Luận án Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học của ba loài thực vật ngập mặn vùng ven biển Việt Nam: Cỏ chông (spinifex littoreus), hếp (scaevola taccada) và cóc đỏ (lumnitzera littorea)

Cóc đỏ Phân đoạn Fr9 (95,8 mg) có chất rắn kết tinh, lọc và tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20 (MeOH 100%) được chất CĐ9 (32 mg) ở dạng tinh thể màu trắng. Sắc ký cột silica gel phân đoạn Fr8 (250 mg) với hệ n-hexane : EtOAc (8:2→0:1); EtOAc : MeOH (99:1→1:1) thu được chất CĐ10 (30 mg) dạng tinh thể màu trắng.  Chất CĐ9: 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl - 2’,3’,4’,6’- tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside Rf = 0,4 (CH2Cl2: MeOH, 8:2). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): xem bảng 3.10  Chất CĐ10: 1,3,4,5-tetra-O-acetyl fructopyranose Rf = 0,4 (CH2Cl2: MeOH, 8:2). (+)-ESI-MS (m/z): 371 [M+Na] +(100%). 1H NMR (CD3OD, 500 MHz), 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): bảng 3.11. 2.6. Phân lập, tinh chế các chất từ mẫu cây Cỏ chông Sau khi khảo sát sơ bộ bằng sắc ký bản mỏng và thăm dò hoạt tính sinh học của 5 dịch chiết gồm n-hexane, CH2Cl2, ethyl acetate, methanol, n-butanol của 3 bộ Cặn MeOH lá (25g) CĐML5 (400 mg) 9 phân đoạn (Fr1→Fr9) Fr9 (95.8 mg) CĐ9 (32 mg) Sephadex LH20, M 100% Fr8 (250 mg) CĐ10 (30 mg) SKC silica gel H:E (8:2→0:1); E:M (99:1→1:1) 1. Acetyl hóa . 2. SKC silica gel sản phẩm acetyl hóa, với H:D (9:1→1:1); D:M (98:2→95:5) SKC silica gel E:M (95:5→6:4), E:M:W (1:1:0.1→3:7:0.1) ; M : W (2:1) được 16 phân đoạn ( CĐML1→CĐLM16) H: n-hexane E: ethyl acetate D: Dichloromethan M: methanol W: nước 51 phận thân, hoa và rễ, chúng tôi đã chọn đối tượng để nghiên cứu là cặn n-hexane và n-butanol của hoa Cỏ chông. 2.6.1. Điều chế các cặn chiết từ hoa Cỏ chông Bột mẫu hoa Cỏ chông (1.5 kg) được chiết theo quy trình chiết tổng (hình 2.11) Hình 2.11. Sơ đồ chiết mẫu hoa Cỏ chông (Spinifex littoreus) Bảng 2.3. Hàm lượng % các cặn chiết so với mẫu khô TT Tên cặn chiết Số gam thu được % so với mẫu khô 1 Cặn n-hexane hoa 28 g 35 % 2 Cặn ethyl acetate hoa 14 g 1,25 % 3 Cặn n-butanol hoa 21 g 26 % 2.6.2. Phân lập, tinh chế các chất từ hoa Cỏ chông 2.6.2.1. Phân lập, tinh chế các chất từ cặn chiết n-hexane hoa Cỏ chông 28 gam cặn chiết n-hexane hoa Cỏ chông được chạy sắc ký cột với hệ dung môi n-hexane : EtOAc từ (1:0→0:1) thu được 32 phân đoạn gồm SL1.1 – SL1.32. Mẫu hoa Cỏ chông (1.5 kg) Cặn tổng (80 g) 1. Thêm 200 ml W. 2. Chiết phân lớp lần lượt với H-E-B (3 lần/mỗi dung môi). 3. Cất loại dung môi. Cặn n-butanol (21g) Cặn n-hexan (28 g) Cặn EtOAc (14 g) 1. Chiết siêu âm với cồn (3x1.5 l) 2. Cô quay H: n-hexane E: ethyl acetate B: n- butanol M: methanol 52 Hình 2.12. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết n-hexane hoa Cỏ chông  Chất SL1: Neomotienone (lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên) Phân đoạn SL1.4 có chất rắn kết tinh tan trong hỗn hợp n-hexane, ethyl acetate. Lọc và rửa chất rắn bằng dung môi lạnh lần lượt là MeOH, EtOAc, n- hexane được chất SL1 (20 mg) ở dạng tinh thể hình kim màu trắng, t0nc = 180 - 1850C. Rf = 0,4 (n-hexane : CH2Cl2, 4:6). IR (KBr, ν = cm -1): 1695,32 (C = O), 2946,97 (C-H). (+)-ESI-MS (m/z): 425 [M+H]+ (21%), 447 [M+Na]+ (72%). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): bảng 3.13. Chất SL2: Glycerol-1,2-di-(9Z,12Z-octadecadienoate)-3-dodecanoate Phần nước lọc sau khi lọc tinh thể SL1 ở phân đoạn SL1.4 được chạy sắc ký cột silica gel hệ n-hexane : EtOAc(1:0→3:7) thu được 19 phân đoạn (Fr1→Fr19). Sắc ký cột sephadex phân đoạn Fr10 (150 mg) được chất SL2 (11 mg) ở dạng dầu màu vàng. Rf = 0,3 (n-hexane : CH2Cl2, 4:6). IR (KBr, cm -1): 2928, (-CH alkan), 1741 (C=O ester). (+)-ESI-MS (m/z): 799,39 [M+H]+ (30%), 354,3 [M+2H- C11H23CO-C17H31CO] +(100%). Công thức phân tử là C51H90O6 (M = 798). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz), δ (ppm), J (Hz): 5,39 –5,31 (8H, m, -CH=CH-), 5,26 Cặn n- hexan (28 g) 32 phân đoạn (SL1.1→SL1.32) SL1.4 (3.8 g) SL1 (20 mg) Phần nước SL2 (11 mg) 1. SKC silica gel H:E (1:0→3:7) được 19 phân đoạn (Fr1→Fr19). 2. Sephadex LH20 phân đoạn Fr10 (150 mg) M 100% Kết tinh trong H:E SL1.6 (300 mg) SL3 (10 mg) 1. Acetyl hóa 2. SKC silica gel H:D (8:2) SL1.9 (392 mg) SL4 (13 mg) Sephadex LH20, M SL1.11 (396 mg) SL5 (16 mg) Kết tinh trong H:E SL1.32 (200 mg) SL6 (20 mg) Kết tinh trong H: E SKC silica gel H:E (1:0→0:1) H: n-hexane E: ethylacetate D: Dichloromethan M: methanol 53 (1H, m, H-2), 4,29 (2H, dd, J = 12,0; 4,5 Hz, H1a, H3a), 4,14 (2H, dd, J = 12,0; 5,5 Hz, H1b, H3b), 2,80 – 2,75 (4H, m, -CH=CH-CH2-CH=CH-), 2,32 – 2,29 (6H, m, OCOCH2CH2), 2,07 – 2,00 (8H, m, CH2CH2-CH=CH-), 1,61 – 1,56 (6H, m, OCOCH2CH2), 1,38 – 1,22 (44H, br s), 0,90 – 0,83 (9H, m). 13CNMR (CDCl3, 125 MHz), δ (ppm): 173,29; 173,24; 172,85 (COO), 131,97, 130,24, 130,03, 129,68, 128,31, 128,26, 127,77, 127,13 (CH=CH), 68,91 (CH-O), 62,12 (2xCH2-O), 38,77 - 20,56 (CH2), 14,27, 14,11, 14,07 (CH3).  Chất SL3: n-hexacosanyl acetate Acetyl hóa 20 mg chất rắn ở phân đoạn SL1.6 với pyridin và (CH3CO)2O, rồi tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel hệ n-hexane : CH2Cl2 (8:2) được chất SL3 (10 mg). (+)-ESI-MS (m/z): 448 [M+Na+H]+. Công thức phân tử là C28H56O2, M = 424. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): 4,05 (2H, t, J = 6,5 Hz, - CH2-OCOCH3), 2,04 (3H, s, CH3COO), 1,60 (2H, m, CH2CH2OCO), 1,28 (46H, br s), 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, -CH3). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz), δC (ppm): 171,27 (CH3COO), 64,70 (CH2OH), 31,94 – 22,71 (CH2), 21,02 (CH3CO),14,13 (CH3).  Chất SL4: β-sitosterol Sắc ký cột sephadex phân đoạn SL1.9 (392 mg) bằng MeOH 100% được chất SL4 (13 mg) dạng tinh thể. Sắc ký bản mỏng so sánh giữa SL4 với chất chuẩn có trong phòng thí nghiệm và phổ 1H NMR đã xác định chất SL4 là β-sitosterol.  Chất SL5: Stigmasterol Phân đoạn SL1.11 (396 mg) có chất rắn kết tinh hình kim, lọc và rửa được chất SL5 (16 mg). Sắc ký bản mỏng so sánh giữa SL5 với chất chuẩn có trong phòng thí nghiệm và phổ 1H NMR đã xác định chất SL5 là stigmasterol. Chất SL6: β-sitosterol glucoside Phân đoạn SL1.32 (200 mg) có chất rắn, lọc và rửa được chất SL6. Chất SL6 được xác định là β-sitosterol glucoside dựa vào so sánh sắc ký bản mỏng với chất chuẩn có trong phòng thí nghiệm và phổ 1H NMR. 2.6.2.2. Phân lập, tinh chế các chất từ cặn chiết n-butanol hoa Cỏ chông 54 21 g cặn n-butanol hoa Cỏ chông được chạy sắc ký cột với hệ CH2Cl2 : MeOH (95:5→0:1); MeOH : H2O (1:1) thu được 25 phân đoạn SL3.1 - SL3.25. Hình 2.13. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết n-buthanol hoa Cỏ chông  Chất SL7: (S)-(1,4- Dioxaspiro [4.5]decan-2-yl) methanol (lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên) Sắc ký cột silica gel phân đoạn SL3.2 (330 mg) với hệ n-hexane : CH2Cl2 (97:3→45:55) được chất SL7 (35 mg) ở dạng dầu. Rf = 0,3 (CH2Cl2 : MeOH, 97:3). [α]D 25 = - 3,8 (MeOH, c = 0.1). HR-(+)-ESI-MS (m/z): 173,1173 [M+H]+ (95%); 195,0993 [M+Na]+ (80%). 1H NMR (CDCl3, CD3OD, 500 MHz), δ (ppm), J (Hz): Glycerol: 4,24 – 4,20 (1H, m, H-2), 4,04 (1H, dd, J = 6,5; 11,5 Hz, H3α), 3,76 (1H, dd, J = 6,5; 8,5 Hz, H3β), 3,66 (1H, dd, J = 4,0; 11,5 Hz, H1α), 3,59 (1H, dd, J = 5,0; 11,5 Hz, H1β). Cyclohexane: 1,66 – 1,55 (8H, m, H-2’, 3’, 5’, 6’), 1,66 – 1,55 (2H, m, H-4’). 13C NMR (CDCl3, CD3OD, 125 MHz), δ (ppm): Glycerol: 75,7 (C- 2), 65,45 (C-3), 62,94 (C-1). Cyclohexane: 109,91 (C-1’), 36,23 (C-2’), 34,63 (C- 6’), 24,97 (C-4’), 23,85 (C-5’), 23,63 (C-3’). Cặn n-butanol (21 g) 25 phân đoạn (SL3.1→SL3.25) SL3.2 (330 mg) SL7 (35 mg) SKC silicagel H:D (97:3→45:55) SL3.4 (120 mg) SL6 (36 mg) Kết tinh trong M SL3.6 (185 mg) SL8 (13 mg) SKC silica gel H:E (6:4→2:8); H:E:M (2:8:0.5) SL3.8 (330 mg) Fr4 (12 mg) SL10 (10 mg) SL10a (7 mg) 1. Acetyl hóa 2. Silica gel D:M (97:3) Sephadex LH20, M 100% Fr2 (34 mg) Sephadex LH20, M 100% SL9 (7 mg) SKC silica gel H:A (7:3→2:8) thu được 5 phân đoạn (Fr1→Fr5) SKC silica gel D:M (95:5→0:1), M:W (1:1) H: n-hexane E: ethyl acetate A: aceton M: methanol 55  Chất SL8: n-butyl-α-D-fructofuranoside Sắc ký cột silica gel phân đoạn SL3.6 (185 mg) bằng hệ n-hexane : EtOAc (6:4→2:8); n-hexane : EtOAc : MeOH (2:8:0.5) được SL8 (13mg) dạng dầu, không màu. Rf = 0,3 (n-hexane : EtOAc : MeOH, 2:8:0.5). [α]D 25 = + 950 (c = 0,1, MeOH). HR-(+)-ESI-MS (m/z): 256,2705 [M+H2O+2H] + (100%). C10H20O6, M = 236. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): bảng 3.15.  Chất SL9: Thymidine Sắc ký cột silica gel phân đoạn SL3.8 (330 mg) với hệ n-hexane : aceton (7:3→2:8) được 5 phân đoạn (Fr1→Fr5). Tinh chế phân đoạn Fr2 (34 mg) bằng sắc ký cột sephadex LH20, MeOH 100% được SL9 (7 mg) ở dạng rắn màu trắng. Rf = 0,4 (n-hexane : aceton, 4:6). (-)-ESI-MS (m/z): 240,9 [M-H]-. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): 7,82 (1H, s, H-6), 6,29 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-1´), 4,41 (1H, br s, H-3´), 3,90 (1H, m, H-4´), 3,81 (1H, d, J = 11,5 Hz, H5´α), 3,74 (1H, dd, J = 12,0, 3,0 Hz, H5´β), 2,24 (2H, m, H-2´), 1,90 (3H, s, CH3). 13C NMR (CD3OD, 125 MHz), δC (ppm): 166,41 (C-4), 152,39 (C-2), 138,17 (C-6), 111,55 (C-5), 88,82 (C-4´), 86,27 (C-1´), 72,2 (C-3´), 62,84 (C-5´),41,18 (C-2´), 12,42 (CH3).  Chất SL10: 2,4-dimethoxyphenyl-1-β-D-glucopyranoside Tinh chế phân đoạn Fr4 (12 mg) bằng sắc ký cột sephadex (MeOH 100%) được chất SL10 (10 mg) ở dạng bột, màu trắng. Rf = 0,3 (CH2Cl2 : MeOH, 85:15). (-)HR-ESI-MS (m/z): 351,0872 [M+Cl]- (40%). (+)-ESI-MS (m/z): 339 [M+Na]+. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz), δ (ppm), J (Hz): Glucose: 4,80 (1H, d, J = 7,5, H- anomer), 3,48 – 3,35 (7H, m), 3,88 – 3,87 (1H, m), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H6’α), 3,70 (1H, d, J = 12,0 Hz, H6’β). Vòng benzen: 6,87 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 6,84 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-3), 6,69 (1H, dd, J = 3,0; 8,5 Hz, H-5), 3,83 (3H, s, 2-OCH3), 3.80 (3H, s, 4-OCH3). 13C NMR (CD3OD, 500 MHz), δ (ppm): Glucose: 103,46 (C-anomer), 78,24 (C-2’), 74,95 (C-3’), 71,56 (C-4’), 78,04 (C-5’), 62,64 (C-6’). Vòng benzen: 153,94 (C-1’), 151,15 (C-2’), 146,06 (C-4’), 114,06 (C-6’), 109,35 (C-5’), 104,14 (C-3’), 57,17 (4’-OCH3), 56,43 (2’-OCH3).  Chất SL10a: 2,4-dimethoxyphenyl-1-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranoside) 56 Để khẳng định thêm cấu trúc của SL10, chúng tôi đã acetyl hóa SL10 bằng tác nhân pyridin và (CH3CO)2O được SL10a (7 mg). (+)-ESI-MS (m/z): 507,16 [M+Na]+(35%), 523,13 [M+K]+ (100%). 1H NMR (CH3OD, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): Glucose: 5,29 (1H, t, J = 9,5 Hz), 5,24 (1H, t, J = 7,5 Hz), 5,16 (1H, t, J = 9,5 Hz), 5,00 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1’ anomer), 4,28 (1H, dd, J = 12; 5,0 Hz, H6’α), 4,18 (1H, dd, J = 12,5; 2,0 Hz, H6’β), 3,82 (1H, m), 2,08 (3H, s, CH3COO), 2,07 (3H, s, CH3COO), 2,04 (3H, s, CH3COO), 2,03 (3H, s, CH3COO). Vòng benzen: 6,77 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6), 6,61 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3), 6,54 (1H, dd, J = 9,0; 2,5 Hz, H-5), 3,85 (3H, s, 2-CH3O), 3,84 (3H, s). 57 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu loài Hếp (S. taccada) 3.1.1. Hoạt tính sinh học của loài Hếp Theo tra cứu tài liệu, đến nay đã có một vài công bố về hoạt tính của loài Hếp (mục 1.4.2.4). Tiếp tục nghiên cứu về loài cây này, chúng tôi đã khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane. Kết quả thử nghiệm cho thấy dịch chiết n- hexane âm tính với các dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep G2), ung thư phổi (LU) và ung thư vú (MCF7) (IC50 > 128). 3.1.2. Thành phần hóa học của lá cây Hếp Từ cặn chiết n-hexane lá cây Hếp đã phân lập được 4 hợp chất gồm ST1, ST2, ST3, ST4 và từ cặn chiết ethyl acetate đã phân lập được 6 hợp chất gồm ST4, ST5, ST6, ST7, ST8, ST9.  Glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z, 12Z-octadecadienoate) (ST1) Chất ST1 ở dạng dầu không màu, được phân lập từ dịch chiết n-hexane của lá Hếp. Phổ IR cho đỉnh hấp thụ tại các bước sóng (cm-1) 1744 (-COO ester), 2937 (C-H alkan), 1632 (C=C olefin). Phổ 1H và 13C NMR ghi trong CDCl3 cho thấy tín hiệu của một phân tử glycerol qua các tín hiệu cộng hưởng của một nhóm oxymethine tại δH 5,26 – 5,25 (1H, m)/ δC 68,91 và 2 nhóm oxymethylene tại δH 4,29 (2H, dd, J = 12,0; 4,5 Hz)/ δC 62,11; δH 4,14 (2H, dd, J = 12,0; 6,0 Hz)/ δC 62,11 ppm. Trên phổ 13C NMR và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm carboxyl ester tại δC 173,29; 173,26; 172,85 ppm. Các số liệu phổ cho thấy chất ST1 là một triacylglycerol. Ngoài ra còn thấy tín hiệu cộng hưởng của 2 nối đôi tại δH 5,37 – 5,31 (4H, m)/ δC 130,23; 130,02; 128,10; 127,92 ppm, đặc biệt là sự xuất hiện của một nhóm methylene xen 58 kẽ giữa 2 nối đôi tại δH 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz, =CH-CH2-CH=). Trên phổ 1H NMR còn thấy tín hiệu của 3 nhóm methyl đầu mạch tại δH 0,92 – 0,84 (9H, t, J = 6,5 Hz) và tín hiệu của nhiều nhóm methylene khác tại δH 2,32 – 2,29 (6H, m), 2,06 – 1,99 (4H, m), 1,60 (6H, m), 1,36 – 1,25 (62H, m). Phổ 13C NMR và phổ DEPT còn cho thấy tín hiệu của nhiều nhóm methylene tại δC 34,07 – 22,57 ppm và tín hiệu của 3 nhóm methyl tại δC 14,10; 14,06; 14,06 ppm cùng với tín hiệu của 3 nhóm carboxyl ester tại δC 173,29; 173,26; 172,85 ppm. Hình 3.1. Phổ 13C NMR (phổ giãn) của chất ST1 Kết hợp các dữ liệu phổ IR, 1H và 13C NMR cho thấy chất ST1 là ester của glycerol và các acid béo, trong đó có một acid béo không no chứa 2 nối đối liên hợp. Trên phổ khối (-)-ESI-MS cho tín hiệu của peak ion giả phân tử tại m/z 853,5 [M + Na]+ (10%) phù hợp cho công thức phân tử C53H98O6, M = 830. Tín hiệu của peak ion tại m/z 354 (100%) được dự đoán của mảnh ion [M-C15H31CO- C15H31CO+2H] + tạo ra sau khi tách 2 gốc C15H31CO- của palmitic acid. Qua tính toán cho thấy acid còn lại của phân tử triacylglycerol là C17H35COOH (linoleic acid). 59 Trong tự nhiên hầu hết các acid béo không no đều tồn tại dưới dạng cấu hình Z. Chất ST1 được xác định là glycerol 1,3-dihexadecanoate-2-(9Z,12Z- octadecadienoate). Việc gán các giá trị độ chuyển dịch hóa học 1H và 13C NMR của chất ST1 dựa vào số liệu phổ của triacylglycerol trong tài liệu [123][124]. Chất ST1 lần đầu tiên được phân lập từ loài Hếp (S. taccada).  α-amyrin (ST2) Chất ST2 tách ra ở dạng bột màu trắng từ dịch chiết n-hexane lá cây Hếp. Phổ khối dương (+)-ESI-MS cho tín hiệu của peak ion tại m/z 445,20 [M+H2O+H] + phù hợp cho công thức phân tử của ST2 là C30H50O, M = 426. Phổ 1H NMR ghi trong CDCl3 cho thấy tín hiệu triplet của một proton olefin tại δH 5,15 ppm, tín hiệu multiplet của một nhóm oxymethine tại δH 3,24 (1H, m), tín hiệu của 8 nhóm methyl trong đó có 2 tín hiệu methyl douplet tại δH 0,94; 0,80 ppm và 6 tín hiệu methyl singlet tại δH 1,09; 1,02; 1,01; 0,97; 0,89; 0,81 ppm. Ngoài ra còn có tín hiệu của các nhóm methine và methylene trùng lấp lên nhau trong khoảng δH 2,02 – 1,25. Phổ 13C NMR và phổ DEPT cho thấy có khung triterpenoid qua tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon gồm 2 carbon olefin tại δC 139,62; 124,46 (C=C), một nhóm oxymethine tại δC 79,09 (CH-OH), 8 nhóm methyl tại δC 28,77; 28,15; 23,29; 21,40; 17,48; 16,89; 15,70; 15,64 (CH3), 9 nhóm methylene tại δC 18,38; 23,40; 26,65; 27,3; 28,14; 31,28; 32,97; 3883; 41,56 (CH2), 5 nhóm methine tại δC 39,64; 39,70; 47,76; 52,22; 59,11 (-CH), cùng với 5 carbon bậc bốn tại δC 33,70; 36,6; 38,7; 40,7; 42,0 ppm. Số liệu phổ NMR được gán trên cơ sở phân tích số liệu phổ NMR 2 chiều (HSQC, COSY và HMBC) và so sánh với tài liệu tham khảo [125]. 60 Hình 3.2. Các tương tác COSY (─) và HMBC (→) chính của chất ST2 Vị trí của nối đôi được khẳng định trên phổ 1H 1H COSY qua tín hiệu tương tác giữa proton olefin H-12 (δH 5,15, t, J = 3,5 Hz) với H-11 (δH 1,94 – 1,92 m), giữa H-11 (δH 1,94 – 1,92 m) với H-9 (δH 1,58 – 1,52 m) và được khẳng định trên phổ HMBC qua tín hiệu tương tác giữa H-12 (δH 5,15 t) / C-14 (δC 42,12); giữa H- 11 (δH 1,94 – 1,92 m) / C-12 (δC 124,46), C-13 (δC 139,62). Ngoài ra tương tác giữa H-2 (δH 2,02 dt, J = 4,5; 13,5 Hz) với H-3 (δH 3,24 m) và H-1 (δH 1,65 m) đã ghép nối các mảnh cấu trúc H-1- H-2 - H-3. Hình 3.3. Phổ 1H 1H COSY của chất ST2 Vị trí của các nhóm methyl được khẳng định trên phổ HMBC qua các tương tác giữa H-23 (δH 1,02 s)/ C-5 (δC 55,22), giữa H-24 (δH 0,81 s) / C-5 (δC 55,22), 61 giữa H-27 (δH 1,09 s) / C-14 (δC 42,12), giữa H-28 (δH 0,89) / C-17 (δC 33,78), giữa H-29 (δH 0,94 d) / C-19 (δC 39,70), giữa H-30 (δH 0,80 d) / C-20 (δC 39,64) và C-19 (δC 39,70) (Phổ HMBC trình bày ở phần phụ lục). Từ việc phân tích phổ NMR một chiều và hai chiều, kết hợp với phổ khối ion dương (+)-ESI-MS, đối chiếu với phổ của hợp chất α-amyrin trong tài liệu tham khảo [125] đã cho phép xác định cấu trúc của chất ST2 là α–amyrin. Hợp chất này có hoạt tính ức chế 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) – một chất gây viêm da ở chuột và là tiền thân của acid ursolic trong quá trình sinh tổng hợp ở thực vật [126][127]. Chất ST2 là một pentacyclic terpenoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đã được phân lập từ nhiều nguồn thực vật như sáp ong. Chất ST2 đã được chúng tôi thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan (Hep G2), ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi (Lu) và ung thư vú cho kết quả âm tính (IC50 >128 μg/ml). Theo tài liệu [128] cho thấy một số ester của α–amyrin như α- amyrin acetate, α-amyrin cinnamate lại có hoạt tính gây độc tế bào (Barros và cộng sự, 2011) và chống viêm hiệu quả (Akihisa và cộng sự, 2010). Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR 1 chiều và 2 chiều của chất ST2 C DEPT δC a,b δH a,c dạng pic (J = Hz) HMBC (H→C) COSY (H→H) 1 CH2 38,83 1,65 m 2 CH2 28,14 2,02 dt (4,5; 13,5) 3 CH 79,09 3,24 m 4 C 38,83 5 CH 55,22 0,75 d (11,0) 6 CH2 18,38 7 CH2 32,97 8 C 40,05 9 CH 47,76 1,58 – 1,52 m 11 10 C 36,93 11 CH2 23,40 1,94 – 1,92 m 12, 13 9, 12 12 CH 124,46 5,15 t (3,5) 14 11 13 C 139,62 62 14 C 42,12 15 CH2 27,30 1,65 – 1,61 m 16 CH2 26,65 17 C 33,78 18 CH 59,11 19 CH 39,70 20 CH 39,64 21 CH2 31,28 22 CH2 41,56 23 CH3 28,77 1,02 s 5 24 CH3 15,04 0,81 s 5 25 CH3 15,70 0,97 s 9 26 CH3 16,89 1,01 s 27 CH3 23,29 1,09 s 14 28 CH3 28,15 0,89 s 17 29 CH3 17,48 0,94 d (7.0) 19 30 CH3 21,40 0,80 d (7.5) 19, 20 ađo trong CDCl3, b500 MHz, c125 MHz  Stigmasterol (ST3) Chất ST3 được phân lập dưới dạng bột, màu trắng. Phổ IR cho đỉnh hấp thụ mạnh ở bước sóng (cm-1) 3397,79 (-OH), 2951,45 (-CH), và 1664,76 (C=C). Phổ 1H NMR cho thấy 2 tín hiệu methyl singlet tại δH 0,69 và 1,02 ppm; một tín hiệu methyl triplet tại δH 0,84 (3H, t, J = 7,1 Hz) cùng với 3 tín hiệu methyl doublet tại δH 1,01 (3H, d, J = 6,7 Hz); 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,81 (3H, d, J = 6,6 63 Hz). Ngoài ra, trên phổ 1H NMR còn có thể quan sát thấy các tín hiệu proton olefin tại δH 5,34 – 5,35 (1H, m), 5,15 (1H, dd, J = 15,2; 8,6 Hz), 5,02 (1H, dd, J = 15,2; 8,7 Hz) và tín hiệu của nhóm oxymethine tại δH 3,49 – 3,54 (1H, m). Các tín hiệu của các proton còn lại bị chồng chập trong khoảng δH 2,3 – 0,8 ppm. Hình 3.4. Phổ 1H NMR của chất ST3 Phổ 13C NMR chỉ ra tín hiệu của 4 carbon olefin tại δC 140,77; 138,31; 129,30; 121,70 ppm và một nhóm oxymethine tại δC 71,80 ppm. Tín hiệu của sáu nhóm methyl xuất hiện tại δC 21,08 (2xCH3); 19,40; 18,99; 12,24 và 12,05 ppm. Tín hiệu còn lại của 7 nhóm methine và 9 nhóm methylene nằm trong khoảng δC 56,88 – 21,22 ppm. Phổ khối ion dương (+)-ESI-MS cho tín hiệu của peak ion giả phân tử tại m/z 413,05 [M+H]+ (100%) phù hợp cho công thức phân tử của ST3 là C29H48O, M = 412. 64 Hình 3.5. Phổ 13C NMR của chất ST3 Các số liệu phổ NMR của chất ST3 đồng nhất với số liệu phổ của stigmasterol [129]. Stigmasterol tồn tại khá phổ biến trong các loài thực vật, có hoạt tính sinh học cao, là một trong những thành phần chính của phytosterol, có tác dụng giảm lượng cholesterol trong máu, kháng viêm, dùng trong tổng hợp progesterone và là tiền chất của vitamin D3 [130]. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của chất ST3 được sắp xếp dựa vào phân tích phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo [129]. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H, 13C NMR của chất ST3 Vị trí ST3 Stigmasterol [129] DEPT δC a,b δH a,c dạng pic (J = Hz) δC a,d δH a,e dạng pic (J = Hz) 1 CH2 37,28 37,6 2 CH2 31,68 32,1 3 CH 71,80 3,52 m 72,1 3,51 tdd (4,5, 4,2, 3,8) 4 CH2 42,32 42,4 5 C 140,77 141,1 6 CH 121,70 5,35 m 121,8 5,31 t (6,1) 65 7 CH2 31,88 31,8 8 CH 31,88 31,8 9 CH 50,18 50,2 10 C 36,53 36,6 11 CH2 21,22 21,5 12 CH2 39,70 39,9 13 C 42,23 42,4 14 CH 56,88 56,8 15 CH2 24,37 24,4 16 CH2 28,91 29,3 17 CH 55,98 56,2 18 CH3 12,05 0,69 s 12,2 0,71 s 19 CH3 18,99 1,02 s 18,9 1,03 s 20 CH 40,49 40,6 21 CH3 21,22 1,01 d (6,7) 21,7 0,91 d (6,2) 22 CH 138,31 5,02 dd (15,2; 8,7) 138,7 4,98 m 23 CH 129,30 5,15 dd (15,2; 8,6) 129,6 5,14 m 24 CH 51,25 46,1 25 CH 31,91 31,7 26 CH3 19,40 0,85 d (6,5) 19,0 0,80 d (6,6) 27 CH3 21,08 0,81 d (6,6) 21,06 0,82 d (6,6) 28 CH2 25,40 25,40 29 CH3 12,24 0,84 t (7,1) 12,26 0,83 t (7,1) ađo trong CDCl3, b125 MHz, c500MHz, d150 MHz, e600 MHz  Myricadiol (ST4) Chất ST4 được phân lập dưới dạng gel trong suốt, mềm từ dịch chiết n- hexane và dịch chiết ethyl acetate lá cây Hếp. Phổ IR cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở bước sóng (cm-1) 3493,99; 3299,90, 3209,79 (-OH), 2981,1 (-CH), 1627,36 (C=C) và 1088,85 (C-O). 66 Phổ 1H NMR của chất ST4 cho 7 tín hiệu methyl singlet tại δH 0,70; 0,86; 0,89; 0.91; 0.93; 0.98 và 1,02 ppm; 1 tín hiệu của proton olefin tại δH 5,41 (1H, d, J = 11 Hz). Ngoài ra, còn thấy tín hiệu của 2 nhóm hydroxyl tại δH 4,25 (2H, br s, 3- OH, 28-OH) cùng với tín hiệu của một nhóm hydroxymethine tại δH 3,17 (1H, br s) và một nhóm hydroxymethylene tại δH 2,98 (1H, m); 2,87 (1H, m). Các tín hiệu còn lại của các nhóm methine và methylene nằm trong vùng δH 2,18 – 1,13 ppm. Hình 3.6. Phổ 1H NMR của chất ST4 Phổ 13C NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon gồm 2 carbon olefin tại δC 157,70 và 115,85 (C=C), 1 nhóm hydroxymethine tại δC 76,79 (-CHOH), 1 nhóm hydroxymethylene tại δC 63,20 (-CH2OH), 7 nhóm methyl tại δC δC 33,46; 29,69; 28,06; 25,77; 21,42; 15,84 và 15,15 (CH3), cùng với 6 tín hiệu carbon bậc 4 tại δC 40,09; 39,02; 38,50; 37,49; 36,89 và 28,19 ppm. Còn lại là tín hiệu của 10 nhóm methylene tại δC 41,05; 37,32; 35,51; 33,13; 32,40; 30,15; 27,32; 26,85; 18,43; 16,95 ppm và 3 nhóm methine tại δC 44,54; 48,69 và 55,09 ppm. 67 Hình 3.7. Phổ 13C NMR của chất ST4 Phổ khối (+)-ESI-MS cho thấy tín hiệu của peak ion tại m/z 443,18 [M+H]+ phù hợp cho công thức phân tử của ST4 là C30H50O2, M = 442. Từ các dữ liệu phổ NMR, MS của ST4 và so sánh với phổ của hợp chất myricadiol trong tài liệu [131] cho thấy hoàn toàn trùng khớp. Myricadiol là thành phần chính được phân lập từ loài S. spinescens thuộc chi Hếp (Scaevola) [131]. Hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào SGC7901 - ung thư dạ dày, MCF7 - ung thư vú và BEL7404 - ung thư gan (IC50 > 100) nhưng lại có hoạt tính kháng viêm mạnh của corticoid [132][133]. Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H, 13C NMR của chất ST4 Vị trí ST4 Myricadiol [131] DEPT δH b,c dạng pic (J = Hz) δC b,d δH ddạng pic (J = Hz) δC d 1 CH2 1,61 m / 1,59 m 37,32 1,61 m / 1,58 m 37,5 2 CH2 1,56 m / 1,53 m 26,85 1,60 m / 1,59 m 26,9 3 CH 3,17 br s 76,79 3,16 dd (4,8; 10,8) 78,5 4 C 38,50 38,5 5 CH 0,72 s 55,09 0,77 dd (2,4; 12,6) 55,3 6 CH2 18,43 18,5 68 7 CH2 2,17 m /1,33 m 41,05 2,01 dt (3,0; 12,6) 1,33 td (3,0; 12,6) 41,1 8 C 39,02 38,8 9 CH 1,44 m 48,69 1,42 m 48,9 10 C 37,49 37,7 11 CH2 16,95 17,1 12 CH2 1,38 m / 1,35 m 33,13 1,66 m / 1,62 m 33,2 13 C 36,89 37,2 14 C 157,70 158,6 15 CH 5,41 m 115,85 5,51 dd (3,0; 8,4) 115,6 16 CH2 2,12 m /1,96 m 30,15 2,14 dd (8,4; 15,0) 1,70 dd (3,0; 15,0) 30,4 17 C 40,09 40,2 18 CH 0,47 m 44,54 0,57 dd (3,6; 13,8) 44,6 19 CH2 1,41 m / 1,13 m 35,51 1,41 m 1,0 dd (3,6; 13,2) 35,6 20 C 28,19 28,3 21 CH2 1,25 m /1,23 m 32,40 1,26 m / 1,24 m 32,4 22 CH2 1,48 m / 1,46 m 27,32 1,5 m / 1,47 m 27,6 23 CH3 0,98 s 28,06 0,97 s 27,8 24 CH3 0,70 s 15,84 0,79 s 15,3 25 CH3 0,88 s 15,15 0,91 s 15,2 26 CH3 1,01 s 25,77 1,06 s 25,8 27 CH3 0,90 s 21,42 0,96 s 21,3 28 CH2 2,98 m / 2,87 m 63,20 3,24 d (10,8) 3,10 d (10,8) 64,8 29 CH3 0,93 s 33,65 0,96 s 33,3 30 CH3 0,86 s 29,69 0,89 s 29,6 3-OH 4,25 br s 28-OH 4,25 br s ađo trong DMSO-d6, b500 MHz, c125MHz, dđo trong CDCl3  n-tritriacontane (ST5) Chất ST5 được phân lập từ cột tổng đầu tiên của cặn ethyl acetate ở dạng tinh thể trắng, tan trong CH2Cl2 nóng. Phổ 1H NMR cho tín hiệu methyl triplet tại δH 0,81 (6H, t, J = 6,7 Hz) và tín hiệu của nhiều nhóm methylene tại δH 1,48 – 1,19 69 (62H, br s). Trên phổ 13C NMR cho thấy tín hiệu của 2 nhóm methyl tại δC 14,12 ppm phù hợp với tích phân của 6 proton ở vùng trường cao trong phổ 1H NMR tại δH 0,81 (6H, t, J = 6,7 Hz) cùng với tín hiệu của nhiều nhóm methylene mạch alkane béo trùng lấp nhau tại δC 31,94 – 22,