Luận án Nghiên cứu thu nhận, biến tính Gelatin từ phế liệu thủy sản và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm - Châu Thành Hiền

Ngừ Đại Dương và da cá Tra sau khi sấy khô 3.1.7. Nghiên cứu chế độ bảo quản gelatin Mục đích của nghiên cứu nhằm theo dõi sự thay đổi tính chất cảm quan, độ ẩm và độ bền gel của gelatin theo thời gian bảo quản để chọn điều kiện bảo quản thích hợp. Trong nghiên cứu, chúng tôi chọn điều kiện như sau: - Bao bì: Chọn 2 loại là LDPE (low density polyethylene) và HDPE (high density polyethylene) với các đặc tính như sau: + LDPE: Chiều dày: 1.10-3mm; Khối lượng riêng: 0,910÷0,925 g/cm3; Tốc độ thấm hơi nước: 20 g/m2/24h. + HDPE: Chiều dày: 3.10-3mm; Khối lượng riêng: 0,941÷0,965 g/cm3; Tốc độ thấm hơi nước: 0,3 g/m2/24h. - Nhiệt độ bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ thường và trong phòng lạnh (22÷250C). Các mẫu nghiên cứu được ký hiệu như sau: LDPE-NT: Gelatin cá Ngừ ĐD bảo quản trong bao LDPE nhiệt độ thường; LDPE-NL: Gelatin cá Ngừ ĐD bảo quản trong bao HDPE phòng lạnh; HDPE-NT: Gelatin cá Ngừ ĐD bảo quản trong bao LDPE nhiệt độ thường; HDPENL: Gelatin cá Ngừ ĐD bảo quản trong bao LDPE phòng lạnh. LDPE-TT: Gelatin cá Tra bảo quản trong bao LDPE nhiệt độ thường; GNĐDT GTRAT 93 LDPE-TL: Gelatin cá Tra bảo quản trong bao HDPE phòng lạnh; HDPE-TT: Gelatin cá Tra bảo quản trong bao LDPE nhiệt độ thường; HDPE-TL: Gelatin cá Tra bảo quản trong bao LDPE phòng lạnh. Kết quả theo dõi sự thay đổi ẩm, độ bền gel và cảm quan theo thời gian bảo quản 120 ngày (4 tháng) được thể hiện cụ thể ở phụ lục 4.5. Kết quả nghiên cứu cho thấy: - Về cảm quan: Sau thời gian bảo quản 120 ngày, các mẫu gelatin được bảo quản trong ở nhiệt độ thường trong bao HDPE và ở phòng lạnh trong bao LDPE, HDPE đều cho hạt rời, màu trắng sáng tương tự như galetin ban đầu. Tuy nhiên, gelatin được bảo quản trong ở nhiệt độ thường trong bao LDPE sau 90 ngày đã có hiện tượng vón cục, màu hơi ngã vàng so với gelatin ban đầu. - Về độ ẩm: Theo thời gian bảo quản, độ ẩm của các mẫu gelatin đều có xu hướng tăng dần. Trong đó, các mẫu gelatin được bảo quản trong ở nhiệt độ thường trong bao HDPE và ở phòng lạnh trong bao LDPE, HDPE tăng chậm. Sau 120 ngày bảo quản độ ẩm của các mẫu đều nằm trong giới hạn cho phép theo QCVN 4- 21:2011/BYT (không quá 18%) và lần lượt đạt: + Gelatin cá Ngừ Đại Dương: HDPE-NT: 6,21%; LDPE-NL: 8,17%; HDPE- NL: 5,12%. + Gelatin cá Tra: HDPE-TT: 6,54%; LDPE-TL: 8,24%; HDPE-TL: 5,37%. Trong khi đó gelatin được bảo quản ở nhiệt độ thường trong bao LDPE trên cả 2 loại gelatin da cá Ngừ Đại Dương và cá Tra đều cho độ ẩm tăng nhanh và vượt giới hạn cho phép theo QCVN 4-21:2011/BYT sau 120 ngày và lần lượt đạt: 18,76% đối với mẫu LDPE-NT và 19,05% đối với mẫu LDP-TT. - Về độ bền gel: Tất cả các mẫu gelatin có độ bền gel thay đổi không đáng kể so với gelatin ban đầu trong tất cả các điều kiện bảo quản. Sau khi bảo quản 120 ngày độ bền gel của các mẫu gelatin đạt được như sau: + Gelatin cá Ngừ Đại Dương: HDPE-NT: 101,9 gam; HDPE-NL: 102,2 gam; LDPE-NT: 102,3 gam; LDPE-NL: 102,1 gam. + Gelatin cá Tra: HDPE-TT: 251,2 gam; HDPE-TL: 251,0 gam; LDPE-TT: 250,4 gam; LDPE-TL: 250,7 gam. Từ kết quả thu được như trên chúng tôi khuyến nghị điều kiện bảo quản 94 gelatin từ da cá như sau: + Ở nhiệt độ thường: Nên bảo quản gelatin bằng loại bao HDPE để đảm bảo chất lượng gelatin với thời gian hơn 120 ngày, không nên bảo quản gelatin bằng bao bì LDPE trong thời gian dài. + Ở nhiệt độ phòng lạnh: Có thể bảo quản gelatin bằng loại bao HDPE hoặc LDPE đều đảm bảo chất lượng với thời gian hơn 120 ngày. Kết luận 4 1/ Gelatin thu nhận từ da cá Tra có cấu trúc gel dày đặc hơn so với gelatin từ da cá Ngừ Đại Dương; khối lượng phân tử của các sợi polypeptide của gelatin từ da cá Tra chủ yếu nằm ở khoảng 55÷72kDa, trong khi từ da cá Ngừ Đại Dương chủ yếu nằm ở khoảng 43÷55kDa; 2/ Gelatin thu được từ da cá Ngừ Đại Dương và da cá Tra đều có các nhóm liên kết cơ bản đặc trưng của một gelatin từ da cá, với các peak tương ứng với các nhóm amide I, amide II, amide III, amide A và amide B trên phổ hồng ngoại; 3/ Gelatin thu được từ da cá Ngừ Đại Dương và da cá Tra đều có thành phần acid amin cơ bản đặc trưng cho gelatin từ da cá. Trong đó, hàm lượng các acid amin quan trọng quyết định đến các tính chất chức năng của gelatin như proline, hydroxyproline trong gelatin da cá Tra lớn hơn so với gelatin da cá Ngừ Đại Dương; 4/ Gelatin thu nhận từ da Ngừ Đại Dương và da cá Tra đều đạt chỉ tiêu chất lượng về vi sinh, kim loại nặng và một số chỉ khác về an toàn thực phẩm theo QCVN 4-21:2011/BYT; 5/ Gelatin thu nhận từ da cá Ngừ Đại Dương và da cá Tra có sự hỗ trợ của sóng siêu âm có khối lượng phân tử, thành phần acid amin, các nhóm liên kết cơ bản trong gelatin tương đương với gelatin thu nhận không có hỗ trợ của sóng siêu âm. Khác biệt duy nhất là cystein được phát hiện có mặt trong các mẫu gelatin có siêu âm hỗ trợ. 6/ Bảo quản gelatin da cá ở điều kiện nhiệt độ thường bằng bao HDPE và ở phòng lạnh bằng bao LDPE, HDPE trong thời gian 120 ngày đều cho tính chất cảm quan, độ ẩm đạt theo QCVN 4-21:2011/BYT và độ bền gel thay đổi không đáng kể. 95 3.1.8. Đề xuất quy trình thu nhận gelatin từ da cá quy mô phòng thí nghiệm 3.1.8.1. Quy trình chung Hình 3.16. Quy trình thu nhận gelatin từ da cá 3.1.8.2. Thuyết minh quy trình a. Nguyên liệu da cá Nguyên liệu da cá gồm: da cá Tra và da cá Ngừ Đại Dương sau khi thu mua từ nhà máy chế biến thủy sản, được rửa qua dung dịch chlorine 50 ppm. Sau đó loại bỏ phần vảy, thịt,... còn dính trên da và cắt nhỏ với kích thước 2 x 3cm. Tiếp theo da cá được cấp đông ở -30÷(-200C) hoặc sấy ở 450C đến độ ẩm 10÷12%. Da cá lạnh đông Da cá Rửa lần 1 (qua dd Chlorine 50ppm) Sơ chế, cắt nhỏ Lạnh đông -30÷(-200C ) Rửa lần 2 Xử lý da cá Rửa lần 3 Rã đông Bã 1 Cô đặc chân không Trích ly Lọc lần 1 Làm sạch Lọc lần 2 Than hoạt tính Bã 2 Sấy Gelatin thành phẩm Sấy ở 450C Da cá khô 96 b. Xử lý da cá Tùy theo loại da cá mà trước khi ngâm da cá trong huyền phù vôi hoặc acid acetic da cá được xử lý khác nhau: Da lạnh đông được rã đông bằng không khí tự nhiên trong 6 giờ, sau đó được rửa lại nhiều lần bằng nước sạch; Da cá khô được ngâm trong nước sạch với tỷ lệ da/nước = 1/5 (w/v) trong 12 giờ để da cá hồi nguyên. Sau đó da được xử lý ngâm trong huyền phù vôi (có hoặc không có hỗ trợ siêu âm) hoặc được xử lý kết hợp ngâm lần lượt trong vôi và acid như sau: * Không có siêu âm hỗ trợ: + Da cá Tra: ngâm có khấy đảo trong huyền phù vôi với hàm lượng vôi 20 g/l, thời gian 5 ngày; + Da cá Ngừ Đại Dương: ngâm có khuấy đảo trong huyền phù vôi với hàm lượng vôi 20 g/l, thời gian 1,5 ngày sau đó rửa sạch đưa về pH trung tính và ngâm trong dung dịch acid acetic 7,5 mM trong 2 giờ. * Có hỗ trợ siêu âm: + Da cá Tra: siêu âm trong trong huyền phù vôi có khuấy đảo với hàm lượng vôi 20 g/l; thời gian 90 phút; biên độ 90%; chu kỳ đóng ngắt 0,9 giây; + Da cá Ngừ Đại Dương: siêu âm trong trong huyền phù vôi có khuấy đảo với hàm lượng: 20 g/l; thời gian 90 phút; biên độ 80%; chu kỳ đóng ngắt 0,8 giây. c. Rửa Loại bỏ hết các tạp chất được khuếch tán ra từ da như sắc tố da, mỡ và các thành phần phi collagen khác. Đồng thời đưa pH của da cá về giá trị trung tính trước khi trích ly. Quá trình rửa da cá được thực hiện nhiều lần dưới vòi nước sạch chảy liên tục cho đến khi đạt pH trung tính. d. Trích ly Gelatin được trích ly ở điều kiện như sau: - Da cá Tra: tỷ lệ dung môi/ da cá = 5/1 (v/w), ở 600C, trong 8 giờ; - Da cá Ngừ Đại Dương: tỷ lệ dung môi/ da cá = 5/1 (v/w), ở 550C, trong 7 giờ. e. Lọc lần 1 Loại phần bã còn lại và một số tạp chất có trong dịch trích ly để thu dịch gelatin dạng lỏng. 97 f. Làm sạch Loại các sắc tố gây màu và các hợp chất sinh ra mùi của gelatin bằng THT. Dịch chiết gelatin được điều chỉnh về nồng độ 6,70Bx ở 450C trước khi khử màu, khử mùi. Điều kiện làm sạch dịch gelatin như sau (dùng THT hạt mịn): - Gelatin từ da cá Tra: Tỷ lệ THT 1,5% (w/v), thời gian 45 phút, ở 450C; - Gelatin từ da cá Ngừ Đại Dương: Tỷ lệ THT 2% (w/v), thời gian 75 phút, ở 450C. Sau khi làm sạch dịch gelatin được lọc trong bằng máy lọc hút chân không. g. Cô đặc chân không Nâng cao nồng độ chất khô dịch gelatin giúp cho quá trình sấy được dễ dàng. Dịch gelatin được cô đặc ở áp suất 72 mPa, nhiệt độ 400C, thời gian 45 phút/ mẻ. Dịch sau khi cô đặc đạt nồng độ chất khô 10÷150Bx. h. Sấy Làm giảm lượng nước để tạo sản phẩm gelatin khô dạng bột. Quá trình sấy phun được tiến hành trên máy sấy hiệu BUCHI Mini Spray Dryer B-290. Sau khi sấy sản phẩm gelatin thu được dạng bột với độ ẩm 4÷5%. Gelatin thành phẩm được đóng gói bằng bao HDPE và bảo quản ở nhiệt độ thường. 3.2. Nghiên cứu biến tính gelatin từ da cá Ngừ Đại Dương Kết quả từ các phần trước cho thấy da cá Ngừ Đại Dương cho hiệu suất thu hồi gelatin cao, tuy nhiên độ Bloom của sản phẩm lại thấp (102,8 gam), làm hạn chế khả năng ứng dụng. Do đó, gelatin từ loại da cá này được chọn làm đối tượng để nghiên cứu biến tính nhằm nâng cao giá trị sử dụng cho sản phẩm. 3.2.1. Biến tính bằng enzyme transglutaminase, acid caffeic và acid tannic Hiệu quả của quá trình biến tính gelatin để tạo liên kết ngang giữa các phân tử gelatin bởi enzyme transglutaminase (TGase), acid caffeic (AC), acid tannic (AT) phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng là nhiệt độ phản ứng, nồng độ gelatin, nồng độ enzyme, nồng độ acid [22][29]. Gelatin được biến tính theo quy trình ở mục 2.3.2.4. 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến sự biến tính của gelatin Hiệu quả biến tính gelatin được đánh giá thông qua sự thay đổi về độ bền gel, mức độ tăng độ nhớt của dịch gelatin sau phản ứng. 98 Kết quả xác định độ bền gel và mức độ tăng độ nhớt theo thời gian biến tính ở các mức nhiệt độ khác nhau được trình bày chi tiết ở phụ lục 4.3. Kết quả này cho thấy: ở tất cả các mức nhiệt độ, cả độ nhớt và độ bền gel đều tăng dần theo thời gian phản ứng đến giá trị cực đại, sau đó chúng có xu hướng ổn định hoặc giảm theo thời gian. Độ bền gel và độ nhớt cùng đạt giá trị cực đại tại cùng thời điểm. Thời gian để chúng đạt giá trị cực đại khi sử dụng enzyme transglutaminase, acid caffeic và acid tannic lần lượt là 80 phút, 90 phút và 60 phút. Các giá trị cực đại của độ bền gel và mức độ tăng độ nhớt này được thể hiện trên Hình 3.17. Hình 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến sự thay đổi độ nhớt và độ bền gel gelatin Từ Hình 3.17 có thể thấy, cả 3 tác nhân: transglutaminase, acid caffeic và acid tannic đều cho độ nhớt và độ bền gel cực đại tại 400C. Trong đó, mức độ tăng độ nhớt và độ bền gel biến tính bằng transglutaminase lần lượt là 81,3% và 238,7 g; bằng acid caffeic là 42,1% và 154,6 g; acid tannic là 26% và 123,8 g. Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Shantha Lakshmi và cs. [68], Nor Fazliyana Mohtar và cs. [79], Julia Calvarro và cs. [36] trong các nghiên cứu biến tính gelatin từ da cá bằng transglutaminase, acid caffeic, khi tất cả đều kết luận nhiệt độ tối ưu ở phạm vi 40÷450C. Trong nghiên cứu tiếp theo, điều kiện biến tính được chọn là: nhiệt độ 400C, thời gian biến tính bằng transglutaminase 80 phút, acid caffeic 90 phút và acid tannic 60 phút. 3.2.1.2. Ảnh hưởng của hàm lượng transglutaminase, acid caffeic và acid tannic đến độ nhớt và độ bền gel gelatin 99 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng transglutaminase, acid caffeic và acid tannic đến độ nhớt và độ bền gel gelatin được thể hiện ở Hình 3.18. Khi thay đổi hàm lượng tác nhân biến tính, cả độ nhớt và độ bền gel gelatin thay đổi rõ rệt và theo chiều hướng tăng đến giá trị cực đại, sau đó lại giảm. Khả năng làm tăng độ nhớt và độ bền gel của các tác nhân có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: transglutaminase>acid caffeic> acid tannic. Các giá trị cực đại về độ nhớt và độ bền gel của gelatin biến tính bằng: - Transglutaminase là 186,8 cP và 248,3 g với hàm lượng enzyme 25 mg/g. - Acid caffeic là 165,7 cP và 160,2 g với hàm lượng acid 15 mg/g. - Acid tannic là 80,2 cP và 130,3 với hàm lượng acid 25 mg/g. Sự thay đổi độ nhớt và độ bền gel như trên có thể được giải thích như sau: Transglutaminase với khả năng xúc tác hình thành liên kết giữa glutamine và lysine của các chuỗi protein [85] đã làm cho mạch polypeptid trở nên dài và cồng kềnh hơn, dẫn đến độ nhớt và độ bền gel của gelatin cao hơn. Tuy nhiên nếu lượng enzyme quá nhiều có thể hình thành nên các liên kết cộng hóa trị nội phân tử, cản trở sự kết hợp liên phân tử giữa các chuỗi polypeptide, làm hạn chế sự hình thành Hình 3.18. Ảnh hưởng hàm lượng transglutaminase, acid caffeic, acid tannic đến độ nhớt và độ bền gel gelatin TGase AT AC 100 liên kết ngang nên độ nhớt và độ bền gel không tăng hoặc tăng không đáng kể [36]. Kết quả trên cũng phù hợp với kết quả của Jongjareonrak Akkasit và cs. [55] khi dùng transglutaminase biến tính gelatin từ da cá Hồng mắt to, độ bền gel tăng từ 105 gam lên 150 gam và từ da cá Hồng nâu sọc tăng từ 218 g lên 270 g. Trong trường hợp acid caffeic và acid tannic, với bản chất là polyphenol chúng đã được oxy hóa thành quinone trong quá trình sục khí, sau đó phản ứng với các gốc lysine của gelatin để tạo thành các liên kết ngang đồng hoá trị quinonimine, làm cho khối lượng phân tử gelatin trở nên lớn hơn, dẫn đến độ nhớt và độ bền gel của gelatin cao hơn. Tuy nhiên, khi hàm lượng acid caffeic và acid tannic quá cao, các hợp chất phenolic hình thành lớp phủ trên bền mặt protein, dẫn đến kết tủa protein, ngăn cản sự hình thành các liên kết ngang [34][86]. Từ kết quả trên chúng tôi chọn hàm lượng transglutaminase 25 mg/g; acid caffeic 15 mg/g; acid tannic 25 mg/g làm cơ sở cho nghiên cứu tiếp theo. 3.2.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến sự biến tính gelatin Kết quả sự thay đổi độ nhớt, độ bền gel khi thay đổi nồng độ gelatin được thể hiện trên Hình 3.19. AC TGase AT Hình 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến mức độ tăng độ nhớt và độ bền gel gelatin . 101 Đồ thị Hình 3.19 cho thấy: khi tăng nồng độ gelatin độ nhớt và độ bền gel gelatin đều thay đổi theo hướng tăng đến giá trị cực đại sau đó giảm dần. Mức độ làm tăng độ nhớt và độ bền gel của gelatin sau khi biến tính bởi các tác nhân có thể sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: transglutaminase>acid caffeic>acid tannic. Bảng 3.14. Nồng độ gelatin thích hợp để biến tính Bảng 3.14 thể hiện nồng độ của các tác nhân để gelatin biến tích có độ bền gel và mức độ tăng độ nhớt cao nhất. Khi nồng độ gelatin tăng không quá cao, khả năng tiếp xúc giữa gelatin và tác nhân biến tính tốt hơn, tạo điều kiện cho quá trình hình thành liên kết ngang giữa các mạch polypeptide được dễ dàng [21]. Tuy nhiên, khi nồng độ gelatin quá lớn, độ nhớt của dung dịch gelatin tăng cao, có thể đã cản trở sự tương tác giữa các chất, làm giảm hiệu quả của quá trình tạo liên kết ngang của gelatin. Từ kết quả thu được từ mục 3.2.1.2 và 3.2.1.3, các thông số thích hợp nhất cho quá trình biến tính bằng transglutaminase, acid caffeic và acid tannic được xác định như ở Bảng 3.15. Bảng 3.15. Điều kiện thích hợp nhất để biến tính gelatin bằng transglutaminase, acid caffeic, acid tannic TT Loại tác nhân biến tính Hàm lượng tác nhân biến tính, mg/g Thời gian biến tính, phút Nồng độ gelatin, % Nhiệt độ, 0C 1 Transglutaminase 25 80 18 40 2 Acid caffeic 15 90 15 40 3 Acid tannic 25 60 20 40 3.2.1.4. Nghiên cứu sự thay đổi khối lượng phân tử của gelatin Sự thay đổi khá rõ về độ nhớt, độ bền gel của gelatin được biến tính bằng enzyme transglutaminase, acid caffeic và acid tannic là cơ sở để suy luận về khả TT Tác nhân biến tính Nồng độ gelatin, % Độ bền gel, gam Mức độ tăng độ nhớt, % 1 Transglutaminase 18 249,5 205,5 2 Acid caffeic 15 165,3 182,4 3 Acid tannic 20 130,2 28,6 102 năng thay đổi cấu trúc phân tử của gelatin sau biến tính. Để khẳng định được sự biến đổi này, kỹ thuật điện di SDS-PAGE đã được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của 4 mẫu gelatin với các ký hiệu như sau: - GNĐDT: Gelatin thu nhận từ da cá Ngừ Đại Dương; - GBE: Gelatin biến tính bằng enzyme transglutaminase; - GBC: Gelatin biến tính bằng acid caffeic; - GBT: Gelatin biến tính bằng acid tannic; - MK: Mẫu chuẩn marker đã biết trước khối lượng phân tử. Kết quả điện di được trình bày ở Hình 3.20. Hình 3.20. Ảnh điện di các mẫu gelatin biến tính và mẫu chuẩn marker Từ ảnh điện di ở Hình 3.20 có thể thấy, khác với mẫu gelatin tự nhiên GNĐDT, ở các mẫu gelatin biến tính GBC, GBT và GBE đều xuất hiện thêm các vệt protein nằm ở khoảng 55÷95 kDa, ngoài ra ở mẫu GBE còn xuất hiện thêm vệt protein nằm khoảng 95÷130 kDa. Trong khi đó, các vệt protein với khối lượng phân tử thấp trong khoảng 26÷43 kDa ở mẫu GNĐDT không còn xuất hiện sau khi biến tính. Điều này chứng tỏ sau khi biến tính đã có sự kết nối các mạch polypeptide của gelatin, nhất là những mạch có phân tử nhỏ, tạo nên những phức có khối lượng phân tử lớn hơn, trong đó hiệu quả kết nối của transglutaminase là tốt nhất, với việc tạo ra các phức có khối lượng phân tử lớn nhất. Kết quả thu được như trên khá phù hợp GNĐDT GBC GBT GBE MK 72 kDa 55 kDa 43 kDa 34 kDa 26 kDa 95 kDa 130 kDa 103 với kết quả của Jongjareonrak Akkasit và cs. [55] khi biến tính gelatin da cá Chỉ vàng bằng transglutaminase, khối lượng phân tử gelatin đạt 97÷116 kDa, Thanasak Sae-leaw [100] và cs. khi biến tính gelatin từ da cá Chẽm bằng acid tannic, khối lượng phân tử gelatin trong khoảng 76÷106 kDa. 3.2.1.5. Xác định cấu trúc của gelatin bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) Để thấy rõ tác động của quá trình biến tính đến cấu trúc 3 chiều của gel gelatin, chúng tôi xác định cấu trúc của gelatin trước và sau khi biến tính bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 50.000 lần. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.21. Hình 3.21. Vi ảnh cấu trúc của gelatin trước và sau khi biến tính Kết quả Hình 3.21 cho thấy cấu trúc mạng lưới sợi của gelatin sau khi được biến tính bằng tác nhân enzyme transglutaminase (GBE), acid caffeic (GBC) và acid tannic (GBT) dày đặc hơn, kích thước các sợi protein thô hơn so với mẫu gelatin chưa biến tính (GNĐDT). Điều đó chứng tỏ sau khi biến tính, gelatin có cấu trúc rắn chắc hơn. Trong đó, gelatin biến tính bằng transglutaminase (GBE) và acid GBT GBC GNĐDT GBE 104 caffeic (GBC) cho cấu trúc mạng gel dày đặc hơn, các lỗ hổng trong không gian gel ít hơn so với gelatin biến tính bằng acid tannic (GBT). Nguyên nhân có thể do sự hình thành các liên kết ngang giữa các phân tử protein thông qua các liên kết cộng hóa trị xảy ra khi biến tính bằng enzyme transglutaminase và acid caffeic ở mức độ cao hơn so với acid tannic, do đó hình thành nên phân tử protein có kích thước lớn hơn. Điều này đã được thể hiện thông qua độ nhớt, độ bền gel, khối lượng phân tử gelatin. Tương như như kết quả trên, Jongjareonrak Akkasit và cs. [55], khi biến tính gelatin cá Chỉ vàng mắt to, cá Chỉ vàng sọc bằng transglutaminase, Balange Amjad và cs. [30] biến tính gelatin bằng acid tannic cũng đã nhận thấy cấu trúc gel dày đặc hơn, độ bền gel, khối lượng phân tử cao hơn so với gelatin chưa biến tính. 3.2.1.6. Xác định mức độ liên kết ngang của gelatin Để khẳng định cơ chế của quá trình biến tính là do sự hình thành các liên kết ngang, chúng tôi khảo sát mức độ tạo liên kết ngang của gelatin thông qua việc định lượng số nhóm amin tự do có ở mạch bên của gelatin [71]. Kết quả phân tích mức độ tạo liên kết ngang của các mẫu GNĐDT, GBE, GBC và GBT được thể hiện ở Hình 3.22. Hình 3.22. Mức độ liên kết ngang của gelatin Kết quả từ đồ thị Hình 3.22 cho thấy: gelatin được biến tính bằng transglutaminase, acid caffeic và acid tannic đều tạo ra liên kết ngang trong gelatin. Trong đó, gelatin biến tính bằng transglutaminase cho mức độ liên kết ngang cao 0 5 10 15 20 25 30 GBE GBC GBT M ức đ ộ liê n kế t n ag ng , % Loại gelatin 105 nhất với 22,5% các nhóm amin tự do có thể đã tham gia tạo liên kết ngang, trong khi biến tính bằng acid tannic cho mức độ liên kết ngang thấp nhất với chỉ 16,4% số nhóm amin có khả năng đã tạo liên kết ngang. Nguyên nhân của sự hình thành các liên kết ngang nhờ tác dụng của transglutaminase, acid caffeic và acid tannic có thể được giải thích theo các cơ chế đã được trình bày ở mục 1.2.2. Trong các nghiên cứu biến tính gelatin từ da cá Jun-Hyun Oh và cs. [89], Kosaraju Lakshmi Shantha và cs. [68] cũng khẳng định cơ chế biến tính của acid caffeic là tạo các liên kết ngang của gelatin, làm tăng dẫn đến độ nhớt, độ bền gel và khối lượng phân tử của gelatin. 3.2.1.7. Phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) của gelatin biến tính Để xác định sự thay đổi các liên kết trong phân tử gelatin trước và sau khi biến tính, chúng tôi đo phổ hồng ngoại của các mẫu gelatin gồm: GNĐDT, GBE, GBC và GBT. Dựa vào sự thay đổi các peak xuất hiện trên phổ có thể suy ra sự thay đổi các liên kết cũng như cấu trúc của gelatin [21][109]. Kết quả như Hình 3.23. Hình 3.23. Phổ hồng ngoại (FTIR) của gelatin trước và sau khi biến tính Các peak ở số sóng 2853,4 cm-1 (GBE); 2853,1 cm-1 (GBC); 2854,4cm-1 (GBT) GNĐDT GBE GBT Các peak ở số sóng 1742,67 cm-1 (GBC), 1742,91 cm-1 (GBT), 1740,86 cm-1 (GBE) GBC 106 Nhìn chung, các phổ trên Hình 3.23 cho thấy, các mẫu gelatin trước và sau khi biến tính đều có các peak ở số sóng hầu như giống nhau. Tất cả đều có các peak xuất hiện ở số sóng 1600÷1750 cm-1 (amide I); 1540÷1545 cm-1 (amide II); 1229÷1243 cm-1 (amide III); 3207÷3496 cm-1 (amide A) và 2823÷2943 cm-1 (amide B) (như phân tích ở mục 3.1.2.5). Tuy nhiên, ở các phổ của GBC, GBT và GBE lần lượt xuất hiện thêm peak ở số sóng lần lượt là 1742,67 cm-1,1742,91 cm-1 và 1740,86 cm-1 ở vùng amide I và peak ở số sóng 2853,4 cm-1 (GBE); 2853,1 cm-1 (GBC); 2854,4 cm-1 (GBT) ở vùng amide B. Theo Mourad Jridi và cs. [57] cũng như Benjakul Soottawat và cs [32], peak ở số sóng 1742,67 cm-1, 1742,91 cm-1 và 1740,86 cm-1 là do dao động C=O kết hợp với liên kết CN xuất hiện. Trong khi đó, peak ở số sóng lần lượt 2853,4 cm-1 (GBE); 2853,1 cm-1 (GBC); 2854,4 cm-1 do dao động không đối xứng của liên kết C-H cũng như nhóm NH+3. 3.2.1.8. Đánh giá cảm quan gelatin trước và sau khi biến tính Kết quả đánh giá cảm quan gelatin sau khi được biến tính được thể hiện ở Bảng 3.16. Hình ảnh các mẫu sản phẩm gelatin biến tính được trình bày ở Hình 3.24 Bảng 3.16. Kết quả đánh giá cảm quan gelatin sau khi biến tính Loại gelatin Chỉ tiêu Nguyên liệu (GNĐDT) Transglutaminase (GBE) Acid caffeic (GBC) Acid tannic (GBT) Trạng thái Hạt mịn Hạt mịn Hạt mịn Hạt mịn Màu Trắng sáng Trắng sáng Vàng nhạt Vàng nhạt Mùi Không mùi Không mùi Không mùi Không mùi Khi hòa vào nước ở 600C Hút nước và tan nhanh, trương nở, độ dai kém Hút nước và tan chậm, trương nở, rất dai và dẻo Hút nước và tan chậm, trương nở, dai và dẻo Hút nước và tan chậm, trương nở, dai và dẻo 107 Hình 3.24. Gelatin trước và sau khi biến tính bằng transglutaminase, acid caffeic, acid tannic đã sấy khô Kết luận 5 1/ Độ nhớt, độ bền gel của gelatin cá Ngừ Đại Dương được biến tính bằng transglutaminase, acid caffeic, acid tannic đã được cải thiện rõ rệt. Trong đó, enzyme transglutaminase có tác dụng làm cho độ nhớt, độ bền gel, mức độ liên kết ngang tăng cao nhất, trong khi acid tannic có tác dụng kém nhất. Độ bền gel của gelatin được biến tính bởi transglutaminase, acid caffeic, acid tannic đã lần lượt tăng đến 249,5 g; 165,3 g và 130,2 g so với giá trị 102,8 g của gelatin chưa biến tính; 2/ Hiệu quả của các quá trình biến tính có thể được khẳng định qua: - Sự thay đổi khối lượng phân tử gelatin theo hướng hình thành các phức có khối lượng phân tử lớn và mất đi của các polypeptide có khối lượng phân tử nhỏ; - Ảnh vi cấu trúc của gel gelatin cho thấy cấu trúc sợi của gelatin biến tính dày hơn, thô hơn, ít lỗ hổng hơn trong cấu trúc gel; - Phổ hồng ngoại cho thấy xuất hiện dao động C=O kết hợp với liên kết CN khi gelatin biến tính bằng transglutaminase, acid caffeic, acid tannic; - Sự gia tăng của mức độ tạo liên kết ngang được xác định bằng phương pháp phổ UV-VIS; 3/ Gelatin sau khi biến tính đã có những tính chất cảm quan thay đổi như: - Hút nước và tan chậm hơn, khi trương nở tạo độ dẻo dai lớn hơn; - Màu sắc: chuyển sang màu vàng nhạt khi biến tính bằng acid caffeic, acid tannic và không thay đổi màu khi biến tính bằng transglutaminase. GBE GBT GBC GNĐD 108 3.2.2. Biến tính bằng polyphenol từ lá chè xanh 3.2.2.1. Thu nhận polyphenol từ lá chè xanh Polyphenol được thu nhận từ lá chè xanh theo quy trình ở phụ lục 2.1. Chế phẩm polyphenol thu được