 3.3. Các loại silica gel và hệ dung môi sử dụng trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.4 Pha t nh Pha động (1) Silica gel Gradient CH2Cl2-MeOH (50:1→1:1, v/v) (2) YMC RP-18 MeOH-H2O (3:2, v/v) (3) YMC RP-18 MeOH-H2O (1,3:1, v/v) (4) YMC RP-18 MeOH-H2O (1,2:1, v/v) (5) YMC RP-18 MeOH-H2O (1:1, v/v) (6) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v) (7) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v) (8) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v) (9) Silica gel CH2Cl2-MeOH-H2O (3:1:0,2, v/v) (10) Silica gel CH2Cl2-MeOH-H2O (3,5:1:0,15, v/v) (11) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v) (12) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v) (13) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v) (14) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v) 44 Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate của hoa cây đu đủ đực CPET (20 g) CPET1 (2,0 g) CPET2 (2,4 g) CPET3 (1,6 g) CPET4 (6,2 g) CPET5 (4,4 g) (2) (5) (1) CPE1 (40 mg) CPET2A (60 mg) CPET2B (820 mg) CPET4A (300 mg) CPET4B (410 mg) (3) CPET3A (25 mg) CPET3B (37 mg) (4) (6) CPE2 (18 mg) (7) CPE3 (11 mg) (8) CPE4 (9,2 mg) CPET4A1 (58 mg) CPET4A2 (42 mg) (11) CPE5 (9 mg) (12) CPE6 (8,1 mg) CPET4B1 (62 mg) CPET4B2 (71 mg) (13) CPE7 (9,6 mg) (14) CPE8 (8,7 mg) (9) (10) 45 3.2.2. Phân lập các hợp ch t từ lá cây đ đ đ c a. Chuẩn bị các cao chiết Bột lá cây đu đủ đực (5,0 kg) được ngâm chiết siêu âm với methanol (5 lít x 3 lần, 50oC, 30 phút). Dịch methanol được lọc qua giấy lọc nhi u lần, gom l i và đem cất lo i dung môi dưới áp suất thấp thu được 500 g cao chiết methanol. Cao chiết này sau đó được hòa tan với nước cất rồi tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane (5 lít x 2 lần) và chloroform (4 lít x 2 lần). Các dịch chiết này được đem cất lo i dung môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết tương ứng n- hexane (CPLH, 185 g) và chloroform (CPLC, 74 g) (Hình 3.5). Hình 3.5. Sơ đồ tạo các cao chiết từ lá cây đu đủ đực b. Quá trình phân lập các hợp chất  Phân lập các hợp chất từ cao chloroform (CPLC) Cao chiết chloroform (CPLC, 74 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu chloroform, sau đó tẩm với 250 g silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô. Tiến hành phân tách hỗn hợp này bằng cột silica gel pha thường, rửa giải gradient bằng hệ dung môi n-hexane/acetone (50:1 → 1:1, v/v) thu được 12 phân đo n ký hiệu từ CPLC1 tới CPLC12. Phân đo n CPLC5 (5,0 g) được cho lên cột sắc ký silica gel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (5/1, v/v) thu được 4 phân đo n nhỏ ký hiệu từ CPLC5A đến CPLC5D. Tinh chế phân đo n CPLC5A (30 mg) bằng dung môi acetone thu được hợp chất CPL-C1 (12 mg). 1. Ngâm chiết siêu âm bằng methanol (5 lít x 3) 2. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp 1. Bổ sung nước cất (3 lít) 2. Chiết phân bố lần lượt với n-hexane (5 lít x 2) và chloroform (4 lít x 2) 3. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp Bột lá cây đu đủ đực (5,0 kg) Cao methanol (500 g) CPLH (185 g) Cao n-hexane CPLC (74 g) Cao chloroform 46 Phân đo n CPLC8 (3,5 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (20/1, v/v) thu được 5 phân đo n nhỏ ký hiệu từ CPLC8A đến CPLC8E. Hợp chất CPL-C2 (17 mg) được tinh chế bằng dung môi acetone từ phân đo n CPLC8C (55 mg). Phân đo n CPLC12 (1,2 g) được tinh chế trên cột sắc k silica gel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (10/1, v/v) thu được hợp chất CPL-C3 (4 mg) và 3 phân đo n nhỏ ký hiệu từ CPLC12A đến CPLC12C. Phân đo n CPLC12C (0,2 g) được phân tách trên cột sắc k silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là chloroform/acetone (15/1) thu được hợp chất CPL-C4 (20 mg) (Hình 3.6 và Bảng 3.4). Bảng 3.4. Các loại silica gel và hệ dung môi sử dụng trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.6 Pha t nh Pha động (1) Silica gel Gradient n-hexane-acetone (50:1→1:1, v/v) (2) Silica gel n-hexane-acetone (5:1, v/v) (3) Silica gel n-hexane-acetone (20:1, v/v) (4) Silica gel n-hexane-acetone (10:1, v/v) (5) Tinh chế Acetone (6) Tinh chế Acetone (7) Silica gel Chloroform/acetone (15:1, v/v) 3.3. Tính chất vật lý và dữ iện phổ của các hợp chất Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ hoa và lá cây đu đủ đực được quan sát, xác định theo phương pháp đã mô tả ở m c 2.3.4. 3.3.1. Hợp ch t 1 (C1): Rutin Tinh thể hình kim, màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: 190-193oC Công thức phân tử C27H30O16, M = 610 ESI-MS: m/z 633,1 [M+Na] + 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.2, Ph l c 1 3.3.2. Hợp ch t 2 (C2): Acid gallic Tinh thể hình kim, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 236-238oC Công thức phân tử C7H6O5, M = 170 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.3, Ph l c 2 47 Hình 3.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chloroform của lá cây đu đủ đực CPLC12C CPLC (74 g) CPLC1-CPLC4 (1) CPLC5 (5,0 g) CPLC6-CPLC7 CPLC12 (1,2 g) CPLC5A (30 mg) CPLC5B CPLC5C CPLC5D CPL-C1 (12 mg) CPLC8B CPLC8C (55 mg) CPLC8D CPLC8E CPL-C2 (17 mg) CPLC8A CPLC8 (3,5 g) (2) (3) (5) (6) CPLC9-CPLC11 CPL-C3 (4 mg) CPL-C4 (20 mg) (4) CPLC12A CPLC12B (0,2 g) (7) 48 3.3.3. Hợp ch t 3 (C3): Daucosterol Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 283-286oC Công thức phân tử C35H60O6, M = 576 ESI-MS: m/z 397,3 [M-C6H12O6+H] + 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.4, Ph l c 3 3.3.4. Hợp ch t 4 (CP1): 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2- carbaldehyde (Hợp ch t l đ u phân lập từ nguồn t nhiên) Chất dầu, không màu Công thức phân tử C13H13NO2, M = 215 HR-ESI-MS: m/z 238,0842 [M+Na] + Tính toán lý thuyết cho công thức C13H13NO2Na: 238,0844 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.5 3.3.5. Hợp ch t 5 (CP3): Vitexoid Chất dầu, không màu Công thức phân tử C10H16O3, M = 184 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.6, Ph l c 4 3.3.6. Hợp ch t 6 (CP4): Lariciresinol Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 165-168oC Công thức phân tử C20H24O6, M = 360 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.7, Ph l c 5 3.3.7. Hợp ch t 7 (CP5): Dehydrodiconiferyl alcohol Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 141-142oC Công thức phân tử C20H22O6, M = 358 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.8, Ph l c 6 3.3.8. Hợp ch t 8 (CP6): Benzyl-O--D-glucopyranoside Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 121-122oC Công thức phân tử C13H18O6, M = 270 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.9, Ph l c 7 3.3.9. Hợp ch t 9 (CP9): 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid Chất dầu, không màu Công thức phân tử C10H16O3, M = 184 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.10, Ph l c 8 49 3.3.10. Hợp ch t 10 (CP10): 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid Chất dầu, không màu Công thức phân tử C10H18O3, M = 186 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.11, Ph l c 9 3.3.11. Hợp ch t 11 (CP14): 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol Chất dầu, không màu Công thức phân tử C10H18O2, M = 170 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.12, Ph l c 10 3.3.12. Hợp ch t 12 (CP11): Hỗn hợp 2 ch t 3-hydroxy-3-methyl-5- hexanolide và leucine Chất dầu, không màu Hợp chất 12.1 (CP11.1): 3-hydroxy-3-methyl-5-hexanolid Công thức phân tử C6H10O3, M = 130 HR-ESI-MS: m/z 131,0709 [M+H] + Tính toán lý thuyết cho công thức C6H11O3: 131,0708 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.13.1, Ph l c 11 Hợp chất 12.2 (CP11.2): Leucine Công thức phân tử C6H13NO2, M = 131 HR-ESI-MS: m/z 130,1649 [M-H] - Tính toán lý thuyết cho công thức C6H12NO2: 130,1650 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.13.2, Ph l c 11 3.3.13. Hợp ch t 13 (CP12A): Caricapapayol (Hợp ch t mới) Chất bột, màu vàng Công thức phân tử C29H34O4, M = 446 HR-ESI-MS: m/z 447,2526 [M+H] + Tính toán lý thuyết cho công thức C29H35O4: 447,2535 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.14 3.3.14. Hợp ch t 14 (CP17A): Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (Hợp ch t mới) Chất bột, màu trắng Công thức phân tử C20H38O5, M = 358 HR-ESI-MS: m/z 357,8369 [M-H] - Tính toán lý thuyết cho công thức C20H37O5: 357,2641 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.15 3.3.15. Hợp ch t 15 (CP19): Indole-3-aldehyde Tinh thể hình kim, màu vàng Công thức phân tử C9H7NO, M = 145 HR-ESI-MS: m/z 146,1657 [M] + 50 Tính toán lý thuyết cho công thức C9H7NO: 146,1659 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.16, Ph l c 12 3.3.16. Hợp ch t 16 (CP20): 3β 7α-dihydroxycholest-5-ene Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 188-189oC Công thức phân tử C27H46O2, M = 402 ESI-MS: m/z 367,3 [M+H-2H2O] + 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.17, Ph l c 13 3.3.17. Hợp ch t 17 (CP21): Cholest-5-ene-3β 7β-diol Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 178-179oC Công thức phân tử C27H46O2, M = 402 ESI-MS: m/z 367,3 [M+H-2H2O] + 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.18, Ph l c 14 3.3.18. Hợp ch t 18 (CP22): Saringosterol Tinh thể hình kim, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 160-161oC Công thức phân tử C29H48O2, M = 428 HR-ESI-MS: m/z 439,3651 [M+Na] + Tính toán lý thuyết cho công thức C29H48NaO2: 416,3654 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.19, Ph l c 15 3.3.19. Hợp ch t 19 (CPE1): Kaempferol Chất bột, màu vàng sẫm Nhiệt độ nóng chảy: 275-277oC Công thức phân tử C15H10O6, M = 286 ESI-MS: m/z 287,14 [M+H] + 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.20, Ph l c 16 3.3.20. Hợp ch t 20 (CPE5): Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside Chất bột, màu vàng nh t Nhiệt độ nóng chảy: 172-175oC Công thức phân tử C21H20O10, M = 432 ESI-MS: m/z 433,46 [M+H] + 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.21, Ph l c 17 3.3.21. Hợp ch t 21 (CPE4): Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside Chất bột, màu vàng sẫm Nhiệt độ nóng chảy: 223-229oC Công thức phân tử C21H20O11, M = 448 ESI-MS: m/z 447,42 [M-H] - 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.22, Ph l c 18 51 3.3.22. Hợp ch t 22 (CPE7): Kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside Chất bột, màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: 204-209oC Công thức phân tử C20H18O10, M = 418 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.23, Ph l c 19 3.3.23. Hợp ch t 23 (CPE2): Quercetin Chất bột, màu vàng sẫm Nhiệt độ nóng chảy: 314-316oC Công thức phân tử C15H10O7, M = 302 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.24, Ph l c 20 3.3.24. Hợp ch t 24 (CPE3): Quercitrin Chất bột, màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: 174-177oC Công thức phân tử C21H20O11, M = 448 ESI-MS: m/z 447,36 [M-H] - 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.25, Ph l c 21 3.3.25. Hợp ch t 25 (CPE6): Quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside Chất bột, màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: 232-238oC Công thức phân tử C21H20O12, M = 464 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.26, Ph l c 22 3.3.26. Hợp ch t 26 (CPE8): Myricitrin Chất bột, màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: 205-207oC Công thức phân tử C21H20O12, M = 464 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.27, Ph l c 23 3.3.27. Hợp ch t 27 (CPL-C1): Tetratriacontanyl palmitate Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 67-71oC Công thức phân tử C50H100O2, M = 732 ESI-MS: m/z 713,47 [M-H-H2O] - , 767,53 [M-H+2H2O] - 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-16); 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-34′); 1,26 (m); 1,61 (2H, m, H-3); 2,28 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2); 4,05 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1′): Ph l c 24 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 174,0 (C-1); 64,4 (C-1′); 14,1 (C-16); 14,1 (C-34′); 34,4-22,7: Ph l c 24 52 3.3.28. Hợp ch t 28 (CPL-C2): 1-hentriacontanol Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 85-89oC Công thức phân tử C31H64O, M = 452 ESI-MS: m/z 453,34 [M+H] + 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-31); 1,26 (m); 1,56 (2H, m, H-30); 3,64 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1): Ph l c 25 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 63,1 (C-1); 14,1 (C-31); 32,8-22,7: Ph l c 25 3.3.29. Hợp ch t 29 (CPL-C3): Vanillin Chất bột, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 82-84oC Công thức phân tử C8H8O3, M = 152 ESI-MS: m/z 175,0 [M+Na] + 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.28, Ph l c 26 3.3.30. Hợp ch t 30 (CPL-C4): Stigmasterol Tinh thể hình kim, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 169-172oC Công thức phân tử C29H48O, M = 412 ESI-MS: m/z 395,3 [M-H2O+H] + 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.29, Ph l c 27 3.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất Ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập từ hoa và lá cây đu đủ đực được thử nghiệm trên ba dòng tế bào ung thư phổi ở người (A549), ung thư vú ở người (MCF-7) và ung thư gan ở người (Hep3B) theo phương pháp đã mô tả ở m c 2.3.5. Hợp chất C2, CP12A và CPL-C3 không đưa vào thử nghiệm do lượng mẫu không đủ. Hợp chất C1, C3 và CPL-C4 có cấu trúc quen thuộc và đã được nghiên cứu nhi u nên không đưa vào thử nghiệm. Quá trình thử nghiệm ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất được thực hiện t i phòng thử nghiệm Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 53 3.5. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cao methanol và các hợp chất Ho t t nh ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao methanol và các hợp chất phân lập từ hoa cây đu đủ đực được thử nghiệm theo phương pháp đã mô tả ở m c 2.3.6. Các hợp chất phân lập từ cao chloroform lá cây đu đủ đực và các cao chloroform, ethyl acetate từ hoa cây đu đủ đực không đưa vào thử nghiệm. Các hợp chất CP11, CP17A, CP19, CP20, CP21 và CP22 phân lập từ cao dichloromethane của hoa cây đu đủ đực không đưa vào thử nghiệm do lượng mẫu không đủ. Quá trình thử nghiệm ho t tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao methanol và các hợp chất được thực hiện t i phòng thử nghiệm Sinh học – Khoa Dược – Đ i học Yonsei – Hàn Quốc. 54 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các cao chiết Kết quả đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết n- hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực trên ba dòng tế bào ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 được trình bày ở Bảng 4.1. Kết quả thu được cho thấy các cao chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực đ u có khả năng ức chế sự phát triển của ba dòng tế bào ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 với các mức độ khác nhau. Trong đó, cao chloroform của cả hoa và lá cây đu đủ đực thể hiện ho t t nh gây độc tế bào tốt hơn trên cả ba dòng tế bào ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 với tỷ lệ tế bào sống sót trong khoảng 15,49±1,65 đến 46,81±3,75% ở nồng độ 100 µg/mL và 44,64±2,21 đến 45,18±2,62% ở nồng độ 30 µg/mL. Đồng thời, kết quả thu được ở cao chloroform cũng cho thấy lá cây đu đủ đực có khả năng ức chế tốt sự phát triển của hai dòng tế bào ung thư ở người Hep3B (CS % = 15,49±1,65% ở nồng độ 100 µg/mL), MCF-7 (CS % = 27,33±2,49% ở nồng độ 100 µg/mL) và có khả năng ức chế yếu hơn trên dòng tế bào ung thư ở người A549 (CS % = 55,28±2,80% ở nồng độ 100 µg/mL) so với hoa cây đu đủ đực (CS % = 46,81±3,75%; 38,24±1,60; 35,76±2,50% tương ứng với các dòng tế bào ung thư ở người Hep3B, MCF-7, A549). M t khác, dựa vào kết quả này cho ph p dự đoán dung môi dichloromethane cũng là một dung môi chiết tốt các hợp chất từ hoa và lá cây đu đủ đực, tương tự dung môi chloroform. Dự đoán này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Hà khi tham khảo tài liệu [5]. Đây là cơ sở để định hướng lựa chọn cho các nghiên cứu v thành phần hóa học. Như vậy, dựa vào kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực trên ba dòng tế bào ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 cũng như việc khảo sát thăm dò các cao chiết trên sắc ký bản mỏng cùng các thuốc thử đặc trưng và tham khảo tài liệu [5], chúng tôi đã lựa chọn các cao chiết chloroform, dichloromethane, ethyl acetate từ hoa cây đu đủ đực và cao chiết chloroform từ lá cây đu đủ đực để tiến hành phân lập các hợp chất. 55 Bảng 4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các cao chiết Mẫu Nồng độ (µg/mL) Tỷ lệ tế bào sống sót (CS %) A549 Hep3B MCF-7 Bộ phận cây đu đủ đực Hoa Lá Hoa Lá Hoa Lá CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số Control 100,00 2,40 100,00 1,29 100,00 1,89 100,00 2,64 100,00 3,76 100,00 1,93 Cao n-hexane 30 58,67 2,56 62,47 2,69 59,70 2,24 59,94 2,27 56,11 2,06 65,01 1,21 100 29,69 1,73 57,93 2,36 50,53 0,70 49,72 2,06 54,11 1,92 56,29 2,29 Cao chloroform 30 56,30 0,62 59,58 2,55 59,70 1,50 45,18 2,62 70,42 1,49 44,64 2,21 100 35,76 2,50 55,28 2,80 46,81 3,75 15,49 1,65 38,24 1,60 27,33 2,49 Cao ethyl acetate 30 89,57 3,65 78,81 0,98 90,21 3,91 79,47 1,47 57,60 1,56 72,05 2,38 100 69,80 0,59 54,04 1,34 63,47 2,28 66,56 2,25 55,88 0,18 71,21 2,27 Camptothecin 0,5 (0,1) 76,00 2,27 55,66 2,49 48,73 1,35 54,27 2,01 62,82 2,10 56,25 1,97 10 41,77 1,25 35,74 0,77 28,27 2,64 22,64 0,67 42,66 2,08 44,84 0,22 56 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 4.2.1. Hợp ch t 1 (C1): Rutin Hợp chất C1 được phân lập dưới d ng tinh thể hình kim màu vàng, điểm nóng chảy 190-193oC. Trên phổ ESI-MS của C1 cho thấy sự xuất hiện pic ion giả phân tử t i m/z 633,1 [M+Na]+ nên có thể đ nghị CTPT của hợp chất này là C27H30O16. O O OH OH HO 2 10 9 4 3 5' 3' 6' 2' 4' 1' 5 8 6 7 O OH O HO OH OH O O H3C HO HO OH 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 1''' 2'''3'''4''' 5''' 6''' O O OH OH HO O OH O HO OH OH O O H3C HO HO OH (a) (b) Hình 4.1. Cấu trúc hóa học (a) và tƣơng tác HMBC chính (b) của hợp chất C1 Phổ 1H-NMR của C1 cho thấy sự xuất hiện hai tín hiệu doublet của proton vòng A t i δH 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và ba tín hiệu doublet khác t i δH 7,69 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2′); 6,89 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- 5′); 7,65 (dd, J = 8,0; 2,5 Hz, H-6′) của vòng B thế 1, 3, 4. Đi u này chứng tỏ cấu trúc phần aglycon của hợp chất C1 là quercetin. Phổ 13C-NMR của C1 xuất hiện tín hiệu 15 nguyên tử carbon của khung flavonoid, bao gồm 5 carbon nhóm CH vùng thơm (δC nằm trong vùng từ 94,9 đến 123,5), 1 carbon của nhóm carbonyl (δC 179,4) và 9 carbon bậc 4. Tín hiệu cộng hưởng của các nhóm CH nằm trong vùng δH 3,25-3,83 trên phổ 1 H-NMR và δC 68,5-78,1 trên phổ 13C-NMR cùng với sự xuất hiện hai tín hiệu doublet của 2 proton anomer t i δH 4,54 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1′′′); 5,12 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′′) và các tín hiệu của nhóm methyl, methylene ở δC 17,8; 68,5 trên phổ HSQC cho thấy trong cấu trúc của C1 có chứa hai gốc đường α-L-rhamnopyranosyl và β-D- glucopyranosyl. Trên phổ HMBC của C1 nhận thấy có sự tương tác giữa proton anomer của cấu tử đường glucopyranosyl (δH 5,12) và carbon C-3 của khung flavonoid (δC 135,6) cho thấy gốc đường glucopyranosyl được gắn vào vị tr C-3 của phần khung aglycon. Trên phổ HMBC cũng cho thấy tương tác giữa proton anomer của cấu tử đường rhamnopyranosyl t i δH 4,54 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1''') với carbon C-6'' (δC 68,5) của cấu tử đường glucopyranosyl, tương tác giữa proton H-6'' của cấu tử đường glucopyranosyl t i δH 3,83 (1H, dd, J = 10,5/1,0 Hz, Hb-6'') với carbon C-1''' của cấu tử đường rhamnopyranosyl (δC 102,4) cho thấy 2 cấu tử đường này liên kết với nhau qua cầu oxi giữa C-1''' và C-6''. 57 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất C1 và hợp chất tham khảo C δC # C a, b H a, c (J, Hz) Aglycon 2 158,4 158,5 - 3 135,6 135,6 - 4 179,3 179,4 - 5 162,8 162,9 - 6 99,9 99,9 6,23 (d, 2,0) 7 165,9 166,0 - 8 94,9 94,9 6,42 (d, 2,0) 9 159,3 159,3 - 10 105,6 105,6 - 1′ 123,6 123,1 - 2′ 116,2 117,7 7,69 (d, 2,5) 3′ 145,7 145,8 - 4′ 149,7 149,8 - 5′ 117,7 116,1 6,89 (d, 8,0) 6′ 123,1 123,5 7,65 (dd, 8,0; 2,5) 3-O-β-D-glucopyranoside 1′′ 102,3 104,7 5,12 (d, 7,5) 2′′ 75,6 75,7 3,25-3,47 (m) 3′′ 78,1 78,1 3,25-3,47 (m) 4′′ 71,3 71,4 3,25-3,47 (m) 5′′ 77,1 77,2 3,25-3,47 (m) 6′′ 68,6 68,5 3,49-3,83 (d, 10,5; 1,0) 6′′-O-α-L-rhamnopyranoside 1′′′ 104,7 102,4 4,54 (d, 1,5) 2′′′ 72,0 72,2 3,65 (dd, 3,5; 1,5) 3′′′ 72,2 72,1 3,56 (m) 4′′′ 73,9 73,9 3,28 (m) 5′′′ 69,6 69,7 3,32 (m) 6′′′ 17,8 17,8 1,14 (d, 6,0) #δC của rutin [27], ađo trong CD3OD, b 125 MHz, c 500 MHz Từ dữ kiện phổ NMR thu được, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ NMR của rutin công bố trong tài liệu [27], khẳng định hợp chất C1 là rutin (68) (Hình 4.1). 4.2.2. Hợp ch t 2 (C2): Acid gallic Hợp chất C2 được phân lập dưới d ng tinh thể hình kim màu trắng, điểm nóng chảy 236-238oC. C OHO OH OH HO 1 2 3 4 5 6 7 Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất C2 58 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất C2 và hợp chất tham khảo C δC #, a δC a, b δH a, c (J, Hz) 1 121,0 122,0 - 2 109,0 110,3 7,08 (s) 3 145,9 146,3 - 4 138,3 139,5 - 5 145,9 146,3 - 6 109,0 110,3 7,08 (s) 7 168,0 170,4 - #δC của acid gallic [58], ađo trong CD3OD, b 125 MHz, c 500 MHz. Trên phổ 1H-NMR của C2 xuất hiện duy nhất một tín hiệu singlet ở vùng thơm t i δH 7,08 (2H, s, H-2, H-6) cho thấy hợp chất C2 có chứa vòng thơm bị thế ở 4 vị trí có tr c đối xứng. Trên phổ 13C-NMR của C2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 6 nguyên tử carbon thuộc vòng thơm bao gồm 2 nhóm CH và 4 carbon bậc bốn, bên c nh đó cũng xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một nguyên tử carbon thuộc nhóm carbonyl t i δC 170,4 (C-7). Tín hiệu cộng hưởng của CH t i δC 110,3 (C-2, C-6) và của carbon bậc bốn t i δC 146,3 (C-3, C-5) với cường độ pic cao gấp đôi các t n hiệu cộng hưởng khác đã khẳng định hợp chất C2 chứa một vòng thơm bị thế ở 4 vị trí có tr c đối xứng, trong đó có một nhóm carboxyl. So sánh dữ liệu phổ của hợp chất C2 với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo ở tài liệu [58], kết luận hợp chất C2 là acid gallic (80) (Hình 4.2). 4.2.3. Hợp ch t 3 (C3): Daucosterol Hợp chất C3 được phân lập dưới d ng chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 283-286 o C. Trên phổ ESI-MS của C3 cho thấy sự xuất hiện pic ion giả phân tử t

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc.pdf
Tài liệu liên quan