LỜI CAM ĐOAN . i
LỜI CẢM ƠN. ii
MỤC LỤC. iii
TRANG THÔNG TIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ. vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT . viii
DANH MỤC CÁC BẢNG . xi
DANH MỤC CÁC HÌNH . xiii
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC.xv
MỞ ĐẦU .1
1. Đ t vấn đ .1
2. M c đ ch nghiên cứu .2
3. Đối tượng và ph m vi nghiên cứu .2
4. Nội dung nghiên cứu .3
5. Phương pháp nghiên cứu .3
6. ngh a khoa học và thực ti n của nghiên cứu.3
7. Những đóng góp mới của luận án.4
8. Cấu trúc của luận án .4
CHưƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.5
1.1. Giới thiệu v cây đu đủ .5
1.2. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ .6
1.2.1. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ trong nước.7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ trên thế
giới .8
1.3. Tình hình nghiên cứu v ho t tính sinh học của cây đu đủ.15
1.3.1. Tác d ng trị giun sán .15
1.3.2. Tác d ng h huyết áp.16
1.3.3. Tác d ng kháng sinh, kháng nấm .16
1.3.4. Tác d ng trị u bướu, ung thư .17
1.3.5. Tác d ng chống oxy hóa.25
1.3.6. Các tác d ng dược l khác.26
1.4. Giới thiệu v enzyme tyrosinase .27
1.4.1. Khái niệm và vai trò của enzyme tyrosinase.27
1.4.2. Các chất ức chế enzyme tyrosinase .28
CHưƠNG 2. ĐỐI TưỢNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHI N CỨU .30
2.1. Đối tượng nghiên cứu.30
2.2. Hóa chất, d ng c và thiết bị.31
2.3. Phương pháp nghiên cứu.31
147 trang |
Chia sẻ: honganh20 | Ngày: 16/02/2022 | Lượt xem: 462 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (carica papaya l.), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Phân đo n CPET1 (2,0 g) được cho lên cột sắc k silica gel pha đảo, rửa giải
với hệ dung môi methanol/nước (3/2, v/v) thu được hợp chất CPE1 (40 mg).
Phân đo n CPET2 (2,4 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo,
rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (1,3/1, v/v) thu được hai phân đo n
CPET2A (60 mg) và CPET2B (820 mg). Hợp chất CPE2 (18 mg) được tinh chế
trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) từ phân
đo n CPET2A (60 mg).
Phân đo n CPET3 (1,6 g) được cho lên cột sắc ký silica gel pha đảo, rửa giải
với hệ dung môi methanol/nước (1,2/1, v/v) thu được hai phân đo n CPET3A (25
mg) và CPET3B (37 mg). Phân đo n CPET3A (25 mg) được tinh chế qua cột
43
Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) thu được hợp
chất CPE3 (11 mg). Hợp chất CPE4 (9,2 mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH-
20 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1, v/v) từ phân đo n CPET3B (37
mg).
Phân đo n CPET4 (6,2 g) được cho lên cột sắc ký silica gel pha đảo, rửa giải
bằng hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v) thu được hai phân đo n CPET4A (300
mg) và CPET4B (410 mg). Phân đo n CPET4A (300 mg) được tinh chế tiếp qua cột
silica gel với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước (3/1/0,2, v/v/v) thu được
hai phân đo n CPET4A1 (58 mg) và CPET4A2 (42 mg). Phân đo n CPET4A1 (58
mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải
methanol/nước (1/1, v/v) thu được hợp chất CPE5 (9,0 mg). Hợp chất CPE6 (8,1
mg) được tinh chế trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol/nước (1/1,
v/v) từ phân đo n CPET4A2 (42 mg). Phân tách phân đo n CPET4B (410 mg) trên
cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước (3,5/1/0,15,
v/v/v) thu được hai phân đo n CPET4B1 (62 mg) và CPET4B2 (71 mg). Phân đo n
CPET4B1 (62 mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải
methanol/nước (1/1, v/v) thu được hợp chất CPE7 (9,6 mg). Hợp chất CPE8 (8,7
mg) được tinh chế qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol/nước (1/1,
v/v) từ phân đo n CPET4B2 (71 mg) (Hình 3.4 và Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Các loại silica gel và hệ dung môi sử dụng
trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.4
Pha t nh Pha động
(1) Silica gel Gradient CH2Cl2-MeOH (50:1→1:1, v/v)
(2) YMC RP-18 MeOH-H2O (3:2, v/v)
(3) YMC RP-18 MeOH-H2O (1,3:1, v/v)
(4) YMC RP-18 MeOH-H2O (1,2:1, v/v)
(5) YMC RP-18 MeOH-H2O (1:1, v/v)
(6) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v)
(7) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v)
(8) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v)
(9) Silica gel CH2Cl2-MeOH-H2O (3:1:0,2, v/v)
(10) Silica gel CH2Cl2-MeOH-H2O (3,5:1:0,15, v/v)
(11) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v)
(12) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v)
(13) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v)
(14) Sephadex LH-20 MeOH-H2O (1:1, v/v)
44
Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate của hoa cây đu đủ đực
CPET
(20 g)
CPET1
(2,0 g)
CPET2
(2,4 g)
CPET3
(1,6 g)
CPET4
(6,2 g)
CPET5
(4,4 g)
(2) (5)
(1)
CPE1
(40 mg)
CPET2A
(60 mg)
CPET2B
(820 mg)
CPET4A
(300 mg)
CPET4B
(410 mg)
(3)
CPET3A
(25 mg)
CPET3B
(37 mg)
(4)
(6)
CPE2
(18 mg)
(7)
CPE3
(11 mg)
(8)
CPE4
(9,2 mg)
CPET4A1
(58 mg)
CPET4A2
(42 mg)
(11)
CPE5
(9 mg)
(12)
CPE6
(8,1 mg)
CPET4B1
(62 mg)
CPET4B2
(71 mg)
(13)
CPE7
(9,6 mg)
(14)
CPE8
(8,7 mg)
(9) (10)
45
3.2.2. Phân lập các hợp ch t từ lá cây đ đ đ c
a. Chuẩn bị các cao chiết
Bột lá cây đu đủ đực (5,0 kg) được ngâm chiết siêu âm với methanol (5 lít x 3
lần, 50oC, 30 phút). Dịch methanol được lọc qua giấy lọc nhi u lần, gom l i và đem
cất lo i dung môi dưới áp suất thấp thu được 500 g cao chiết methanol. Cao chiết
này sau đó được hòa tan với nước cất rồi tiến hành chiết phân bố lần lượt với các
dung môi n-hexane (5 lít x 2 lần) và chloroform (4 lít x 2 lần). Các dịch chiết này
được đem cất lo i dung môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết tương ứng n-
hexane (CPLH, 185 g) và chloroform (CPLC, 74 g) (Hình 3.5).
Hình 3.5. Sơ đồ tạo các cao chiết từ lá cây đu đủ đực
b. Quá trình phân lập các hợp chất
Phân lập các hợp chất từ cao chloroform (CPLC)
Cao chiết chloroform (CPLC, 74 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu
chloroform, sau đó tẩm với 250 g silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô. Tiến
hành phân tách hỗn hợp này bằng cột silica gel pha thường, rửa giải gradient bằng
hệ dung môi n-hexane/acetone (50:1 → 1:1, v/v) thu được 12 phân đo n ký hiệu từ
CPLC1 tới CPLC12.
Phân đo n CPLC5 (5,0 g) được cho lên cột sắc ký silica gel pha thường, rửa
giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (5/1, v/v) thu được 4 phân đo n nhỏ ký hiệu
từ CPLC5A đến CPLC5D. Tinh chế phân đo n CPLC5A (30 mg) bằng dung môi
acetone thu được hợp chất CPL-C1 (12 mg).
1. Ngâm chiết siêu âm bằng methanol (5 lít x 3)
2. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp
1. Bổ sung nước cất (3 lít)
2. Chiết phân bố lần lượt với n-hexane (5 lít x 2)
và chloroform (4 lít x 2)
3. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp
Bột lá cây đu đủ đực (5,0 kg)
Cao methanol (500 g)
CPLH (185 g)
Cao n-hexane
CPLC (74 g)
Cao chloroform
46
Phân đo n CPLC8 (3,5 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha
thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (20/1, v/v) thu được 5 phân
đo n nhỏ ký hiệu từ CPLC8A đến CPLC8E. Hợp chất CPL-C2 (17 mg) được tinh
chế bằng dung môi acetone từ phân đo n CPLC8C (55 mg).
Phân đo n CPLC12 (1,2 g) được tinh chế trên cột sắc k silica gel pha thường,
rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (10/1, v/v) thu được hợp chất CPL-C3
(4 mg) và 3 phân đo n nhỏ ký hiệu từ CPLC12A đến CPLC12C. Phân đo n
CPLC12C (0,2 g) được phân tách trên cột sắc k silica gel pha thường với hệ dung
môi rửa giải là chloroform/acetone (15/1) thu được hợp chất CPL-C4 (20 mg)
(Hình 3.6 và Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Các loại silica gel và hệ dung môi sử dụng
trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.6
Pha t nh Pha động
(1) Silica gel Gradient n-hexane-acetone (50:1→1:1, v/v)
(2) Silica gel n-hexane-acetone (5:1, v/v)
(3) Silica gel n-hexane-acetone (20:1, v/v)
(4) Silica gel n-hexane-acetone (10:1, v/v)
(5) Tinh chế Acetone
(6) Tinh chế Acetone
(7) Silica gel Chloroform/acetone (15:1, v/v)
3.3. Tính chất vật lý và dữ iện phổ của các hợp chất
Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ hoa và lá cây đu
đủ đực được quan sát, xác định theo phương pháp đã mô tả ở m c 2.3.4.
3.3.1. Hợp ch t 1 (C1): Rutin
Tinh thể hình kim, màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: 190-193oC
Công thức phân tử C27H30O16, M = 610
ESI-MS: m/z 633,1 [M+Na]
+
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.2, Ph l c 1
3.3.2. Hợp ch t 2 (C2): Acid gallic
Tinh thể hình kim, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 236-238oC
Công thức phân tử C7H6O5, M = 170
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.3, Ph l c 2
47
Hình 3.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chloroform của lá cây đu đủ đực
CPLC12C
CPLC
(74 g)
CPLC1-CPLC4
(1)
CPLC5
(5,0 g)
CPLC6-CPLC7
CPLC12
(1,2 g)
CPLC5A
(30 mg)
CPLC5B
CPLC5C
CPLC5D
CPL-C1
(12 mg)
CPLC8B
CPLC8C
(55 mg)
CPLC8D
CPLC8E
CPL-C2
(17 mg)
CPLC8A
CPLC8
(3,5 g)
(2) (3)
(5)
(6)
CPLC9-CPLC11
CPL-C3
(4 mg)
CPL-C4
(20 mg)
(4)
CPLC12A
CPLC12B
(0,2 g)
(7)
48
3.3.3. Hợp ch t 3 (C3): Daucosterol
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 283-286oC
Công thức phân tử C35H60O6, M = 576
ESI-MS: m/z 397,3 [M-C6H12O6+H]
+
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6),
13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.4, Ph l c 3
3.3.4. Hợp ch t 4 (CP1): 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-
carbaldehyde (Hợp ch t l đ u phân lập từ nguồn t nhiên)
Chất dầu, không màu
Công thức phân tử C13H13NO2, M = 215
HR-ESI-MS: m/z 238,0842 [M+Na]
+
Tính toán lý thuyết cho công thức C13H13NO2Na: 238,0844
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.5
3.3.5. Hợp ch t 5 (CP3): Vitexoid
Chất dầu, không màu
Công thức phân tử C10H16O3, M = 184
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.6, Ph l c 4
3.3.6. Hợp ch t 6 (CP4): Lariciresinol
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 165-168oC
Công thức phân tử C20H24O6, M = 360
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.7, Ph l c 5
3.3.7. Hợp ch t 7 (CP5): Dehydrodiconiferyl alcohol
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 141-142oC
Công thức phân tử C20H22O6, M = 358
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.8, Ph l c 6
3.3.8. Hợp ch t 8 (CP6): Benzyl-O--D-glucopyranoside
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 121-122oC
Công thức phân tử C13H18O6, M = 270
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.9, Ph l c 7
3.3.9. Hợp ch t 9 (CP9): 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid
Chất dầu, không màu
Công thức phân tử C10H16O3, M = 184
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6),
13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.10, Ph l c 8
49
3.3.10. Hợp ch t 10 (CP10): 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid
Chất dầu, không màu
Công thức phân tử C10H18O3, M = 186
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.11, Ph l c 9
3.3.11. Hợp ch t 11 (CP14): 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol
Chất dầu, không màu
Công thức phân tử C10H18O2, M = 170
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.12, Ph l c 10
3.3.12. Hợp ch t 12 (CP11): Hỗn hợp 2 ch t 3-hydroxy-3-methyl-5-
hexanolide và leucine
Chất dầu, không màu
Hợp chất 12.1 (CP11.1): 3-hydroxy-3-methyl-5-hexanolid
Công thức phân tử C6H10O3, M = 130
HR-ESI-MS: m/z 131,0709 [M+H]
+
Tính toán lý thuyết cho công thức C6H11O3: 131,0708
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.13.1, Ph l c 11
Hợp chất 12.2 (CP11.2): Leucine
Công thức phân tử C6H13NO2, M = 131
HR-ESI-MS: m/z 130,1649 [M-H]
-
Tính toán lý thuyết cho công thức C6H12NO2: 130,1650
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.13.2, Ph l c 11
3.3.13. Hợp ch t 13 (CP12A): Caricapapayol (Hợp ch t mới)
Chất bột, màu vàng
Công thức phân tử C29H34O4, M = 446
HR-ESI-MS: m/z 447,2526 [M+H]
+
Tính toán lý thuyết cho công thức C29H35O4: 447,2535
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.14
3.3.14. Hợp ch t 14 (CP17A): Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat
(Hợp ch t mới)
Chất bột, màu trắng
Công thức phân tử C20H38O5, M = 358
HR-ESI-MS: m/z 357,8369 [M-H]
-
Tính toán lý thuyết cho công thức C20H37O5: 357,2641
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.15
3.3.15. Hợp ch t 15 (CP19): Indole-3-aldehyde
Tinh thể hình kim, màu vàng
Công thức phân tử C9H7NO, M = 145
HR-ESI-MS: m/z 146,1657 [M]
+
50
Tính toán lý thuyết cho công thức C9H7NO: 146,1659
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.16, Ph l c 12
3.3.16. Hợp ch t 16 (CP20): 3β 7α-dihydroxycholest-5-ene
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 188-189oC
Công thức phân tử C27H46O2, M = 402
ESI-MS: m/z 367,3 [M+H-2H2O]
+
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.17, Ph l c 13
3.3.17. Hợp ch t 17 (CP21): Cholest-5-ene-3β 7β-diol
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 178-179oC
Công thức phân tử C27H46O2, M = 402
ESI-MS: m/z 367,3 [M+H-2H2O]
+
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.18, Ph l c 14
3.3.18. Hợp ch t 18 (CP22): Saringosterol
Tinh thể hình kim, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 160-161oC
Công thức phân tử C29H48O2, M = 428
HR-ESI-MS: m/z 439,3651 [M+Na]
+
Tính toán lý thuyết cho công thức C29H48NaO2: 416,3654
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.19, Ph l c 15
3.3.19. Hợp ch t 19 (CPE1): Kaempferol
Chất bột, màu vàng sẫm
Nhiệt độ nóng chảy: 275-277oC
Công thức phân tử C15H10O6, M = 286
ESI-MS: m/z 287,14 [M+H]
+
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.20, Ph l c 16
3.3.20. Hợp ch t 20 (CPE5): Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside
Chất bột, màu vàng nh t
Nhiệt độ nóng chảy: 172-175oC
Công thức phân tử C21H20O10, M = 432
ESI-MS: m/z 433,46 [M+H]
+
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.21, Ph l c 17
3.3.21. Hợp ch t 21 (CPE4): Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside
Chất bột, màu vàng sẫm
Nhiệt độ nóng chảy: 223-229oC
Công thức phân tử C21H20O11, M = 448
ESI-MS: m/z 447,42 [M-H]
-
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.22, Ph l c 18
51
3.3.22. Hợp ch t 22 (CPE7): Kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside
Chất bột, màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: 204-209oC
Công thức phân tử C20H18O10, M = 418
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.23, Ph l c 19
3.3.23. Hợp ch t 23 (CPE2): Quercetin
Chất bột, màu vàng sẫm
Nhiệt độ nóng chảy: 314-316oC
Công thức phân tử C15H10O7, M = 302
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6),
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.24, Ph l c 20
3.3.24. Hợp ch t 24 (CPE3): Quercitrin
Chất bột, màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: 174-177oC
Công thức phân tử C21H20O11, M = 448
ESI-MS: m/z 447,36 [M-H]
-
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.25, Ph l c 21
3.3.25. Hợp ch t 25 (CPE6): Quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside
Chất bột, màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: 232-238oC
Công thức phân tử C21H20O12, M = 464
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6),
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): Bảng 4.26, Ph l c 22
3.3.26. Hợp ch t 26 (CPE8): Myricitrin
Chất bột, màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: 205-207oC
Công thức phân tử C21H20O12, M = 464
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.27, Ph l c 23
3.3.27. Hợp ch t 27 (CPL-C1): Tetratriacontanyl palmitate
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 67-71oC
Công thức phân tử C50H100O2, M = 732
ESI-MS: m/z 713,47 [M-H-H2O]
-
, 767,53 [M-H+2H2O]
-
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-16); 0,88 (3H, t,
J = 6,5 Hz, H-34′); 1,26 (m); 1,61 (2H, m, H-3); 2,28 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2);
4,05 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1′): Ph l c 24
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 174,0 (C-1); 64,4 (C-1′); 14,1 (C-16); 14,1
(C-34′); 34,4-22,7: Ph l c 24
52
3.3.28. Hợp ch t 28 (CPL-C2): 1-hentriacontanol
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 85-89oC
Công thức phân tử C31H64O, M = 452
ESI-MS: m/z 453,34 [M+H]
+
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-31); 1,26 (m);
1,56 (2H, m, H-30); 3,64 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1): Ph l c 25
13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 63,1 (C-1); 14,1 (C-31); 32,8-22,7: Ph l c 25
3.3.29. Hợp ch t 29 (CPL-C3): Vanillin
Chất bột, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 82-84oC
Công thức phân tử C8H8O3, M = 152
ESI-MS: m/z 175,0 [M+Na]
+
1H-NMR (500 MHz, CD3OD),
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 4.28, Ph l c 26
3.3.30. Hợp ch t 30 (CPL-C4): Stigmasterol
Tinh thể hình kim, màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy: 169-172oC
Công thức phân tử C29H48O, M = 412
ESI-MS: m/z 395,3 [M-H2O+H]
+
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.29, Ph l c 27
3.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất
Ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập từ hoa và
lá cây đu đủ đực được thử nghiệm trên ba dòng tế bào ung thư phổi ở người (A549),
ung thư vú ở người (MCF-7) và ung thư gan ở người (Hep3B) theo phương pháp đã
mô tả ở m c 2.3.5.
Hợp chất C2, CP12A và CPL-C3 không đưa vào thử nghiệm do lượng mẫu
không đủ. Hợp chất C1, C3 và CPL-C4 có cấu trúc quen thuộc và đã được nghiên
cứu nhi u nên không đưa vào thử nghiệm.
Quá trình thử nghiệm ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp
chất được thực hiện t i phòng thử nghiệm Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
53
3.5. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cao methanol và các
hợp chất
Ho t t nh ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao methanol và các hợp chất
phân lập từ hoa cây đu đủ đực được thử nghiệm theo phương pháp đã mô tả ở m c
2.3.6.
Các hợp chất phân lập từ cao chloroform lá cây đu đủ đực và các cao
chloroform, ethyl acetate từ hoa cây đu đủ đực không đưa vào thử nghiệm. Các
hợp chất CP11, CP17A, CP19, CP20, CP21 và CP22 phân lập từ cao
dichloromethane của hoa cây đu đủ đực không đưa vào thử nghiệm do lượng mẫu
không đủ.
Quá trình thử nghiệm ho t tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao
methanol và các hợp chất được thực hiện t i phòng thử nghiệm Sinh học – Khoa
Dược – Đ i học Yonsei – Hàn Quốc.
54
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các cao chiết
Kết quả đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết n-
hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực trên ba dòng tế bào
ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 được trình bày ở Bảng 4.1.
Kết quả thu được cho thấy các cao chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ
hoa và lá cây đu đủ đực đ u có khả năng ức chế sự phát triển của ba dòng tế bào
ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 với các mức độ khác nhau. Trong đó, cao
chloroform của cả hoa và lá cây đu đủ đực thể hiện ho t t nh gây độc tế bào tốt hơn
trên cả ba dòng tế bào ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 với tỷ lệ tế bào sống
sót trong khoảng 15,49±1,65 đến 46,81±3,75% ở nồng độ 100 µg/mL và
44,64±2,21 đến 45,18±2,62% ở nồng độ 30 µg/mL. Đồng thời, kết quả thu được ở
cao chloroform cũng cho thấy lá cây đu đủ đực có khả năng ức chế tốt sự phát triển
của hai dòng tế bào ung thư ở người Hep3B (CS % = 15,49±1,65% ở nồng độ 100
µg/mL), MCF-7 (CS % = 27,33±2,49% ở nồng độ 100 µg/mL) và có khả năng ức
chế yếu hơn trên dòng tế bào ung thư ở người A549 (CS % = 55,28±2,80% ở nồng
độ 100 µg/mL) so với hoa cây đu đủ đực (CS % = 46,81±3,75%; 38,24±1,60;
35,76±2,50% tương ứng với các dòng tế bào ung thư ở người Hep3B, MCF-7,
A549).
M t khác, dựa vào kết quả này cho ph p dự đoán dung môi dichloromethane
cũng là một dung môi chiết tốt các hợp chất từ hoa và lá cây đu đủ đực, tương tự
dung môi chloroform. Dự đoán này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Hà
khi tham khảo tài liệu [5]. Đây là cơ sở để định hướng lựa chọn cho các nghiên cứu
v thành phần hóa học.
Như vậy, dựa vào kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro
của các cao chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực
trên ba dòng tế bào ung thư ở người A549, Hep3B, MCF-7 cũng như việc khảo sát
thăm dò các cao chiết trên sắc ký bản mỏng cùng các thuốc thử đặc trưng và tham
khảo tài liệu [5], chúng tôi đã lựa chọn các cao chiết chloroform, dichloromethane,
ethyl acetate từ hoa cây đu đủ đực và cao chiết chloroform từ lá cây đu đủ đực để
tiến hành phân lập các hợp chất.
55
Bảng 4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các cao chiết
Mẫu
Nồng độ
(µg/mL)
Tỷ lệ tế bào sống sót (CS %)
A549 Hep3B MCF-7
Bộ phận cây đu đủ đực
Hoa Lá Hoa Lá Hoa Lá
CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số CS % Sai số
Control 100,00 2,40 100,00 1,29 100,00 1,89 100,00 2,64 100,00 3,76 100,00 1,93
Cao n-hexane
30 58,67 2,56 62,47 2,69 59,70 2,24 59,94 2,27 56,11 2,06 65,01 1,21
100 29,69 1,73 57,93 2,36 50,53 0,70 49,72 2,06 54,11 1,92 56,29 2,29
Cao chloroform
30 56,30 0,62 59,58 2,55 59,70 1,50 45,18 2,62 70,42 1,49 44,64 2,21
100 35,76 2,50 55,28 2,80 46,81 3,75 15,49 1,65 38,24 1,60 27,33 2,49
Cao ethyl acetate
30 89,57 3,65 78,81 0,98 90,21 3,91 79,47 1,47 57,60 1,56 72,05 2,38
100 69,80 0,59 54,04 1,34 63,47 2,28 66,56 2,25 55,88 0,18 71,21 2,27
Camptothecin
0,5 (0,1) 76,00 2,27 55,66 2,49 48,73 1,35 54,27 2,01 62,82 2,10 56,25 1,97
10 41,77 1,25 35,74 0,77 28,27 2,64 22,64 0,67 42,66 2,08 44,84 0,22
56
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
4.2.1. Hợp ch t 1 (C1): Rutin
Hợp chất C1 được phân lập dưới d ng tinh thể hình kim màu vàng, điểm nóng
chảy 190-193oC. Trên phổ ESI-MS của C1 cho thấy sự xuất hiện pic ion giả phân tử
t i m/z 633,1 [M+Na]+ nên có thể đ nghị CTPT của hợp chất này là C27H30O16.
O
O
OH
OH
HO
2
10
9
4
3
5'
3'
6'
2' 4'
1'
5
8
6
7
O
OH
O
HO
OH
OH
O
O
H3C
HO
HO OH
1''
2''
3''
4''
5''
6''
1'''
2'''3'''4'''
5'''
6'''
O
O
OH
OH
HO
O
OH
O
HO
OH
OH
O
O
H3C
HO
HO OH
(a) (b)
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học (a) và tƣơng tác HMBC chính (b) của hợp chất C1
Phổ 1H-NMR của C1 cho thấy sự xuất hiện hai tín hiệu doublet của proton
vòng A t i δH 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và ba tín
hiệu doublet khác t i δH 7,69 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2′); 6,89 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-
5′); 7,65 (dd, J = 8,0; 2,5 Hz, H-6′) của vòng B thế 1, 3, 4. Đi u này chứng tỏ cấu
trúc phần aglycon của hợp chất C1 là quercetin.
Phổ 13C-NMR của C1 xuất hiện tín hiệu 15 nguyên tử carbon của khung
flavonoid, bao gồm 5 carbon nhóm CH vùng thơm (δC nằm trong vùng từ 94,9 đến
123,5), 1 carbon của nhóm carbonyl (δC 179,4) và 9 carbon bậc 4. Tín hiệu cộng
hưởng của các nhóm CH nằm trong vùng δH 3,25-3,83 trên phổ
1
H-NMR và δC
68,5-78,1 trên phổ 13C-NMR cùng với sự xuất hiện hai tín hiệu doublet của 2 proton
anomer t i δH 4,54 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1′′′); 5,12 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′′) và các
tín hiệu của nhóm methyl, methylene ở δC 17,8; 68,5 trên phổ HSQC cho thấy trong
cấu trúc của C1 có chứa hai gốc đường α-L-rhamnopyranosyl và β-D-
glucopyranosyl.
Trên phổ HMBC của C1 nhận thấy có sự tương tác giữa proton anomer của
cấu tử đường glucopyranosyl (δH 5,12) và carbon C-3 của khung flavonoid (δC
135,6) cho thấy gốc đường glucopyranosyl được gắn vào vị tr C-3 của phần khung
aglycon. Trên phổ HMBC cũng cho thấy tương tác giữa proton anomer của cấu tử
đường rhamnopyranosyl t i δH 4,54 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1''') với carbon C-6'' (δC
68,5) của cấu tử đường glucopyranosyl, tương tác giữa proton H-6'' của cấu tử
đường glucopyranosyl t i δH 3,83 (1H, dd, J = 10,5/1,0 Hz, Hb-6'') với carbon C-1'''
của cấu tử đường rhamnopyranosyl (δC 102,4) cho thấy 2 cấu tử đường này liên kết
với nhau qua cầu oxi giữa C-1''' và C-6''.
57
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất C1 và hợp chất tham khảo
C δC
#
C
a, b
H
a, c
(J, Hz)
Aglycon
2 158,4 158,5 -
3 135,6 135,6 -
4 179,3 179,4 -
5 162,8 162,9 -
6 99,9 99,9 6,23 (d, 2,0)
7 165,9 166,0 -
8 94,9 94,9 6,42 (d, 2,0)
9 159,3 159,3 -
10 105,6 105,6 -
1′ 123,6 123,1 -
2′ 116,2 117,7 7,69 (d, 2,5)
3′ 145,7 145,8 -
4′ 149,7 149,8 -
5′ 117,7 116,1 6,89 (d, 8,0)
6′ 123,1 123,5 7,65 (dd, 8,0; 2,5)
3-O-β-D-glucopyranoside
1′′ 102,3 104,7 5,12 (d, 7,5)
2′′ 75,6 75,7 3,25-3,47 (m)
3′′ 78,1 78,1 3,25-3,47 (m)
4′′ 71,3 71,4 3,25-3,47 (m)
5′′ 77,1 77,2 3,25-3,47 (m)
6′′ 68,6 68,5 3,49-3,83 (d, 10,5; 1,0)
6′′-O-α-L-rhamnopyranoside
1′′′ 104,7 102,4 4,54 (d, 1,5)
2′′′ 72,0 72,2 3,65 (dd, 3,5; 1,5)
3′′′ 72,2 72,1 3,56 (m)
4′′′ 73,9 73,9 3,28 (m)
5′′′ 69,6 69,7 3,32 (m)
6′′′ 17,8 17,8 1,14 (d, 6,0)
#δC của rutin [27],
ađo trong CD3OD,
b
125 MHz,
c
500 MHz
Từ dữ kiện phổ NMR thu được, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ NMR của
rutin công bố trong tài liệu [27], khẳng định hợp chất C1 là rutin (68) (Hình 4.1).
4.2.2. Hợp ch t 2 (C2): Acid gallic
Hợp chất C2 được phân lập dưới d ng tinh thể hình kim màu trắng, điểm nóng
chảy 236-238oC.
C
OHO
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
7
Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất C2
58
Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất C2 và hợp chất tham khảo
C δC
#, a δC
a, b
δH
a, c
(J, Hz)
1 121,0 122,0 -
2 109,0 110,3 7,08 (s)
3 145,9 146,3 -
4 138,3 139,5 -
5 145,9 146,3 -
6 109,0 110,3 7,08 (s)
7 168,0 170,4 -
#δC của acid gallic [58],
ađo trong CD3OD,
b
125 MHz,
c
500 MHz.
Trên phổ 1H-NMR của C2 xuất hiện duy nhất một tín hiệu singlet ở vùng
thơm t i δH 7,08 (2H, s, H-2, H-6) cho thấy hợp chất C2 có chứa vòng thơm bị thế ở
4 vị trí có tr c đối xứng.
Trên phổ 13C-NMR của C2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 6 nguyên tử
carbon thuộc vòng thơm bao gồm 2 nhóm CH và 4 carbon bậc bốn, bên c nh đó
cũng xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một nguyên tử carbon thuộc nhóm carbonyl
t i δC 170,4 (C-7). Tín hiệu cộng hưởng của CH t i δC 110,3 (C-2, C-6) và của
carbon bậc bốn t i δC 146,3 (C-3, C-5) với cường độ pic cao gấp đôi các t n hiệu
cộng hưởng khác đã khẳng định hợp chất C2 chứa một vòng thơm bị thế ở 4 vị trí
có tr c đối xứng, trong đó có một nhóm carboxyl.
So sánh dữ liệu phổ của hợp chất C2 với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo
ở tài liệu [58], kết luận hợp chất C2 là acid gallic (80) (Hình 4.2).
4.2.3. Hợp ch t 3 (C3): Daucosterol
Hợp chất C3 được phân lập dưới d ng chất bột màu trắng, điểm nóng chảy
283-286
o
C. Trên phổ ESI-MS của C3 cho thấy sự xuất hiện pic ion giả phân tử t
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- luan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc.pdf