Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài trichosanthes baviensis gagnep. (qua lâu ba vì), trichosanthes anguina l. (dưa núi) và trichosanthes kirilowii maxim. (qua lâu nhân)

mg). Phân đoạn TKR1C3 được đưa lên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải là MeOH:nước (2:1, v/v) thu được hợp chất TK8 (30,0 mg). Pha nước (TKR3) được chạy bằng cột diaion HP-20 và loại bỏ đường bằng nước, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (0:1, 1:3, 1:1, 3:1 và 1:0, v/v) lần lượt thu được 5 phân đoạn là TKR3A–TKR3E. Phân đoạn TKR3C được chạy sắc ký trên cột sephadex và rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:nước (1:1, v/v) thu được hợp chất TK5 (10,0 mg) và TK6 (15,0 mg). 42 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài T. kirilowii 43 2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 2.4.1. Thông số vật lý của các hợp chất phân lập được từ loài T. baviensis 2.4.1.1. Hợp chất TB1: 9,26-epoxymultiflorenol (chất mới) Chất rắn không màu Độ quay cực 25D][ : +50 (c=0,2, MeOH) Công thức phân tử C30H48O2 (M = 440) HR-ESI-MS: m/z 463,3536 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C30H48O2Na]+, 463,3547) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CDCl3): Xem Bảng 3.1 2.4.1.2. Hợp chất TB2: β-amyrin acetate Bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử C32H52O2 (M = 468) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CDCl3): Xem Bảng 3.2 2.4.1.3. Hợp chất TB3: ergosta-6,22-dien-3β,5α,8α-triol Bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử C28H46O3 (M = 430) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CDCl3): Xem Bảng 3.3 2.4.1.4. Hợp chất TB4: spinasterol Bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử C29H48O (M = 412) Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δH: 5,15 (2H, m, H-7, H-22), 0,55 (3H, s, H-18), 0,79 (3H, s, H-19), 1,02 (3H, t, J = 6,8 Hz, H-21), 5,02 (dd, J = 8,4, 15,2 Hz, H-23), 0,80 (d, J = 7,0 H-26, H-27) và 0,81 (3H, t, J = 6,0 Hz, H-29). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δC: 37,0 (C-1), 31,4 (C-2), 71,0 (C-3), 37,9 (C-4), 40,2 (C-5), 29,6 (C-6), 117,5 (C-7), 139,6 (C-8), 49,4 (C-9), 34,1 (C-10), 21,3 (C-11), 39,4 (C- 12), 43,2 (C-13), 55,0 (C-14), 22,9 (C-15), 28,4 (C-16), 55,9 (C-17), 12,0 (C-18), 12,9 (C-19), 40,7 (C-20), 21,5 (C-21), 138,2 (C-22), 129,5 (C-23), 51,2 (C-24), 31,8 (C-25), 19,0 (C-26), 21,0 (C-27), 25,3 (C-28) và 12,2 (C-29). 2.4.1.5. Hợp chất TB5: 4α,14α-dimethyl-9,19-cyclo-5α,9β-ergost-24(28)-en-3β-ol Bột vô định hình màu trắng 44 Công thức phân tử C30H50O (M = 426) Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δH: 3,22 (1H, m, H-3), 0,97 (3H, s, H-18), 0,14 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19)/0,39 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19), 0,90 (3H, br s, H-21), 1,01 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26), 1,03 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27), 4,66 (1H, br s, H- 28)/ 4,71 (1H, br s, H-28) và 0,99 (3H, t, J = 6,0 Hz, H-29). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δC: 30,7 (C-1), 34,7 (C-2), 76,6 (C-3), 44,5 (C-4), 43,3 (C-5), 24,6 (C-6), 25,1 (C-7), 46,8 (C-8), 23,4 (C-9), 29,6 (C-10), 26,9 (C-11), 32,8 (C-12), 45,3 (C- 13), 48,9 (C-14), 35,3 (C-15), 28,0 (C-16), 52,2 (C-17), 17,7 (C-18), 27,2 (C-19), 36,1 (C-20), 18,3 (C-21), 35,0 (C-22), 31,3 (C-23), 157,0 (C-24), 33,7 (C-25), 21,9 (C-26), 21,8 (C-27), 106,0 (C-28), 14,3 (C-29) và 19,1 (C-30). 2.4.1.6. Hợp chất TB6: lup-20(29)-en-3β-ol Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [α]D25: +25,7 (c=0,7, CDCl3) Công thức phân tử C30H50O (M = 426) Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δH: 3,19 (1H, m, H-3), 2,37 (1H, dt, J = 4,0, 9,6 Hz, H-19), 0,97 (3H, s, H-23), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 1,03 (3H, s, H-26), 0,94 (3H, s, H-27), 0,79 (3H, s, H-28), 1,68 (3H, s, H-30) và 4,57 (1H, br s, H-29)/ 4,69 (1H, br s, H-29). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δC: 38,7 (C-1), 27,4 (C-2), 79,0 (C-3), 38,9 (C-4), 55,3 (C-5), 18,3 (C-6), 34,3 (C-7), 40,8 (C-8), 50,4 (C-9), 37,2 (C-10), 20,9 (C-11), 25,1 (C-12), 38,0 (C-13), 42,8 (C-14), 27,4 (C-15), 35,6 (C-16), 43,0 (C-17), 48,0 (C-18), 48,3 (C-19), 151,1 (C-20), 29,8 (C- 21), 40,0 (C-22), 28,0 (C-23), 15,4 (C-24), 16,1 (C-25), 15,9 (C-26), 14,5 (C-27), 18,0 (C-28), 19,2 (C-29) và 109,4 (C-30). 2.4.1.7. Hợp chất TB7: (+)-lyoniresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25 D[ ] : +25,0 (c=0,1, MeOH) Công thức phân tử C28H38O13 (M = 582) Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.4 2.4.1.8. Hợp chất TB8: (-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25 D[ ] : −47,5 (c=0,1, MeOH) 45 Công thức phân tử C28H38O13 (M = 582) Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.5 2.4.1.9. Hợp chất TB9: demethoxybergenin Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25 D[ ] : −23,5 (c=0,1, MeOH) Công thức phân tử C13H14O8 (M = 298) Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): Xem Bảng 3.6 2.4.1.10. Hợp chất TB10: bergenin Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25 D[ ] : −36,0 (c=0,3, MeOH) Công thức phân tử C14H16O9 (M = 328) Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): Xem Bảng 3.7 2.4.1.11. Hợp chất TB11: icariside F2 Bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử C18H26O10 (M = 402) Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.8 2.4.1.12. Hợp chất TB12: nicotiflorin Bột vô định hình màu vàng Công thức phân tử C27H30O15 (M = 594) Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.9 2.4.1.13. Hợp chất TB13: (6S,9S)-roseoside Bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử C19H30O8 (M = 386) Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.10 2.4.1.14. Hợp chất TB14: thymidine Bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử C10H14N2O5 (M = 242) Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.11 46 2.4.2. Thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài T. anguina 2.4.2.1. Hợp chất TA1: tricanguina A (chất mới) Chất bột không màu . Độ quay cực 25D][ : +30,1 (c=0,1, MeOH) Công thức phân tử C21H24O7 (M = 388) HR-ESI-MS: m/z 389,1578 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C21H25O7]+ là 389,1595) và 411,1383 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C21H24O7Na]+ là 411,1414) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.12 Phổ CD (MeOH): Xem Hình 3.25. 2.4.2.2. Hợp chất TA2: tricanguina B (chất mới) Chất bột không màu . Độ quay cực 25D][ : +43,3 (c=0,1, MeOH) Công thức phân tử C21H22O8 (M = 402) HR-ESI-MS: m/z 403,1372 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C21H23O8]+ là 403,1387) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.13 2.4.2.3. Hợp chất TA3: corchoionoside B Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D][ : +115,0 (c=0,2, MeOH) Công thức phân tử C19H28O9 (M = 400) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.14 Phổ CD (MeOH): Xem Hình 3.42. 2.4.2.4. Hợp chất TA4: icariside B5 Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D][ : −13,0 (c=0,5, MeOH) Công thức phân tử C19H32O8 (M = 388) Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.15 47 2.4.2.5. Hợp chất TA5: (3R,9S) 3,9-dihydroxymegastigman-5-ene 9-O-β-D- glucopyranoside Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D][ : −65,5 (c=0,5, MeOH) Công thức phân tử C19H34O7 (M = 374) Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.16 2.4.2.6. Hợp chất TA6: icariside B1 Bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [α]D25: −70,0 (c=0,5, MeOH) Công thức phân tử C19H30O8 (M = 386) Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.17 2.4.2.7. Hợp chất TA7: kaemferol 3-O-β-D-glucopyranoside (1→3) O-β-D- glucopyranoside Bột vô định hình màu vàng Công thức phân tử C27H30O16 (M = 610) Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.18 2.4.2.8. Hợp chất TA8: isopentyl 1-O-β-D-glucopyranoside Bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử C11H22O6 (M = 250) Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.19 2.4.3. Thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài T. kirilowii 2.4.3.1. Hợp chất TK1: trichobenzolignan (chất mới) Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D][ : -38,0 (c=0,15, MeOH) Công thức phân tử C18H18O4 (M = 298) HR-ESI-MS: m/z 321,1098 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C18H18O4Na]+ là 321,1103) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.20 Phổ CD (MeOH): Xem Hình 3.55. 48 2.4.3.2. Hợp chất TK2: ligballinol Chất dầu không màu Độ quay cực 25D][ : -24,0 (c=0,1, MeOH) Công thức phân tử C18H18O4 (M = 298) HR-ESI-MS m/z tại 299,1286 [M+H]+ (Tính toán lí thuyết cho công thức, [C18H19O4]+, 299,1278. Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δH: 7,17 (4H, d, J = 8,4 Hz, H-2, H-6, H-2', H-6'), 6,74 (4H, d, J = 8,4 Hz, H-3, H-5, H-3', H-5'), 4,67 (2H, d, J = 4,4 Hz, H-7, H-7'), 3,09 (2H, m, H-8, H-8'), 3,77 (2H, d, J = 3,6, 9,2 Hz, H-9, H-9')/ 4,17 (2H, m, H-9, H-9'). 13C-NMR (DMSO-d6) δC: 133,0 (C-1, C-1'), 128,7 (C-2, C-6, C- 2', C-6'), 116,2 (C-3, C-5, C-3', C-5'), 158,2 (C-4, C-4'), 87,4 (C-7, C-7'), 55,3 (C-8, C-8'), 72,5 (C-9, C-9'). 2.4.3.3. Hợp chất TK3: (-)-pinoresinol Chất dầu không màu Độ quay cực 25D][ : -45,0 (c=0,2, MeOH) Công thức phân tử C20H22O6 (M = 358) ESI-MS m/z 359 [M+H]+ Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.21. 2.4.3.4. Hợp chất TK4: ehleticanol C Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D][ : -13,0 (c=0,3, MeOH) Công thức phân tử C30H36O10 (M = 556) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.22 2.4.3.5. Hợp chất TK5: luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside Chất bột vô định hình màu vàng Độ quay cực 25D][ : -47,0 (c=0,15, MeOH) Công thức phân tử C21H20O11 (M = 448) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (DMSO-d6): Xem Bảng 3.23 2.4.3.6. Hợp chất TK6: chrysoeriol 7-O-β-D-glucopyranoside Chất bột vô định hình màu vàng 49 Độ quay cực 25D][ : -40,0 (c=0,1, MeOH) Công thức phân tử C22H22O11 (M = 462) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (DMSO-d6): Xem Bảng 3.24 2.4.3.7. Hợp chất TK7: 10α-cucurbita-5,24-dien-3β-ol Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D][ : +35,0 (c=0,1, MeOH) Công thức phân tử C30H50O (M = 426) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CDCl3): Xem Bảng 3.25 2.4.3.8. Hợp chất TK8: arvenin I Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D][ : -65,0 (c=0,2, MeOH) Công thức phân tử C38H56O13 (M = 720) Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 3.26 50 2.4.4. Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất phân lập được từ T. baviensis và T. anguina. Enzyme tyrosinase đóng vai trò đa chức năng như glycosyl hóa, oxi hóa các dẫn xuất chứa đồng. Enzyme tyrosinase xúc tác 2 bước đầu tiên trong việc tạo ra melanine ở động vật có vú; làm phát sinh sẫm màu ở quả bị chín quá. Các hợp chất TB1-TB10 phân lập từ loài T. baviensis và TA1-TA8 phân lập từ loài T. anguina đầu tiên được được đánh giá sàng lọc hoạt tính ức chế enzym tyrosinase ở nồng độ thử nghiệm 50 μM. Kết quả sàng lọc cho thấy, tất cả các hợp chất đều thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao hơn 50%. Do đó, các hợp chất này được tiếp tục thí nghiệm ở các nồng độ nhỏ hơn 1,0, 5,0, 10,0 và 20,0 để xác định giá trị IC50. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase được thể hiện ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2. Hợp chất kojic acid, một hợp chất thường được sử dụng làm chất ức chế enzyme tyrosinase-chất làm trắng da, chủ yếu được thêm vào thực phẩm để ngăn chặn nám da. Kojic được sử dụng làm chất đối chứng dương. Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của TB1-TB10 Hợp chất IC50 (μM) TB1 14,5 ± 3,4 TB2 11,4 ± 2,8 TB3 6,9 ± 2,2 TB4 9,5 ± 3,1 TB5 10,3 ± 2,5 TB6 3,9 ± 1,5 TB7 11,5 ± 4,1 TB8 16,7 ± 2,1 TB9 10,1 ± 3,1 TB10 9,3 ± 2,1 Kojic acid 14,6 ± 3,3 51 Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase của TA1-TA8 Hợp chất IC50 (μM) TA1 21,3 ± 2,8 TA2 36,8±2,6 TA3 33,9±3,1 TA4 42,2±3,6 TA5 46,7±2,0 TA6 22,7±1,4 TA7 8,5±3,3 TA8 >100 Kojic acid 14,6 ± 3,3 2.4.5. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ T. kirilowii Các hợp chất (TK1-TK8) được phân lập từ loài T. kirilowii được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư người, bao gồm A-549, HT-29, OVCAR và MCF-7 theo phương pháp MTT. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất theo nồng độ được thể hiện ở Bảng 2.3. Hợp chất mitoxantrone, một hợp chất chống ung thư được sử dụng để so sánh. Bảng 2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của TK1-TK8 IC50 (µM) Hợp chất A-549 HT-29 OVCAR MCF-7 TK1 36,4 16,2 21,6 26,5 TK2 >100 45,5 >100 >100 TK3 52,4 60,9 >100 >100 TK4 >100 >100 >100 >100 TK5 2,7 16,0 14,5 32,7 TK6 21,1 40,7 32,1 15,8 TK7 11,3 4,1 6,5 17,3 TK8 17,0 49,4 14,7 42,8 Mitoxantrone 7,2 3,1 8,4 10,3 52 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 3.1.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài T. baviensis 3.1.1.1. Hợp chất TB1: 9,26-epoxymultiflorenol (mới) Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của TB1 và hợp chất tham khảo TB1a Hợp chất TB1 thu được ở thể rắn không màu. Trên phổ HR-ESI-MS của TB1 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 463,3536 [M+Na]+ (tính toán lí thuyết cho công thức [C30H48O2Na]+, 463,3547) cho phép kết luận công thức phân tử của TB1 được xác định là C30H48O2. Phổ 1H-NMR của TB1 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại δH 5,25 (1H, dd, J = 2,4, 4,8 Hz); một proton oxymethine tại δH 3,21 (1H, dd, J = 5,4, 9,0 Hz); hai proton oxymethylene tại δH 3,25 (1H, d, J = 7,8 Hz) và 4,52 (1H, d, J = 7,8 Hz); và bảy nhóm methyl tại δH 0,84 (3H, s), 0,90 (3H, s), 0,93 (3H, s), 0,94 (3H, s), 0,95 (6H, s) và 1,02 (3H, s). Phổ 13C-NMR của hợp chất TB1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon, bao gồm: tám carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 28,8, 32,2, 38,4, 39,0, 40,3, 49,0, 85,8 và 143,7; bốn carbon methine tại δC 45,1, 45,5, 79,3 và 113,3; mười một carbon methylene tại δC 22,0, 23,5, 27,2, 30,3, 30,8, 33,3, 34,6, 36,1, 36,2, 36,3 và 78,1; và bảy carbon methyl tại δC 14,5, 15,4, 19,7, 28,3, 29,1, 31,7 và 33,5. Từ những phân tích dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR có thể dự đoán hợp chất TB1 là một triterpene khung multiflorane, tương tự hợp chất multiflorenol (TB1a) [56], ngoại trừ đóng vòng qua cầu oxy tại C-9/C- 26. 53 Các tương tác HMBC từ H-23 (δH 1,02)/H-24 (δH 0,93) tới C-3 (δC 79,3)/ C-4 (δC 39,0)/ C-5 (δC 45,1) gợi ý vị trí của nhóm hydroxy tại C-3 và 2 nhóm methyl tại C-4. Cấu hình β của nhóm hydroxy tại C-3 được xác định dựa trên hằng số tương tác, JH-2β/H-3 = 9,0 Hz, JH-2α/H-3 = 5,4 Hz và so sánh độ dịch chuyển hóa học trên phổ 13C-NMR của C-3 (δC 79,3), C-4 (δC 39,0) của hợp chất TB1 với hợp chất 3β- hydroxyolean-12-en-28-oic acid [C-3 (δC 78,8), C-4 (δC 38,9)] và hợp chất 3α- hydroxyolean-12-en-28-oic acid [C-3 (δC 76,2), C-4 (δC 37,2) ] [57]. Tương tác HMBC giữa H-25 (δH 0,90) và C-1 (δC 30,8)/ C-5 (δC 45,1)/ C-9 (δC 85,8)/ C-10 (δC 38,4); giữa H-28 (δH 0,94) và C-16 (δC 34,6)/ C-18 (δC 45,5)/ C-22 (δC 36,2) gợi ý vị trí nhóm methyl tại C-10 và C-17. Tương tác HMBC giữa H-29 (δH 0,95) và C- 21 (δC 33,3)/ C-30 (δC 31,7); giữa H-30 và C-19 (δC 36,1)/ C-29 (δC 33,5) gợi ý 2 nhóm methyl tại C-20. Tương tác HMBC giữa H-26 (δH 3,25/ 4,52) và C-8 (δC 143,7)/ C-9 (δC 85,8)/ C-13 (δC 40,3)/ C-14 (δC 49,0)/ C-15 (δC 22,0) gợi ý vị trí của liên kết đôi tại C-7/C-8 và cầu oxy tại C-9/C-26. Cấu hình của hợp chất TB1 được xác định dựa trên phân tích phổ NOESY. Trên phổ NOESY thấy xuất hiện tương tác Hβ-6 (δH 2,07) với H-24 (δH 0,93) và H- 25 (δH 0,90), H-25 (δH 0,90) tương tác với Ha-26 (δH 3,25), Hb-26 (δH 4,52) tương tác với H-18 (δH 1,55) và H-28 (δH 0,94) xác định được cấu hình β tại vị trí H-24, Me-10, Me-14, H-18 và Me-28. Tương tác NOESY giữa H-23 (δH 1,02) với H-3 (δH 3,21) và H-5 (δH 1,47), Hα-15 (δH 1,87) với H-27 (δH 0,84) cho phép xác định cấu hình của H-3, Me(23)-4, H-5 và Me-13 là α. Dựa vào các dữ liệu phổ trên, cấu trúc của hợp chất TB1 được xác định. Đây là hợp chất mới và được xác định là 9,26- epoxymultiflorenol. Hình 3.2. Các tương tác HMBC, COSY và NOE chính của TB1 54 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất TB1 Trình bày lại theo kiểu 6 cột C δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 1 30,8 1,43 (m)/1,63 (m) 2 27,2 1,65 (m) 3 79,3 3,21 (dd, 5,4, 9,0) 4 39,0 - 5 45,1 1,47 (m) 6 23,5 2,07 (ddd, 2,4, 10,8, 18,0) 2,16 (dt, 4,8, 18,0) 7 113,3 5,25 (dd, 2,4, 4,8) 8 143,7 - 9 85,8 - 10 38,4 - 11 30,3 1,55 (m) 1,79 (dd, 4,2, 6,0) 12 36,3 1,45 (m) 1,56 (m) 13 40,3 - 14 49,0 - 15 22,0 1,25 (m) 1,87 (ddd, 4,2, 7,8, 14,4) 16 34,6 1,17 (m) 1,53 (m) 17 32,2 - 18 45,5 1,55 (m) 19 36,1 1,16 (dd, 10,2, 13,8) 1,32 (dd, 6,0, 13,8) 20 28,8 - 21 33,3 1,24 (m) 1,43 (m) 22 36,2 0,87 (m) 1,43 (m) 23 28,3 1,02 (s) 24 15,4 0,93 (s) 25 14,5 0,90 (s) 26 78,1 3,25 (d, 7,8) 4,52 (d, 7,8) 27 19,7 0,84 (s) 28 29,1 0,94 (s) 29 33,5 0,95 (s) 30 31,7 0,95 (s) aĐo trong CDCl3, b150 MHz, c600 MHz 55 Hình 3.3. Phổ HR-ESI-MS của TB1 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của TB1 405.3423 413.2656 423.3604 441.2988 450.4089 457.3277 463.3536 481.3564 493.3586 +MS, 0.8min #45 0 1 2 3 4 4x10 Intens. 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 m/z 56 Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của TB1 Hình 3.6. Phổ HMQC của TB1 57 Hình 3.7. Phổ HMBC của TB1 Hình 3.8. Phổ COSY của TB1 58 Hình 3.9. Phổ NOESY của TB1 3.1.1.2. Hợp chất TB2: β-amyrin acetate Hình 3.10. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TB2 Hợp chất TB2 thu được ở dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-NMR của TB2 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại δH 5,19 (1H, t, J = 4,0 Hz); một proton oxymethine tại δH 4,51 (1H, t, J = 8,0 Hz); một nhóm acetoxy tại δH 2,06 (3H, s); và tám nhóm methyl tại δH 0,84 (3H, s), 0,86 (6H, s), 0,87 (3H, s), 0,88 (3H, s), 0,97 (3H, s), 0,98 (3H, s) và 1,14 (3H, s). Phổ 13C-NMR của hợp chất TB2 cho biết sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 32 carbon, bao gồm: tám carbon không liên kết trực tiếp với hydro; năm carbon methine; mười carbon methylene và chín carbon methyl. Từ những phân tích dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR có thể dự đoán cấu trúc của TB2 là một triterpene khung oleane, giống với β-amyrin acetate [58]. 59 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất TB2 và hợp chất tham khảo C δCa, # δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 1 38,2 38,4 1,02 (m)/1,63 (m) 2 23,7 23,7 0,86 (m) 3 80,9 81,1 4,51 (dd, 2.0, 8,0) 4 37,8 37,8 - 5 55,2 55,4 0,83 (m) 6 18,3 18,4 1,39 (m)/1,51 (m) 7 32,6 32,6 1,32 (m)/1,51 (m) 8 39,8 39,9 - 9 47,7 47,7 1,56 (m) 10 36,9 37,0 - 11 23,5 23,7 1,61 (m)/1,86 (m) 12 121,7 121,8 5,19 (t, 4,0) 13 145,2 145,3 - 14 41,7 41,8 - 15 28,3 28,5 0,82 (m)/0,87 (m) 16 26,2 26,3 0,95 (m)/1,76 (m) 17 32,5 32,4 - 18 47,3 47,4 1,93 (m) 19 46,8 46,9 1,00 (m)/1,66 (m) 20 31,2 31,2 - 21 34,7 34,7 1,20 (m)/1,40 (m) 22 37,1 37,3 1,08 (m)/1,33 (m) 23 28,0 28,2 0,86 (s) 24 16,7 16,9 0,97 (s) 25 15,6 15,7 0,98 (s) 26 18,3 18,4 0,86 (s) 27 25,9 26,1 1,14 (s) 28 26,9 26,9 0,84 (s) 29 33,3 33,3 0,88 (s) 30 23,7 23,8 0,87 (s) COCH3 21,3 21,4 2,06 (s) CO 171,0 171,1 - a Đo trong CDCl3, b100 MHz, c 400 MHz, #δC của β-amyrin acetate[58] Trên phổ HMBC thấy tương tác HMBC giữa H-23 (δH 0,86)/ H-24 (δH 0,97) và C-3 (δC 81,1)/ C-4 (δC 37,8)/ C-5 (δC 55,4); giữa H-3 (δH 4,51) và C-1 (δC 38,4)/ C-4 (δC 37,8)/ COCH3 (δC 171,1); giữa proton acetoxy (δH 2,06) và COCH3 (δC 171,1) gợi ý vị trí của nhóm acetoxy tại C-3 và hai nhóm methyl tại C-4. Tương tác HMBC giữa H-25 (δH 0,98) và C-1 (δC 38,4)/ C-5 (δC 55,4)/ C-9 (δC 47,7)/ C-10 (δC 37,0); giữa H-26 (δH 0,86) và C-7 (δC 32,6)/ C-8 (δC 39,9)/ C-9 (δC 47,7)/ C-14 (δC 60 41,8); giữa H-28 (δH 0,84) và C-16 (δC 26,3)/ C-17 (δC 32,4)/ C-18 (δC 47,4)/ C-22 (δC 37,3); giữa H-29 (δH 0,88)/ H-30 (δH 0,87) và C-19 (δC 46,9)/ C-20 (δC 31,2)/ C- 21 (δC 34,7) gợi ý vị trí nhóm methyl tại C-8, C-10, C-17 và hai nhóm methyl tại C- 20. Tương tác HMBC giữa giữa H-27 (δH 1,14) và C-8 (δC 39,9)/ C-13 (δC 145,3)/ C-14 (δC 41,8)/ C-15 (δC 28,5) gợi ý vị trí của liên kết đôi tại C-12/C-13 và nhóm methyl tại C-8. Từ các phân tích trên và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc của hợp chất TB2 được xác định β-amyrin acetate. Hợp chất này lần đầu tiên phân lập được từ chi Trichosanthes. 3.1.1.3. Hợp chất TB3: ergosta-6,22-dien-3β,5α,8α-triol Hình 3.11. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TB3 Hợp chất TB3 thu được ở dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-NMR của TB3 xuất hiện tín hiệu của bốn proton olefin tại δH 5,12 (1H, m), 5,17 (1H, m), 6,22 (1H, d, J = 8,4 Hz) và 6,48 (1H, d, J = 8,6 Hz); một proton oxymethine tại δH 3,95 (1H, m) và sáu nhóm methyl tại δH 0,80 (3H, s), 0,81 (3H, s), 0,82 (3H, s), 0,86 (3H, s), 0,89 (3H, d, J = 7,2 Hz) và 0,98 (3H, d, J = 6,6 Hz). Phổ 13C-NMR của hợp chất TB3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 28 carbon, bao gồm: bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro; mười một carbon methine; bảy carbon methylene và sáu carbon methyl. Phân tích dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của TB3 có thể dự đoán đây là hợp chất thuộc khung sterol và giống với ergosta-6,22-dien-3β,5α,8α-triol [54]. Trên phổ HMBC thấy xuất hiện tương tác HMBC giữa H-6 (δH 6,48) và C-4 (δC 37,0)/ C-5 (δC 82,3)/ C-8 (δC 79,5); giữa H-7 (δH 6,22) và C-5 (δC 82,3)/ C-8 (δC 79,5)/ C-9 (δC 51,7); giữa H-18 (δH 0,80) và C-12 (δC 30,1)/ C-13 (δC 44,6)/ C-14 (δC 56,3)/ C-17 (δC 33,1); giữa H-19 (δH 0,86) và C-1 (δC 34,8)/ C-5 (δC 82,3)/ C-9 (δC 51,7)/ C-10 (δC 37,0) gợi ý vị trí của nối đôi tại C-6/C-7, nhóm hydroxy tại C-5 và C-8 và nhóm methyl tại C-10 và C-13. Tương tác HMBC giữa H-21 (δH 0,89) và 61 C-17 (δC 33,1)/ C-20 (δC 42,8)/ C-22 (δC 132,5); giữa H-22 (δH 5,20)/ H-23 (δH 5,12) và C-20 (δC 42,8), C-21 (δC 17,6), C-24 (δC 39,8); giữa H-28 (δH 0,98) và C- 23 (δC 135,4)/ C-24 (δC 39,8)/ C-25 (δC 51,2); H-26 (δH 0,82)/ H-27 (δH 0,81) và C- 24 (δC 39,8)/ C-25 (δC 51,2) gợi ý vị trí của nối đôi tại C-22/C-23, nhóm methyl tại C-20, C-24 và 2 nhóm methyl tại C-25. Từ các phân tích trên và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [54], cấu trúc của hợp chất TB3 được xác định là ergosta-6,22-dien-3β,5α,8α-triol. Hợp chất này lần đầu tiên phân lập được từ chi Trichosanthes. Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất TB3 và hợp chất tham khảo C δCa,# δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 1 34,7 34,8 1,67 (m)/1,92 (m) 2 39,3 39,4 1,93 (m) 3 66,5 66,5 3,95 (m) 4 36,9 37,0 1,91 (m)/2,09 (m) 5 82,2 82,3 - 6 135,4 135,6 6,48 (d, 8,4) 7 130,7 130,9 6,22 (d, 8,4) 8 79,4 79,5 - 9 51,7 51,7 1,54 (m) 10 37,0 37,0 - 11 20,6 20,6 1,56 (m) 12 30,1 30,1 1,52 (m)/1,83 (m) 13 44,6 44,6 - 14 56,2 56,3 1,21 (m) 15 23,4 23,4 1,21 (m)/1,50 (m) 16 28,6 28,7 1,07 (m) 17 33,1 33,1 1,66 (m) 18 12,9 12,9 0,80 (s) 19 18,2 18,2 0,86 (s) 20 42,8 42,8 1,83 (m) 21 17,6 17,6 0,89 (d, 7,2) 22 132,3 132,5 5,20 (m) 23 135,2 135,4 5,12 (m) 24 39,7 39,8 2,00 (m) 25 51,1 51,2 1,48 (m) 26 19,9 20,0 0,81 (d, 6.0) 27 19,6 19,7 0,81 (d, 6.0) 28 20,9 20,9 0,98 (d, 6,6) a Đo trong CDCl3, b100 MHz, c 600 MHz, # δC của ergosta-6,22-dien-3β,5α,8α-triol [54] 62 3.1.1.4. Hợp chất TB4: spinasterol Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của TB4 Hợp chất TB4 thu được ở dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-NMR của TB4 xuất hiện tín hiệu của ba proton olefin tại δH 5,02 (1H, dd, J = 8,4, 15,2 Hz) và 5,15 (2H, m); một proton oxymethine tại δH 3,59 (1H, m); và sáu nhóm methyl tại δH 0,55 (3H, s), 0,79 (3H, s), 0,80 (3H, s), 0,81 (3H, t, J = 6,0 Hz), 0,85 (3H, d, J = 6,0 Hz) và 1,02 (3H, d, J = 6,8 Hz). Từ Phổ 13C-NMR của hợp chất TB4 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 29 carbon, bao gồm: ba carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC: 43,2 (C-13), 34,1 (C-10), 139,6 (C-8); mười một carbon methine tại δC: 31,8 (C-25), 40,2 (C-5), 40,7 (C-20), 49,4 (C-9), 51,2 (C-24), 55,0 (C-14), 55,9 (C- 17), 71,0 (C-3), 117,5 (C-7), 129,5 (C-23), 138,2 (C-22); chín carbon methylene tại δC: 21,3 (C-11), 22,9 (C-15), 25,3 (C-28), 28,4 (C-16), 29,6 (C-6), 31,4 (C-2), 37,0 (C-1), 37,9 (C-4), 39,4 (C-12) và sáu carbon methyl tại δC: 12,0 (C-18), 12,2 (C-29), 12,9 (C- 19), 19,0 (C-26), 21,0 (C-27), 21,5 (C-21). Phân tích số liệu phổ 1H và 13C-NMR cho thấy số liệu phổ của hợp chất TB4 giống với của hợp chất spinasterol [55] đã gợi ý cấu trúc của hợp chất này là spinasterol. 3.1.1.5. Hợp chất TB5: 4α,14α-dimethyl-9,19-cyclo-5α,9β-ergost-24(28)-en-3β-ol Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của TB5 63 Hợp chất TB5 thu được ở dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-NMR của TB5 xuất hiện tín hiệu của proton olefin tại δH 4,66 (1H, br s)/ 4,71 (1H, br s); một proton oxymethine tại δH 3,22 (1H, m) và sáu nhóm methyl tại δH 0,90 (6H, br s), 0,97 (3H, s), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,01 (3H, d, J = 7,0 Hz) và 1,03 (3H, d, J = 7,0 Hz), điều này gợi ý đây là một hợp chất sterol. Phổ 13C-NMR của hợp chất TB5 xuất hiện tín hiệu cộng hưởn