Luận án Nghiên cứu thay đổi lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc tại môi trường nồng độ glucose cao

huật WB và biểu đồ phân tích qua phần mềm ImageJ cho thấy sự tăng đáng kể lượng LOX trong protein toàn phần của các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (145±10% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Hình 3.1, Biểu đồ 3.1). N HG LOX 32 KD N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Hình 3.1. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein toàn phần. 55 N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với LOX trong protein toàn phần * Hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào Kết quả WB chỉ ra rằng lượng LOX tại chất nền ngoại bào tăng đáng kể trong môi trường nồng độ glucose cao (154±9% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). (Hình 3.2, Biểu đồ 3.2). N HG LOX 32 KD N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Hình 3.2. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 N HG 56 N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.2. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với hàm lượng LOX tại chất nền ngoại bào. * Hàm lượng LOX trong tế bào Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng lượng LOX quay trở lại tế bào giảm đáng kể trong các tế bào được nuôi cấy ở môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào được nuôi cấy ở môi trường bình thường (62 ± 9% nhóm đối chứng; p < 0.05, n=6) (Hình 3.3, Biểu đồ 3.3). N HG LOX 32 KD N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Hình 3.3. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong tế bào. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 N HG 57 N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.3. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với LOX trong tế bào. * Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng LOX tăng nhẹ trong môi trường nồng độ glucose cao 1 ngày (124±8% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) và 5 ngày (117±6% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6), tăng đáng kể trong môi trường glucose cao 3 ngày (158±11% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) và giảm trong môi trường glucose cao 7 ngày (78±5% của nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Hình 3.4). 0 20 40 60 80 100 120 140 N HG 58 A B C D N HG N HG N HG N HG E Hình 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với LOX bên ngoài tế bào. A, B, C, D: Hình ảnh đại diện và kết quả WB phân tích qua phần mềm ImageJ của các nhóm tế bào được nuôi cấy trong môi trường bình thường (N) và môi 0 50 100 150 200 N HG 0 50 100 150 200 N HG 0 50 100 150 200 N HG 0 50 100 150 200 N HG 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 HG1 HG3 HG5 HG7 59 trường nồng độ glucose cao (HG) trong 1 ngày (A, HG1), 3 ngày (B, HG3), 5 ngày (C, HG5) và 7 ngày (D, HG7). E: Biểu đồ sự thay đổi hàm lượng LOX bên ngoài tế bào của nhóm nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao 1 ngày (HG1), 3 ngày (HG3), 5 ngày (HG5) và 7 ngày (HG7) (đường màu xanh) so với hàm lượng LOX của nhóm nuôi cấy trong môi trường bình thường (đường màu cam). Biểu đồ E cho thấy LOX tăng nhẹ sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao 1 ngày (HG1), đạt đỉnh sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao 3 ngày (HG3), sau đó giảm dần sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao 5 ngày (HG5) và 7 ngày (HG7). Số liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn; P < 0.05; n=6.(Hình 3.4E) 3.2.1.2. Mật độ của LOX + Mật độ LOX trong protein toàn phần: N HG N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Hình 3.5. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein toàn phần 60 N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Biểu đồ 3.4. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao với mật độ LOX trong protein toàn phần. Hình ảnh đại diện về mật độ LOX thu được qua kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng LOX và biểu đồ phân tích theo kết quả ImageJ cho thấy mật độ LOX tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi cấy ở môi trường bình thường (179±7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.4, Hình 3.5). + Mật độ LOX trong protein chất nền ngoại bào: Kết quả phân tích qua phần mềm ImageJ cho thấy mật độ LOX tăng rõ rệt tại chất nền ngoại bào của các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với các tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (160 ± 7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.5). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG 61 N HG N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Hình 3.6. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein chất nền ngoại bào. N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Biểu đồ 3.5. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ LOX trong protein chất nền ngoại bào. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 N HG 62 3.2.1.3. Hoạt động của LOX: Kết quả phân tích hoạt động của LOX cho thấy hoạt động của LOX tăng rõ rệt khi tế bào được nuôi cấy trong điều kiện glucose nồng độ cao (153±15% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.6). N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. Biểu đồ 3.6. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hoạt động của LOX. 3.2.2. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX 3.2.2.1. Tác động của LOXsiRNA tới hàm lượng và mật độ LOX + Hàm lượng của LOX: Phân tích dựa trên phần mềm ImageJ các kết quả thu được từ kỹ thuật WB, cho thấy hàm lượng LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng rõ rệt so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (158 ± 21% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Tác dụng ức chế LOX của LOXsiRNA được thể hiện khi tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với LOXsiRNA, hàm lượng LOX trở về gần mức bình thường (116 ± 13% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.7). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 N HG 63 N HG HG+LOXsiRNA Hình 3.7. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX ở các nhóm tế bào. N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao, HG+LOXsiRNA: Môi trường glucose nồng độ ủ với LOXsiRNA. N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao, HG+LOXsiRNA: Môi trường glucose nồng độ ủ với LOXsiRNA. Biểu đồ 3.7. Tác động ức chế mức độ biểu hiện LOX của LOXsiRNA. + Mật độ LOX Phân tích hình ảnh thu được qua kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy mật độ LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (179 ± 7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với LOXsiRNA, mật độ LOX trở về gần mức bình thường (114 ± 6% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.8). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG HG+LOXsiRNA 64 N HG HG+ LOXsiRNA N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao. HG+LOXsiRNA: Môi trường glucose nồng độ cao ủ với LOXsiRNA. Hình 3.8. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein chất nền ngoại bào. N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOXsiRNA. Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi mật độ LOX trong protein toàn phần. 3.2.2.2. Tác động của BAPN tới hoạt động của LOX: Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt động của LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (160 ± 16% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với BAPN, hoạt động LOX trở về gần mức bình thường (120 ± 9% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.9). 0 50 100 150 200 N HG HG+LOXsiRNA 65 N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose 30mmol/l, HG+BAPN: Môi trường nồng độ glucose 30mmol/l ủ với BAPN. Biểu đồ 3.9. Tác động ức chế hoạt động LOX của BAPN. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG HG+BAPN 66 3.2.3. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động của tế bào 3.2.3.1. Độ thẩm thấu tế bào N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOX siRNA. Biểu đồ 3.10. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới độ thẩm thấu của tế bào nội mô mạch máu võng mạc. Kết quả phân tích độ thẩm thấu cho thấy độ thẩm thấu tế bào tăng đáng kể (299±18% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) khi được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao. Khi các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao được ủ với chất ức chế LOX (LOXsiRNA hoặc BAPN), độ thẩm thấu tế bào giảm rõ rệt (114± 8% nhóm đối chứng và 132±14% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.10). 0 50 100 150 200 250 300 350 67 3.2.3.2. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình * Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT N HG HG+LOXsiRNA N HG HG+BAPN A B A: Hình ảnh WB đại diện và biểu đồ thể hiện tác động của LOXsiRNA tới hàm lượng LOX, B: Hình ảnh WB đại diện và biểu đồ thể hiện tác động của BAPN tới hoạt động của LOX, N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOXsiRNA, HG+BAPN: môi trường nồng độ glucose cao ủ với BAPN. Hình 3.9. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT Phân tích hình ảnh thu được qua kỹ thuật WB cho thấy hoạt động AKT (biểu hiện qua tỷ lệ pAKT/AKT) tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao giảm đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (63 ± 8% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 68 đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với LOXsiRNA hoặc BAPN, hoạt động AKT tăng rõ ràng (87 ± 8% nhóm đối chứng, và 76 ± 10% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6) (Hình 3.9 ). * Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOXsiRNA, HG+BAPN: môi trường nồng độ glucose cao ủ với BAPN. Mũi tên trắng: Tế bào đang xảy ra hiện tượng chết tế bào theo chương trình. Hình 3.10. Hình ảnh nhuộm huỳnh quang thể hiện hiện tượng chết tế bào theo chương trình ở các nhóm tế bào. N HG HG+LOX siRNA HG+BAPN 69 B C A: Tác động của giảm hàm lượng LOX do LOXsiRNA, B: Tác động của giảm hoạt động của LOX do BAPN, N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOXsiRNA, HG+BAPN: môi trường nồng độ glucose cao ủ với BAPN. Biểu đồ 3.11. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình biểu thị qua số lượng tế bào chết/1000 tế bào. Phân tích kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy số lượng tế bào chết/1000 tế bào tăng rõ rệt trong môi trường nồng độ glucose cao so với môi trường bình thường (4.68 ± 0.9 và 1.48 ± 0.32, tương ứng, p<0.05, n=6) và giảm khi tế bào được ủ LOXsiRNA (2.78 ± 0.37, p<0.05, n=6). Tương tự như vậy, với thử nghiệm BAPN, môi trường nồng độ cao có ủ BAPN ức chế 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 70 hoạt động của LOX, số lượng tế bào chết/1000 tế bào giảm đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ cao đơn thuần (2.85 ± 0.34 và 4.38 ± 0.84, tương ứng, p<0.05, n=6). (Biểu đồ 3.11). 3.3. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trƣờng nồng độ glucose cao 3.3.1. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào 3.3.1.1. Trong protein toàn phần Phân tích kết quả thu được qua kỹ thuật WB cho thấy sự tăng đáng kể lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein toàn phần của các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (144±12% nhóm đối chứng và 168±11% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.12). N HG Collagen IV Fibronectin 300 kD 262 kD N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Hình 3.11. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein toàn phần. N HG 300 kD 262 kD Coll IV FN 71 A B A: LOX liên kết Coll IV, B: LOX liên kết FN, N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.12. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám dính của LOX với Coll IV và FN trong protein toàn phần. 3.3.1.2. Trong protein chất nền ngoại bào Kết quả WB chỉ ra rằng lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (138±20% nhóm đối chứng và 156±21% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6) (Biểu đồ 3.13). N HG Coll IV FN 300 kD 262 kD N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Hình 3.12. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG 72 A B A: LOX liên kết Coll IV, B: LOX liên kết FN, N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.13. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám dính của LOX với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào. 3.2.2. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào 3.3.2.1. Trong protein toàn phần * Mật độ LOX liên kết với Coll IV: Mật độ LOX liên kết với Coll IV trong protein toàn phần tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (192±21% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) thể hiện qua hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang đại diện và biểu đồ phân tích mật độ liên kết (Hình 3.13, biểu đồ 3.14 ). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG 73 N HG N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Hình 3.13. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể hiện liên kết của LOX với Coll IV trong protein toàn phần. N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.14. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với Coll IV trong protein toàn phần. 0 50 100 150 200 250 N HG 74 * Mật độ LOX liên kết với FN: N HG N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Hình 3.14. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi đồng tiêu thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần. 75 N HG N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Hình 3.15. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần. N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.15. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với FN trong protein toàn phần. Mật độ LOX liên kết với FN trong protein toàn phần tăng mạnh ở nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (183±19% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) thể hiện qua hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang đại diện (Hình 3.14, hình 3.15) và biểu đồ phân tích mật độ liên kết (Biểu đồ 3.15). 0 50 100 150 200 250 N HG 76 3.3.2.2. Trong protein chất nền ngoại bào * Mật độ LOX liên kết với Coll IV: Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang đại diện và biểu đồ phân tích mật độ liên kết qua phần mềm ImageJ cho thấy mật độ LOX liên kết với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào tăng đáng kể ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (143±10% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Hình 3.16, biểu đồ 3.16). N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.16. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 N HG 77 N HG Coll IV LOX Coll IV +LOX N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Hình 3.16. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang thể hiện liên kết của LOX với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. 78 * Mật độ LOX liên kết với FN: N HG LOX FN FN +LOX N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Hình 3.17. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần. 79 N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao. Biểu đồ 3.17. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. Kết quả miễn dịch huỳnh quang cho thấy mật độ LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (158±15% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) (Hình 3.17, Biểu đồ 3.17). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 N HG 80 Chƣơng 4 BÀN LUẬN 4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX 4.1.1. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX Màng đáy mao mạch dày lên từ lâu đã được phát hiện trong bệnh võng mạc đái tháo đường và được chứng minh có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh này [77-153], nhưng nguyên nhân và hậu quả của sự thay đổi vi cấu trúc này chưa được hiểu rõ. Chức năng quan trọng của màng đáy là hàng rào thấm chọn lọc ngăn ngừa các chất từ trong lòng mạch thoát ra ngoài. Hàng rào này bị thay đổi cấu trúc do đái tháo đường dẫn đến tăng tính thấm mạch máu [6]. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra sự thay đổi trong cấu trúc của màng đáy có thể gây tổn hại chức năng của nó [154]. Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra vai trò của hiện tượng dày màng đáy mao mạch trong sự phát triển các mao mạch không có tế bào và mất tế bào ngoại mạch [74]. Điều nghịch lý là màng đáy mao mạch dày lên lại gây tăng rò rỉ mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Để giải thích cho hiện tượng này, các báo cáo đã đề xuất rằng có sự thay đổi các liên kết chéo giữa các thành phần của màng đáy gây ảnh hưởng đến quá trình hình thành và cấu trúc của màng đáy, do đó tổn hại hàng rào mạch máu võng mạc [155]. Nghiên cứu của Lucero, Rodriguez và Nishioka cho thấy rằng tính toàn vẹn của màng đáy và cấu trúc chất nền ngoại bào đòi hỏi lượng thích hợp liên kết chéo phụ thuộc LOX [15-109]. LOX là một enzym liên kết chéo đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và trưởng thành của màng đáy [127]. LOX điều hoà quá trình hình thành liên kết cộng hoá trị giữa các sợi collagen tạo thành dạng collagen không bị hoà tan và có độ bền kéo cần thiết cho chức năng của mô liên kết bình thường, từ đó tạo nên lớp chất nền ngoại bào bền vững [127-129]. Sự toàn 81 vẹn, ổn định và chức năng của màng đáy phụ thuộc phần lớn vào liên kết chéo giữa các sợi collagen vì các liên kết này tham gia vào cấu trúc vật lý và cơ học tạo nên màng đáy hoàn chỉnh [156]. Tuy nhiên, nếu các liên kết chéo này quá nhiều có thể dẫn đến dày và tổn hại chức năng màng đáy do hình thành các bó sợi collagen bất thường, gây tích luỹ chất nền ngoại bào như trong các bệnh xơ cơ [157]. Vì màng đáy trải qua quá trình thay đổi về mô học và hoá sinh do tình trạng đường huyết cao, sự dày màng đáy thúc đẩy hình thành các mạch máu không có tế bào và mất tế bào ngoại mạch, từ đó tiến triển giai đoạn sớm của bệnh võng mạc đái tháo đường. Một vài nghiên cứu sử dụng tế bào hoặc mô hình động vật mắc đái tháo đường chỉ ra rằng nồng độ glucose cao hoặc đường huyết cao gây tăng đáng kể hàm lượng và hoạt động của LOX ở thận, phổi [158]. Ở bệnh nhân mắc đái tháo đường, tăng hoạt động của LOX được phát hiện ở các mô da sinh thiết và dịch kính biểu hiện bằng tăng các liên chéo collagen qua trung gian LOX và các sản phẩm glycat hoá giai đoạn sớm, glucitolyllysine và glucitolylhydroxylysine, các sản phẩm để đo lường gián tiếp hoạt động của LOX [159]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy có sự biểu hiện quá mức enzym LOX ở võng mạc chuột mắc đái tháo đường [155]. Tuy nhiên sự thay đổi của LOX ở mức độ tế bào cũng như tác động của sự thay đổi đó tới hoạt động của tế bào còn chưa biết rõ. Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá mức độ biểu hiện, hoạt động của LOX và tác động của sự thay đổi này tới độ thẩm thấu tế bào và hiện tượng chết tế bào theo chương trình ở tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong điều kiện môi trường nồng độ glucose cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng nồng độ glucose cao ảnh hưởng đáng kể tới mức độ biểu hiện LOX. Đây là nghiên cứu đầu tiên phân tích chi tiết tác động của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy tới mức độ biểu hiện của LOX ở bên trong và bên ngoài tế bào. Theo đó, lượng LOX 82 trong protein toàn phần tăng, trong khi lượng LOX quay trở lại tế bào giảm sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao. Thêm vào đó, nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy tác động của môi trường nồng độ glucose cao đối với mức độ biểu hiện LOX ở môi trường ngoại bào có sự biến thiên theo thời gian. Ngoài ra môi trường glucose cao gây tăng mật độ LOX và hoạt động LOX. Sự rối loạn này được điều chỉnh bởi các chất ức chế LOX như LOXsiRNA và BAPN. Kết quả này củng cố thêm cho phát hiện trước đây là nồng độ enzym LOX tăng ở võng mạc chuột mắc đái tháo đường và có sự tăng các liên kết chéo phụ thuộc LOX ở collagen da trong đái tháo đường [160]. Thông thường, LOX được hình thành ở bên ngoài tế bào và được coi là 1 enzym ngoại bào, nhưng các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng LOX cũng có mặt trong tế bào ở cả bào tương và nhân [161]. LOX trưởng thành được phát hiện di chuyển từ môi trường ngoại bào vào trong bào tương và tập trung ở nhân [161-162]. LOX đã được xác định trong nhân của nhiều loại tế bào và mô khác nhau để thực hiện chức năng xúc tác của nó [162-163]. Trong bào tương, LOX được xác định ở bộ khung tế bào và hệ thống vi ống [161]. Đặc biệt là, mặc dù có sự xuất hiện của BAPN, một chất ức chế LOX, hoạt động của LOX vẫn diễn ra ở trong nhân tế bào, gợi ý rằng LOX trong nhân tế bào được bảo vệ và duy trì hoạt tính. Một nghiên cứu chỉ ra rằng, LOX trưởng thành có thể di chuyển từ môi trường ngoại bào vào trong bào tương tế bào và tập trung ở trong nhân. Quá trình này có thể diễn ra do sự tương tác giữa vùng xúc tác của LOX với p66β, một chất ức chế phiên mã. Kết hợp lại, những nghiên cứu này chỉ ra rằng, LOX quay trở lại tế bào vào trong bào tương và nhân đã được ghi nhận, tuy nhiên, mục đích và chức năng của nó còn chưa rõ ràng. Mặc dù chức năng sinh học của LOX trong nhân tế bào còn chưa được hiểu đầy đủ, các nghiên cứu chỉ ra rằng LOX trong nhân tế bào có thể điều chỉnh sự biểu hiện collagen, tác động tới sự tổ chức của nhiễm sắc thể, và 83 ngăn chặn sự phát triển của cyclin D1 và E-cadherin. Các nghiên cứu cũng đề xuất rằng LOX có thể điều hoà mức độ biểu hiện gen thông qua tương tác của nó với histon H1 và H2 trong nhân [164]. Quan trọng là, LOX đã được báo cáo có vai trò khởi động chết tế bào theo chương trình. Một nghiên cứu đã phát hiện rằng LOX trong nhân tế bào có thể trực tiếp ức chế tốc độ phát triển của nhân tế bào, thể hiện LOX là chất ức chế tăng trưởng tế bào [165]. Thêm vào đó, sự tăng biểu hiện LOX do lentivirus được phát hiện đóng vai trò khởi động chết tế bào theo chương trình ở tế bào cơ trơn mạch máu người [166]. Tóm lại, những phát hiện này chỉ ra rằng sự tăng mức biểu hiện LOX bất thường có những tác động xấu tới sự sống còn của tế bào và khởi động chết tế bào theo chương trình. Bên cạnh tế bào nội mô mao mạch võng mạc, hiện nay chưa rõ mức độ biểu hiện của LOX có ảnh hưởng ở các loại tế bào võng mạc khác trong điều kiện đường huyết cao hay không. Tuy nhiên, LOX tìm thấy tăng đáng kể trên bề mặt tế bào biểu mô sắc tố võng mạc [18]. Một nghiên cứu khác cũng cho thấy LOX tăng biểu hiện ở mức mRNA trong các tế bào biểu mô sắc tố võng mạc nuôi cấy ở môi trường nồng độ glucose cao [167]. Các nghiên cứu sâu hơn cần được thực hiện để làm sáng tỏ ảnh hưởng của tăng biểu hiện LOX do nồng độ glucose cao hoặc đái tháo đường đến sự thay đổi của các loại tế bào võng mạc khác. Hiện nay có rất ít thông