Luận án Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus Fermentum - Trần Thị Ái Luyến

các nguồn dinh dưỡng vào môi trường chứa 10% sữa tách béo gồm 2% suc, 0,5% dịch whey protein thì lượng EPS tạo thành tăng mạnh, đạt 135,80 mg/l [140]. Với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3, ở nhiệt độ 40oC lượng EPS tạo thành đã giảm nhiều so với mức nhiệt cực đại (35oC), sau đó tiếp tục giảm khi tăng nhiệt độ lên 45oC. Lượng EPS chỉ còn lại tương ứng đối với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21 và MC3 là 90,19%, 78,22% và 71,45% so với giá trị cực đại. Sự sai khác về lượng EPS thu được phần lớn đã không xảy ra ở hai mức nhiệt 30 và 45oC khi phân tích phương sai (p < 0,05) (Phụ lục 4.5). Đối với chủng MC3, tại mức nhiệt 30oC, lượng EPS đạt được là thấp nhất, giảm trên 50% so với mức nhiệt cực đại (khoảng 236,134 µg/ml). Đối với chủng TC13, lượng EPS tạo thành tăng dần khi nhiệt độ tăng sau đó giảm mạnh ở mức nhiệt 45oC. Hàm lượng EPS tại mức nhiệt độ 74 này chỉ đạt 360,362 µg/ml (đã giảm 14,03% so với mức cao nhất ở 40 OC). Từ kết quả phân tích thống kê cho thấy, giá trị EPS thu được ở hai mức nhiệt độ 30 và 45 oC đối với chủng này là không có sự sai khác (p < 0,05) (Phụ lục 4.5). Ở các mức nhiệt độ thấp (30oC) và nhiệt độ cao 45oC, khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng đều ở mức thấp. Điều đó cho thấy rằng, các chủng vi khuẩn này là những chủng vi khuẩn ưa ấm; do đó, với khoảng nhiệt độ trung bình sẽ kích thích cho quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp như EPS tốt hơn. Quá trình sinh tổng hợp HoPS và HePS đều có liên quan đến các enzyme đặc hiệu có ở bên trong hoặc ngoài tế bào vi khuẩn. Vi sinh vật thường rất mẫn cảm với sự thay đổi của nhiệt độ. Tính mẫn cảm này được thể hiện qua sự tác động lên các phản ứng xúc tác của enzyme. Khi các cơ chất được vận chuyển vào tế bào, dưới tác dụng của các enzyme đặc hiệu, các sản phẩm lần lượt của quá trình xúc tác này được tạo thành – đây cũng chính là tiền thân của các đơn vị lặp lại trong phân tử EPS. Chính vì thế, lí do liên quan đến lượng sản phẩm tạo thành thấp trong các điều kiện này có lẽ liên quan đến tác động của nhiệt độ lên các phản ứng do enzyme xúc tác. Với phản ứng có sự xúc tác của enzyme, khi nhiệt độ tăng sẽ làm tăng tốc độ phát triển của vi sinh vật do đó hoạt động trao đổi chất của chúng cũng tăng lên. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lại có xu hướng ngược lại với sự tăng nhiệt độ và khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết. Nhiệt độ tăng quá cao có thể gây ra sự biến tính của enzyme và các protein khác trong môi trường do đó làm giảm khả năng xúc tác sự chuyển hóa các chất dinh dưỡng hoặc các hệ enzyme tham gia tổng hợp PS có thể không hoạt động được. Ngoài ra, nhiệt độ tăng cao có thể làm tổn thương màng tế bào vi sinh vật đến mức khó phục hồi và dẫn đến ức chế sự sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn [6]. Khả năng tạo thành EPS thấp hơn ở mức nhiệt thấp có thể giải thích rằng, ở mức nhiệt này, vi khuẩn vẫn tồn tại và phát triển. Tuy nhiên, khả năng phát triển thường rất yếu do đó khả năng chuyển hóa các chất dinh dưỡng trong quá trình trao đổi chất cũng chậm lại. Kết quả của quá trình này là gây nên sự ức chế hoạt động của các hệ enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng dần dần khiến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn mất dần. 75 Như vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của cùng một loài vi sinh vật không phải là cố định mà có thể phụ thuộc vào pH, nguồn dinh dưỡng và các nhân tố khác. 3.1.3.4. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian lên men lên khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính của vi sinh vật sống. Quá trình sinh trưởng và phát triển này thường xảy ra qua bốn giai đoạn khác nhau. Giai đoạn đầu tiên là giai đoạn vi sinh vật chưa sinh sản mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi với môi trường mới (pha lag – pha tiền phát); giai đoạn thứ hai (pha log), giai đoạn này tế bào bắt đầu phát triển mạnh, chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của vi sinh vật để tạo thành các sản phẩm thứ cấp. Vì thế, để tận thu được tốt lượng sản phẩm tạo thành từ quá trình trao đổi chất của chúng thì việc kết thúc quá trình nuôi cấy ở cuối giai đoạn này là phù hợp nhất. Giai đoạn thứ ba (pha ổn định) là giai đoạn mà quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động. Tổng số tế bào mới sinh ra bao giờ cũng gần bằng tổng số tế bào chết đi. Và giai đoạn cuối cùng được coi là giai đoạn suy vong, số lượng tế bào chết sẽ tăng lên. Chính vì vậy, trong quá trình nuôi cấy thu các sản phẩm thứ cấp, chúng ta cần xác định thời gian tương ứng với các pha sinh trưởng của vi khuẩn để thu được lượng sản phẩm một cách tối đa. Quá trình phát triển và sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có thể xảy ra sớm hoặc muộn hơn tùy loại vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy của chúng (như thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, pH, ). Chính vì thế, để khảo sát quá trình thu nhận EPS hiệu quả từ các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3, bốn chủng này được nuôi cấy ở các khoảng thời gian khác nhau trong môi trường đã được xác định về nguồn C, N, mật độ tế bào, pH và nhiệt độ thích hợp đối với mỗi chủng để xác định ảnh hưởng của yếu tố thời gian lên quá trình sinh tổng hợp EPS của chúng. Thực hiện lấy mẫu tại các thời điểm 0, 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ để xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men nhằm tận thu lượng sản phẩm cao nhất trong môi trường. Kết quả Hình 3.7a, Hình 3.7b, Hình 3.7d cho thấy rằng, sau 48 giờ lên men, quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16 và MC3 đều đạt 76 được là cao nhất với hàm lượng thu được lần lượt là 421,378 µg/ml; 406,703 µg/ml; 422,638 µg/ml. Lượng EPS thu được cực đại sau 48 giờ lên men các chủng Lb. fermentum TC13, TC16 và MC3 cũng là điều kiện mà rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng như một điều kiện tối ưu để nghiên cứu các khía cạnh liên quan đến EPS tiết ra từ các chủng thuộc LAB [52], [54], [118]. Từ 12 đến 36 giờ lên men, lượng EPS tạo ra có tăng nhưng tăng chậm. Sau khi đạt cực đại tại 48 giờ, lượng EPS đo được trong các môi trường giảm mạnh ở 60 và 72 giờ. Lượng EPS của cả ba chủng tại thời điểm 60 giờ nuôi cấy chỉ còn khoảng 85 – 88% và tại 72 giờ khoảng 64 – 88% so với thời điểm cực đại. Kết quả phân tích thống kê cho thấy lượng EPS thu được từ quá trình sinh tổng hợp bởi chủng TC13 không có sự sai khác ở thời điểm 12 và 24 giờ; giữa 36 và 60 giờ (p<0,05) (Phụ lục 4.6). Trong khi sự sai khác lại không xảy ra với lượng EPS tạo thành bởi chủng TC16 giữa các thời điểm 12, 24, 36 giờ và giữa 60 và 72 giờ. a) pH 0 12 24 36 48 60 72 Thời gian (giờ) pH b) 0 12 24 36 48 60 72 Thời gian (giờ) 77 So với các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, MC3, quá trình tổng hợp của Lb. fermentum TC21 xảy ra sớm hơn. Lượng EPS đạt cực đại chỉ sau 36 giờ lên men (405,728 µg/ml), sau đó giảm dần theo thời gian với các giá trị lần lượt là 382,395 µg/ml ở 48 giờ, 382,760 µg/ml ở 60 giờ và 341,175 µg/ml ở 72 giờ (Hình 3.7c). Nguyên nhân của sự tăng giảm trong quá trình lên men các chủng vi khuẩn này có lẽ liên quan đến các giai đoạn trong quy luật phát triển của các vi sinh vật. Sau khi được nuôi cấy vào môi trường, các chủng vi khuẩn thích nghi dần và bắt đầu phát triển (từ 12 giờ đến 36 giờ). Tốc độ sinh sản của vi sinh vật được tăng lên cực đại, chỉ số OD trong các môi trường tương ứng tăng mạnh cùng với lượng chất dinh dưỡng giảm (từ 36 giờ đến 48 giờ). Từ sau 48 giờ, lượng sản phẩm tạo thành sẽ không tăng pH d) 0 12 24 36 48 60 72 Thời gian (giờ) c) pH 0 12 24 36 48 60 72 Thời gian (giờ) Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb. fermentum Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.6 78 nữa mà bắt đầu có xu hướng giảm. Sự giảm sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật trong môi trường có thể là do lượng chất dinh dưỡng trong môi trường giảm, một số enzyme có thể phân giải chính sản phẩm tạo thành của chúng để làm nguồn thức ăn. Mặt khác, trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, bên cạnh việc sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường thì đồng thời chúng cũng thải ra một số chất gây ức chế quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng của chính bản thân nó, hoặc có thể ức chế hoạt động của enzyme tổng hợp do đó vi sinh vật phát triển chậm lại và sẽ chuyển sang trạng thái cân bằng và dần dần sẽ suy vong. Những nguyên nhân này sẽ làm cho lượng EPS thu được cũng giảm xuống khi thời gian nuôi cấy kéo dài. Bên cạnh đó, quá trình sử dụng các hợp chất thuộc nhóm carbohydrate của vi khuẩn sẽ tạo thành các sản phẩm khác nhau trong đó có các acid hữu cơ. Theo thời gian nuôi cấy, lượng acid tạo thành càng nhiều do đó giá trị pH có xu hướng giảm dần. Sự biến đổi của pH môi trường có thể đã làm thay đổi trạng thái điện li của các chất dinh dưỡng chính vì thế làm giảm khả năng sử dụng của chúng. Đây cũng có thể là nguyên nhân làm giảm quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng LAB. Một lý do nữa khiến lượng EPS tổng hợp được bị giảm khi kéo dài quá trình nuôi cấy có thể do enzyme glycohydrolase có sẵn trong môi trường xúc tác quá trình phân hủy các PS vừa tạo thành [126], [139]. Từ những kết quả thể hiện trên các Hình 3.7 (a, b, c, d) cũng cho thấy có những mối liên quan nhất định giữa lượng EPS tạo thành với giá trị OD và sự thay đổi của pH trong suốt thời gian nuôi cấy. Cụ thể chúng tôi nhận thấy rằng, lượng EPS tạo thành của cả bốn chủng này đều có xu hướng tăng nhanh ở các thời điểm có giá trị pH môi trường nằm trong khoảng 4,2-4,7. Đây có lẽ cũng là khoảng pH thích hợp cho các vi khuẩn lactic hoạt động. Ở các giá trị pH khác tương ứng với các thời gian nuôi cấy khác nhau, lượng EPS tạo thành không cao. Như vậy, sự thay đổi giá trị pH trong môi trường theo thời gian có thể là yếu tố ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Và ở các giá trị pH môi trường thấp hoặc cao có thể là nguyên nhân gây nên sự tổn thương đến tế bào của vi khuẩn; do đó, quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của nó bị giảm. 79 Đối với giá trị OD, nó có sự liên quan tương đối cao đối với sự sinh tổng hợp EPS. Đa số các kết quả nghiên cứu đều thể hiện rằng, thời điểm mà EPS tổng hợp được đạt cực đại cũng chính là thời điểm mà giá trị OD đo được từ môi trường cao nhất. Cụ thể, đối với chủng Lb. fermentum MC3, lượng EPS đạt được cao nhất vào thời điểm 48 giờ, đây cũng chính là thời điểm mà OD thu được đạt cao nhất (1,193). Tương tự, quá trình sinh tổng hợp EPS và giá trị OD đo được từ môi trường đều đạt cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy chủng Lb. fermentum TC16. Như vậy, đối với hai chủng Lb. fermentum TC16, MC3 thời điểm vi khuẩn phát triển mạnh nhất cũng chính là thời điểm mà lượng sản phẩm trao đổi chất tạo ra nhiều nhất. Đối với chủng Lb. fermentum TC13 và TC21, quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cực đại không trùng khớp với thời điểm vi khuẩn phát triển mạnh nhất (OD cao nhất). OD đo được từ môi trường nuôi cấy chủng Lb. fermentum TC21 theo thời gian đạt cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy, trong lúc đó lượng EPS đạt được tốt nhất ở 36 giờ. Với chủng Lb. fermentum TC13, giá trị OD đo được đạt cao nhất sau 36 giờ nuôi cấy, trong khi đó lượng EPS lại thu được cao nhất ở 48 giờ. Như vậy, đối với chủng TC21, có thể nói rằng quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp đạt cực đại xảy ra sớm hơn so với sự phát triển của vi khuẩn. Ngược lại, quá trình tổng hợp EPS cực đại của chủng Lb. fermentum TC13 lại xảy ra chậm hơn so với sự phát triển của vi khuẩn. Từ kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi nhận thấy rằng, quá trình phát triển và sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp của mỗi loại vi khuẩn khác nhau còn phụ thuộc vào thành phần môi trường cũng như điều kiện nuôi cấy. Giá trị OD trong các môi trường chúng tôi đo được có thể thể hiện sự phát triển của vi khuẩn cũng như những sản phẩm thứ cấp được tạo thành trong quá trình sinh trưởng của chúng. Những sản phẩm tạo thành này có thể bao gồm những chất độc và có thể cản trở sự phát triển của vi sinh vật gây giảm khả năng tổng hợp EPS. Chính vì vậy, dựa vào sự biến đổi của đường cong sinh trưởng và sản phẩm cần thu để chọn thời điểm kết thúc quá trình nuôi cấy phù hợp nhất. Thời gian sinh trưởng và tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các loài vi sinh vật khác nhau thường khác nhau, đặc biệt là khi được nuôi cấy với điều kiện và thành phần môi trường không giống nhau. Quá trình sinh trưởng và tổng hợp EPS từ Lb. 80 confusus TISTR 1498 đạt được cao nhất (đạt 38,2g/l) xảy ra sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trường MRS chứa 100 g/l suc ở điều kiện pH 5,5, nhiệt độ 35oC [111]. Kết quả nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2011) cho thấy, chủng Lb. fermentum F6 sinh tổng hợp EPS tăng dần từ khi bắt đầu nuôi cấy và đạt cực đại sau 32 giờ trong môi trường chứa sữa tách béo, glc và dịch whey protein (WPC) [141]. Khả năng sinh tổng hợp EPS của Lb. fermentum TDS030603 xảy ra ở các thời điểm khác nhau tùy vào thành phần môi trường là kết luận của Fukuda và cộng sự (2010) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbohydrate lên tính chất lý hóa của EPS sinh ra từ chủng này. Trong môi trường MRS, lượng EPS thu được cao nhất chỉ sau khoảng 24 giờ nuôi cấy, trong khi đó, với môi trường MRS có bổ sung thêm glc, lac, gal, quá trình tổng hợp EPS đạt cực đại sau khoảng 48 giờ nuôi cấy, còn với môi trường MRS có bổ sung thêm suc thì lượng EPS tạo thành tăng theo thời gian ủ đến khoảng 72 giờ [44]. Nghiên cứu của Torino và cộng sự (2005) về quá trình sinh tổng hợp EPS của chủng Lb. helveticus ATCC 15807 cho thấy, quá trình sinh EPS của chủng này xảy ra trong suốt pha phát triển ở cả hai giá trị pH và đạt cực đại ở pha cân bằng. Lượng EPS tổng hợp được trong điều kiện môi trường có pH 4,5 đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và có giá trị cao hơn gấp 2,9 lần so với môi trường có pH 6,2. Sau 24 giờ nuôi cấy, quá trình tổng hợp EPS giảm nhẹ ở pH 6,2 nhưng lại tiếp tục tăng ở pH 4,5 đến 30 giờ mới có chiều hướng giảm [118]. Quá trình tổng hợp EPS bởi chủng S. salivarius ssp. thermophilus đã không xảy ra pha phát triển (0-6 giờ) hoặc trước pha cân bằng (6-10 giờ) khi thực hiện nuôi cấy ở 42 oC. Lượng EPS chỉ thu được với giá trị cực đại giữa thời điểm 14 và 18 giờ ủ [46]. Chủng Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus HP1 phân lập từ các hạt kefir khi được ủ riêng biệt có khả năng sinh tổng hợp EPS đạt cực đại (472,6 mg/L) sau 28 giờ nuôi cấy. Trong khi đó, hỗn hợp các chủng (gồm Lb. bulgaricus HP1 + S. thermophilus T15 + Lb. lactis C15 + Lb. helveticus MP12 + S. cerevisiae A13) được ủ cùng nhau lại sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất sau 22 giờ nuôi cấy với lượng EPS thu được khoảng 824,3 mg/L [43]. Công bố của Zhang và cộng sự (2011) về sự khác nhau của quá trình sinh tổng hợp EPS bởi S. thermophilus ST1 khi được nuôi cấy ở các mức nhiệt độ khác nhau (gồm 30, 37 và 42 oC). Theo đó, ở 42oC, lượng EPS thu được tốt nhất với 59,06 mg/l sau 32 giờ nuôi cấy. Chủng này sinh EPS ít hơn ở 30 và 81 37oC với các giá trị tương ứng ở mức nhiệt độ này là 21,47 mg/l sau 24 giờ và 34,35 mg/l sau 16 giờ nuôi cấy. Trong môi trường sữa tách béo và môi trường sữa tách béo có bổ sung thêm 0,5% WPC, chủng S. thermophilus ST1 có khả năng tổng hợp EPS đạt cực đại tương ứng sau 16 giờ (41,10 mg/l) và 24 giờ (82,70 mg/l) ở 42 oC [140]. Tóm lại, quá trình sinh trưởng và phát triển chỉ xảy ra trong một khoảng thời gian nhất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy và chất lượng của tế bào nuôi cấy. Khả năng phát triển của vi sinh vật trong môi trường sẽ xảy ra chậm khi các chất dinh dưỡng trong môi trường giảm và đến hết khiến vi sinh vật không đủ chất dinh dưỡng để duy trì quá trình trao đổi chất. Mặt khác, khi tế bào đã đến giai đoạn già hóa hoặc các sản phẩm trao đổi chất trong môi trường quá nhiều đã gây ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào. Chính vì vậy, với mục đích thu các sản phẩm trao đổi chất thì quá trình nuôi cấy nên kết thúc vào thời điểm cuối pha log là phù hợp nhất. Kết luận 1: Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong luận án Các chủng vi khuẩn Lb. fermentu m Điều kiện thu nhận Hiệu suất thu nhận EPS ở các điều kiện đã khảo sát so với môi trường đối chứng MRS (%) Thành phần môi trường Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu (cfu/ml ) pH ban đầu Nhiệt độ nuôi cấy (oC) Thời gian lên men (giờ) Nguồn C Nguồn N TC13 4% glc 0,4% cao nấm 107 5,5 40 48 353,56 TC16 3% suc 0,8% cao thịt 106 6,0 35 48 356,95 TC21 4% lac 0,8% cao thịt 106 6,0 35 36 414,51 MC3 4% glc 0,3% cao nấm 106 6,0 35 48 479,14 * Số liệu tính hiệu suất thu nhận EPS được trình bày chi tiết ở phụ lục 4.7 82 Như vậy, mỗi chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có những điều kiện sinh trưởng của riêng chúng. Tổng lượng EPS tổng hợp bởi LAB phụ thuộc vào thành phần của môi trường (nguồn C và N) và điều kiện mà các chủng đó phát triển, như nhiệt độ, pH ban đầu và thời gian nuôi cấy. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu được tổng hợp ở Bảng 3.1. Từ kết luận này và kết hợp đối chiếu kết quả thu nhận EPS từ các chủng Lb. fermentum đã được công bố trước đây (Lb. fermentum TDS030603 [44]; Lb. fermentum F6 [141]; Lb. fermentum CFR 2195 [136]) khi nuôi cấy chúng trong môi trường chứa nguồn C, N khác nhau ở các điều kiện không giống nhau, chúng tôi nhận thấy rằng cùng một loài vi khuẩn là fermentum khi được nuôi cấy trong những điều kiện lên men khác nhau cũng thể hiện khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp EPS khác nhau nhất định. Sự khác biệt về hàm lượng EPS tạo thành này liên quan đến sự tác động không nhỏ của nhiều yếu tố như nguồn phân lập của các vi khuẩn, thành phần dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy. 3.1.4. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men 3.1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein Để thực hiện khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ protein có trong dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn Lb. fermentum, chúng tôi đã tiến hành bổ sung TCA vào các môi trường lên men ở các nồng độ khác nhau (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40%). Thực hiện khuấy trong 24 giờ sau đó thu mẫu và tiến hành xác định hàm lượng protein còn lại theo phương pháp Kjeldahl và hàm lượng EPS trong dịch nổi được xác định theo phương pháp phenol – sulfuric. Kết quả khảo sát thể hiện ở Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11. Kết quả các số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 5.1. Kết quả trên các Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy, khi nồng độ TCA bổ sung vào tăng lên, lượng protein còn lại trong dịch nuôi cấy đều có xu hướng giảm dần. Khả năng loại bỏ protein bởi nồng độ TCA bổ sung vào trong dịch lên men của các chủng khác nhau là không giống nhau. 83 491,053 289,680 0 100 200 300 400 0 100 200 300 400 500 600 10 15 20 25 30 35 40 H àm l ư ợ n g p ro te in cò n l ại ( µ g /m l) E P S ( µ g /m l) Nồng độ TCA (%) Lb. fermentum TC21 EPS Protein 432,110 289,207 287,550 275 280 285 290 295 300 0 100 200 300 400 500 10 15 20 25 30 35 40 H àm l ư ợ n g p ro te in cò n l ại ( µ g /m l) E P S ( µ g /m l) Nồng độ TCA (%) Lb. fermentum TC16 EPS Protein 473,004 261,280 0 100 200 300 400 360 380 400 420 440 460 480 10 15 20 25 30 35 40 H àm l ư ợ n g p ro te in cò n l ại ( µ g /m l) E P S ( µ g /m l) Nồng độ TCA (%) Lb. fermentum TC13 EPS Protein Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 84 Đối với chủng Lb. fermentum TC13, khả năng loại bỏ protein hiệu quả nhất khi nồng độ TCA bổ sung vào là 40%. Lượng protein còn lại trong dịch nổi trong trường hợp này chỉ còn 231,933 µg/ml. Ở nồng độ TCA 40%, lượng EPS thu được tương ứng rất thấp, chỉ đạt 407,72 µg/ml. Hàm lượng EPS quan sát được là cao nhất với 473,004 µg EPS /ml khi nồng độ TCA bổ sung vào là 15%. Ở nồng độ TCA bổ sung này, lượng protein còn lại trong dịch nổi cũng tương đối thấp, còn khoảng 261,28 µg/ml. Hàm lượng protein còn lại trong dịch nổi là 261,28 µg/ml cũng là hàm lượng protein đo được khi nồng độ TCA bổ sung vào là 20%. Tuy nhiên, lượng EPS ở nồng độ TCA 20% thu được cũng thấp hơn so với EPS tại nồng độ 15% (Hình 3.8). Ở các nồng độ TCA bổ sung vào cao hơn (25, 30, 35%), lượng EPS có sự khác nhau với mức ý nghĩa p<0,05 nhưng lượng protein bị loại bỏ lại hầu như không có sự sai khác khi xử lý thống kê (phụ lục 5.1). Như vậy, mặc dù ở nồng độ TCA là 40%, lượng protein được loại bỏ tốt hơn so với ở nồng độ 15% nhưng hàm lượng EPS thu được ở hai nồng độ này thì ngược lại. Do đó, với mục đích là thu nhận EPS hiệu quả chúng tôi chọn nồng độ TCA bổ sung vào là 15%. Với chủng Lb. fermentum TC16, lượng protein còn lại trong dịch lên men thấp và lượng EPS thu được đạt cực đại khi quá trình tủa bằng TCA được thực hiện với nồng độ bổ sung là 35%. Ở điều kiện này, lượng EPS đạt được khoảng 432,11 µg/ml và lượng protein còn lại là 287,55 µg/ml. Ở các nồng độ TCA bổ sung vào dịch nuôi 498,817 244,240 0 50 100 150 200 250 300 350 380 400 420 440 460 480 500 520 10 15 20 25 30 35 40 H àm l ư ợ n g p ro te in cò n l ại ( µ g /m l) E P S ( µ g /m l) Nồng độ TCA (%) Lb. fermentum MC3 EPS Protein Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 85 cấy là 10, 15, 20, 25, 30 và 40%, EPS thu được thấp và lượng protein còn lại có giảm theo chiều tăng của nồng độ TCA. Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê cho thấy, hàm lượng EPS thay đổi và có sự khác nhau giữa các nồng độ nhưng khả năng loại bỏ protein ở các nồng độ TCA bổ sung vào lại không có sự sai khác (p<0,05) (phụ lục 5.1). Khả năng loại bỏ protein trong dịch lên men của chủng Lb. fermentum TC21 đạt hiệu quả cao hơn khi nồng độ TCA bổ sung vào tăng dần từ 10% đến 40% (Hình 3.10). Trong khi đó, khả năng thu EPS lại đạt được cao hơn với nồng độ TCA bổ sung ở mức thấp là 10, 15, 20%. Đặc biệt, EPS đạt cao nhất với hàm lượng là 491,703 µg/ml khi nồng độ TCA bổ sung vào môi trường là 15%. Ở nồng độ TCA bổ sung vào là 20%, lượng EPS thu được cũng tương đối cao, đạt 491,053 µg/ml (chiếm 99,87% so với EPS cực đại). Kết quả phân tích thống kê cho thấy, hàm lượng protein còn lại trong dịch nổi sau khi ly tâm chỉ có sự sai khác ở hai khoảng nồng độ TCA bổ sung là 10%, 15% và từ 20 - 40%. Như vậy, mặc dù lượng EPS thu được ở dịch nổi có bổ sung 15% TCA cao hơn so với EPS trong dịch nổi bổ sung 20% TCA. Tuy nhiên, xét về mối tương quan để thu nhận EPS hiệu quả, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ TCA bổ sung vào dịch nuôi cấy vừa có hiệu quả cho cả việc loại bỏ protein và việc thu nhận EPS là 20%. Ở dịch lên men của Lb. fermentum MC3, lượng protein bị loại bỏ xảy ra theo chiều hướng tăng dần khi tăng nồng độ TCA bổ sung vào. Khả năng loại bỏ protein trong dịch lên men đạt cao nhất ở nồng độ TCA bổ sung vào là 40%. Lượng protein còn lại trong dịch nổi chỉ còn 185,547 µg/ml. Tương ứng với khả năng loại bỏ protein tốt nhất thì lượng EPS còn lại trong dịch nổi lại được xác định là giảm khá nhiều so với lượng EPS ở các nồng độ khác. Lượng EPS thu được tốt nhất sau khi ly tâm dịch nuôi cấy có bổ sung thêm 20% TCA, đạt khoảng 498,817 µg/ml. Kết quả phân tích thống kê cho thấy, khả năng tách bỏ protein hầu như không có sự sai khác ở các nồng độ 10% và 15%; 20%, 25% và 30%; 30% và 35%; 35% và 40%. Trong khi đó, sự sai khác đã xảy ra đối với lượng EPS thu được khi xử lý thống kê (phụ lục 5.1). Cụ thể là, lượng EPS thu được có sự sai khác rõ rệt với mức ý nghĩa p < 0,05 ở ba nồng độ 86 TCA là 15%, 20% và 25%. Ở các nồng độ 30%, 35%, 40% lượng EPS thu được không có sự sai khác. Kết hợp các kết quả ở trên, chúng tôi chọn nồng độ TCA bổ sung phù hợp nhất để loại bỏ protein trong dịch lên men của chủng Lb. fermentum MC3 là 20%. Nồng độ TCA sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi dịch lên men trong nhiều nghiên cứu thu nhận EPS từ LAB không cố định và thay đổi khác nhau tùy nhóm tác giả. Chẳng hạn, nồng độ TCA sử dụng trong quá trình tách chiết EPS từ dịch lên men của các chủng thuộc LAB trong các nghiên c