Luận án Nghiên cứu, thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (chaetomorpha sp.) để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

g pháp kết tủa protein Quá trình kết tủa protein được thực hiện bằng ba phương pháp khác nhau: kết tủa đẳng điện bằng acid HCl, kết bằng dung môi ethanol và muối (NH4)2SO4. Quá trình kết tủa được thực hiện với các thông số tối ưu như sau: - Quá trình kết tủa đẳng điện bằng acid HCl 1%: được thực hiện ở nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút, ở pH 3,0 với nhóm protein tan trong nước và ở pH 4,0 với nhóm protein tan trong kiềm. - Quá trình kết tủa bằng ethanol 80%: được thực hiện ở nhiệt độ 50C, thời gian 40 phút, tỷ lệ dung dịch ethanol:dịch trích là 4:1. - Quá trình kết tủa bằng muối (NH4)2SO4: nồng độ muối bão hoà 70%, tỷ lệ dung dịch muối:dịch trích là 1:2, thời gian kết tủa 30 phút với nhóm protein tan trong nước và 40 phút với nhóm protein tan trong kiềm. Sau khi kết tủa, mẫu được thẩm tích để loại muối. Kết quả của các quá trình kết tủa được thể hiện ở Bảng 3.15. Bảng 3.15. Hiệu quả tủa protein bằng pH đẳng điện, ethanol, (NH4)2SO4 Tác nhân kết tủa Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh khiết (% w/w) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh khiết (% w/w) pI đẳng điện 27,10 36,49 71,37 47,69 Ethanol 69,29 53,14 48,40 48,29 (NH4)2SO4 (trước thẩm tích) 62,86 58,77 65,29 62,29 (NH4)2SO4 (sau thẩm tích) 44,51 72,80 46,41 75,50 Trong các phương pháp thì kết tủa nhóm protein tan trong kiềm tại pI đẳng điện cho hiệu suất tủa cao (71,37%). Nguyên nhân là do có nhiều protein trong dịch trích ly có điểm đẳng điện gần vùng pH 4. Đây cũng thường là phương pháp kết tủa được sử dụng để thu protein với hiệu suất cao trong quá trình sản xuất các protein tan trong kiềm từ thực vật như protein đậu nành. Tuy nhiên, so với phương pháp kết tủa bằng muối ammonium kết hợp với thẩm tích loại muối, tủa tại pI đẳng điện cho sản phẩm protein có độ tinh khiết thấp (47,69%) [62]. 71 Ngược lại với kết tủa đẳng điện khá hiệu quả với nhóm protein tan trong kiềm, phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ như ethanol lại cho hiệu suất kết tủa cao đối với nhóm protein tan trong nước (69,29%). Trên bề mặt các phân tử protein thuộc nhóm này sẽ có các nhóm chức của các acid amin phân cực và tích điện. Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, lớp vỏ nước bao phủ các vùng ưa nước này sẽ bị loại bỏ và phân tử protein sẽ tập hợp lại thông qua tương tác giữa các nhóm chức tích điện trái dấu trên bề mặt phân tử protein [152]. Tuy nhiên, tương tự như kết tủa tại pI đẳng điện, chế phẩm protein tan trong nước thu được sau khi tủa bằng dung môi ethanol có độ tinh sạch không cao (53,14%) . Sử dụng muối amonium có thể kết tủa khá hiệu quả cả hai nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm. Cơ chế của quá trình kết tủa protein bằng muối là loại bỏ lớp vỏ nước và gây hiện tượng tập hợp các phân tử protein thông qua tương tác của các vùng kị nước trên bề mặt phân tử protein [158]. Tỷ lệ các acid amin kị nước trong protein của rong cao và chúng có thể phân bố trên bề mặt phân tử protein. Tỷ lệ nhóm protein này cao dẫn tới hiệu quả thu tủa bằng muối cao. Ngoài ra, sau quá trình kết tủa, sử dụng màng bán thấm kích thước 14kDa đã loại đi một lượng đáng kể các phân tử có kích thước nhỏ, đặc biệt là muối trong kết tủa protein, nhờ đó làm tăng độ tinh khiết. Kết quả trong Bảng 3.15 cho thấy việc kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 và sau đó loại muối bằng thẩm tích cho độ tinh sạch của sản phẩm cao nhất và đạt trên 70%, trong khi sử dụng hai tác nhân tủa là acid và ethanol cho độ tinh sạch của chế phẩm protein thấp và chỉ đạt tối đa 53%. Tuy nhiên, một lượng protein có kích thước nhỏ cũng sẽ bị thất thoát, dẫn đến hiệu suất thu hồi protein sau quá trình thẩm tích không cao, chỉ còn 45-46%. Trong ba tác nhân này, amonium sulfat là hóa chất rẻ tiền, dễ kiếm hơn so với hai tác nhân còn lại. Mặt khác, các tác nhân kết tủa như acid hay ethanol có xu hướng làm biến tính protein. Do vậy, để có thể thu nhận chế phẩm protein concentrate có độ tinh sạch trên 70% để có thể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn tác nhân muối amonium sulfat để làm tác nhân kết tủa protein. Kết quả của chúng tôi cũng khá tương đồng với một số công bố về thu nhận protein từ rong biển, như Phycobiliprotein từ tảo Porphyra yezoensis đã được kết tủa 72 bằng pI đẳng điện và ammonium sulfat. Cách làm tương tự cũng được tiến hành trên đối tượng là vi tảo Chlorella vulgaris [63, 156]. 3.7. Xác định tính chất của chế phẩm protein concentrate 3.7.1. Thành phần protein của chế phẩm protein concentrate Để thu nhận chế phẩm protein concentrate, chúng tôi tiến hành trích ly hai phân đoạn protein tan trong nước và tan trong kiềm, sau đó kết tủa bằng muối ammonium và thẩm tích loại muối theo các điều kiện tối ưu. Chế phẩm protein sau khi sấy đông khô đến độ ẩm dưới 10% w/w (hình 3.8) được đem kiểm tra hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.16. Bảng 3.16. Hàm lượng protein trong các chế phẩm protein concentrate Rong nguyên liệu Chế phẩm APC-N Chế phẩm APC-K Hàm lượng protein (%) 12,68 72,8 76,3 Như vậy, với phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của siêu âm và enzyme cellulase, kết tủa bằng muối amonium sulfate và tinh sạch loại muối bằng membrane, chúng tôi đã thu được các phân đoạn protein tan trong nước và tan trong kiềm với hàm lượng protein tương đối cao và nằm trong khoảng 72,8-76,3%. Hàm lượng protein trong các chế phẩm protein thu nhận từ rong cao hơn so với một số sản phẩm protein concentrate từ đậu nành đang bán trên thị trường (SPC60 của DKSH, Thụy Điển có hàm lượng protein >60%); tương đương với chế phẩm SPC của Gushen Group (hàm lượng protein 78%) và thấp hơn so với một số sản phẩm protein isolate từ sữa và đậu nành (Soy protein isolate của DKSH, Milk protein concentrate của Melkweg, Hà Lan chứa trên 80% protein). 3.7.2. Thành phần acid amin trong các chế phẩm protein Chế phẩm protein được gửi sang Trung tâm Phân tích kỹ thuật cao Sài Gòn để phân tích thành phần các acid amin bằng phương pháp HPLC sử dụng cột Aminex HPX 87P, đầu dò RI. Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.17. Thành phần và tỷ lệ acid Hình 3.8. Chế phẩm protein APC-K 73 amin thu được tương đối phù hợp với các nghiên cứu về thành phần acid amin của rong biển như: Barbarino và Lourenço, 2005; Lourenço, và cộng sự, 2002 [17, 18]. Bảng 3.17. Thành phần acid amin trong chế phẩm protein Acid amin Hàm lượng acid amin trong chế phẩm protein (g/100g protein) Chế phẩm APC-N Chế phẩm APC-K Aspatic acid 11,7 ± 0,2 11,5 ± 0,15 Glutamic acid 16,1 ± 0,09 15,7 ± 0,14 Serine 5,3 ± 0,03 5,1 ± 0,1 Histidine 1,4 ± 0,07 1,7 ± 0,25 Arginine 5,3 ± 0,15 6,2 ± 0,1 Glycine 4,9 ± 0,18 4,9 ± 0,12 Threonine 4,1 ± 0,16 5,1 ± 0,23 Alanine 7,3 ± 0,11 7,8 ± 0,09 Tyrosine 4,5 ± 0,09 4,1 ± 0,06 Methionine 3,6 ± 0,15 3,5 ± 0,15 Valine 5,4 ± 0,18 6,5 ± 0,09 Phenylanine 5,9 ± 0,34 5,9 ± 0,18 Isoleucine 3,5 ± 0,15 4,6 ± 0,01 Leucine 8,3 ± 0,14 8,6 ± 0,09 Lysine 5,1 ± 0,18 5,6 ± 0,07 Cystine 3,0 ± 0,05 1,8 ± 0,09 Proline 4,6 ± 0,09 1,4 ± 0,05 Nhìn chung, hai chế phẩm protein APC-N và APC-K đều có thành phần khá giống nhau, tuy nhiên chế phẩm protein tan trong kiềm có tỷ lệ 2 acid amin là glutamic acid và aspartic acid cao hơn, tỷ lệ lysine và isoleucine thấp hơn so với chế phẩm protein tan trong nước. Chế phẩm protein tan trong nước lại có tỷ lệ 2 acid amin cysteine và proline thấp hơn đáng kể trong khi valine, alanine và arginine lại cao hơn khi so với chế phẩm protein tan trong kiềm. Sự khác nhau trong thành phần acid amin, sự sắp xếp của chúng trong chuỗi polypeptide và cấu trúc không gian là yếu tố quan trọng quyết định các tính chất sinh học, tính chất chức năng cũng như giá trị dinh dưỡng của các loại protein. 74 Trong protein của rong Chaetomorpha sp., aspartic acid và glutamic acid là hai acid amin chiếm tỷ trọng cao nhất. Đây là hai acid amin có tính acid, thuộc nhóm acid amin thay thế được, nhưng lại có vai trò quan trọng với cơ thể sống. Aspartic và acid glutamic có chức năng trong hệ thống thần kinh trung ương như là chất dẫn truyền các kích thích thần kinh. Bên cạnh đó chúng còn có vai trò hỗ trợ việc tổng hợp các acid amin khác và giúp vận chuyển glucose qua hàng rào máu não để cung cấp năng lượng cho các hoạt động của bộ não [160, 161]. Ba acid amin là leucine, isoleucine và valine cũng chiếm tỷ lệ khá cao trong tổng số protein của rong biển. Ba acid amin này được gọi là chuỗi acid amin phân nhánh (BCAA- Branched chain amino acids) do cấu trúc phân tử của chúng. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất. BCAA được chuyển hoá trong mô cơ, do đó các tế bào cơ thực hiện quá trình oxy hóa BCAA để tạo ra nguồn năng lượng tế bào ở dạng ATP. Quá trình chuyển hóa này có thể tạo ra nguồn năng lượng nhanh chóng khi cơ thể cần [162]. Theo Cristine Couto Almeid (2015), so với các protein nguồn gốc động vật, các protein từ thực vật thường thiếu hụt một số các acid amin thiết yếu như methionine, lysine, threonine, histidine. Tuy nhiên, hàm lượng các acid amin thiết yếu trong protein của rong Chaetomorpha sp. chiếm tỷ lệ cao, tổng hàm lượng của 8 acid amin không thay thế trong chế phẩm protein APC-N và APC-K chiếm tương ứng 35,9% và 40,2% so với tổng lượng protein có trong rong. Hàm lượng các acid amin như methionine, lysine và threonine trong các chế phẩm protein từ rong cao hơn so với các protein có nguồn gốc thực vật. Tuy nhiên hàm lượng histidine lại khá thấp và đây có thể là một yếu tố hạn chế trong thành phần acid amin thiết yếu của chế phẩm protein thu nhận từ sinh khối rong [99]. 3.7.3. Hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein concentrate 3.7.3.1 Hình thái của chế phẩm protein concentrate Hình thái cấu trúc của chế phẩm protein concentrate được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Hình 3.9 cho thấy cấu trúc của chế phẩm protein concentrate có dạng tấm. Chế phẩm protein tan trong nước APC-N có cấu trúc tấm phẳng và lớn, trong khi chế phẩm 75 protein tan trong kiềm APC-K có cấu trúc dạng tấm nhỏ hơn, bề mặt gồ ghề và xốp. Thông thường các tấm có cấu trúc nhỏ và xốp sẽ có độ hoà tan cao hơn. [163, 164] Kính hiển vi điện tử quét SEM đã và đang được sử dụng phổ biến để quan sát cấu trúc vi mô của các chế phẩm protein concentrate và isolate trong thực phẩm. Kỹ thuật này cũng được các nhà khoa học sử dụng để giải thích các tính chất chức năng của các chế phẩm protein trong lĩnh vực thực phẩm. Akalın và cộng sự đã sử dụng hình ảnh chụp SEM để giải thích cho sự khác biệt trong việc hình thành hệ gel của các sản phẩm sữa chua. Li và cộng sự cũng sử dụng hình ảnh chụp SEM để giải thích cấu trúc gel của protein concentrate từ đậu nành và bắp [165, 166]. 3.7.3.2 Phân đoạn protein trong chế phẩm protein từ rong và xác định kích thước phân tử của chúng bằng điện di Chế phẩm protein concentrate từ rong sẽ được phân đoạn bằng sắc ký lọc gel và xác định kích thước phân tử bằng điện di SDS-PAGE. a b c d Hình 3.9. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. (a), (b) chế phẩm APC.N; (c), (d) chế phẩm APC.K 76 Cột sắc ký với kích thước 50 x 1,5 (cm) và gel Biogel P – 100 được sử dụng để tinh sạch và phân đoạn protein bằng phương pháp sắc ký. Cỡ hạt sử dụng là 100 – 200 mesh (10 – 40µm). Hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm được hoà tan lại vào đệm phosphate lần lượt ở pH 7,0 và pH 9,0. Kết quả phân đoạn thể hiện trên hai sắc ký đồ ở Hình 3.10 và Hình 3.11. Hình 3.10. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong nước Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong kiềm Dựa vào sắc ký đồ, chúng tôi thu được các phân đoạn protein dựa trên sự khác biệt về kích thước phân tử như sau: 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 O D 2 8 0 n m Phân đoạn Sắc ký đồ - mẫu protein tan trong nước 0.6 1.1 1.6 2.1 2.6 3.1 3.6 4.1 4.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940 O D 2 8 0 N M PHÂN ĐOẠN Sắc ký đồ - mẫu protein tan trong kiềm 77 ✓ Sắc ký đồ của mẫu protein tan trong nước: thu được 2 peak, peak 1 gồm phân đoạn 3 – 9, peak 2 gồm phân đoạn 14 – 22. ✓ Sắc ký đồ của mẫu protein tan trong kiềm: thu được 2 peak, peak 1 gồm phân đoạn 11 – 17, peak 2 gồm phân đoạn 26 – 34. Các peak thu được sau sắc ký lọc gel được chạy điện di để xác định kích thước của phân tử protein. Kết quả điện di thể hiện ở Hình 3.12. Hình 3.12. Kết quả điện di L: thang chuẩn; Np2.1, Np2.2 là 2 peak của mẫu protein tan trong nước. Kp1, Kp2 là 2 peak của mẫu protein tan trong kiềm. Hình 3.13. Kết quả điện di protein không qua sắc ký L: thang chuẩn; các mẫu Np và Kp mẫu protein tan trong nước và protein tan trong kiềm ở các nồng độ khác nhau. Theo kết quả trên hình 3.12, với cả hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm, chỉ có peak thứ nhất thu được sau quá trình sắc ký lọc gel là thể hiện kết quả phân tích MW của protein trên bảng gel điện di. Hai mẫu đều chứa một loại protein có kích thước giống nhau là 14 kDa khi so sánh với thang chuẩn protein. Peak thứ hai của cả hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm đều không thể hiện kết quả điện di. 78 Kết quả điện di cũng cho thấy, trong peak Np2.1 và Kp1 ngoài một protein ở vị trí kích thước 14 KDa, các phân đoạn protein khác bị dính thành vệt dài không tách ra được. Điều này thể hiện một cách rõ rệt khi chúng tôi tiến hành chạy điện di để xác định kích thước của các phân đoạn protein trong chế phẩm APC-N và APC-K mà không qua giai đoạn tinh sạch bằng sắc ký (Hình 3.13). Các phân tử protein có cấu trúc rất phức tạp. Cấu trúc không gian của protein cũng như khả năng bị biến tính trong môi trường chứa SDS có thể ảnh hưởng đến khả năng di động của protein. Bên cạnh đó, protein còn có thể liên kết với các thành phần phi protein khác và rất khó để có thể tách riêng protein ra khỏi các thành phần này trong các điều kiện chạy điện di SDS-PAGE thông thường. Sự ảnh hưởng của hình dạng và kích thước của các thành phần liên kết phi protein đến tính di động của protein là rất khó dự đoán. Theo nhiều nghiên cứu, các protein trong rong thường có bản chất là các glycoprotein. Glycoprotein là các protein có chứa các oligosaccharide/polysaccharide liên kết cộng hóa trị với các acid amin thích hợp. Các glycoprotein có độ linh động điện di thấp và trọng lượng phân tử cao, do đó tạo ra hiện tượng kéo thành dải trong gel điện di [167, 168]. 3.3.7.3 Xác định khối lượng phân tử của các phân đoạn protein bằng LC/MS/MS Hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm được gửi đến phòng thí nghiệm Sinh hoá, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM để xác định kích thước phân tử bằng phương pháp LC-MS/MS, sử dụng kĩ thuật ion hoá mẫu bằng tia lửa điện (ESI) và xác định khối lượng phân tử bằng QTOF. Sắc ký đồ của hai mẫu protein khi phân tích LC/MS/MS thể hiện ở hình 3.14. 79 Hình 3.14. Sắc ký đồ của chế phẩm protein APC-N khi phân tích LC-MS/MS Kết quả phân tích khối phổ của các peak này như sau. − Mẫu protein tan trong nước chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 13,6 kDa, 15,4 kDa, 27,2 kDa và 38,6 kDa (Hình 3.15) − Mẫu protein tan trong kiềm chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 21,1 kDa, 27,2 kDa, 34,1 kDa 40,5 kDa và 63,8 kDa (Hình 3.16). − Phân đoạn protein có kích thước 27,2 kDa có tần suất xuất hiện nhiều lần nhất cả hai mẫu protein. Điều này cho thấy phân đoạn protein này có hàm lượng cao trong chế phẩm protein thu nhận từ rong Chaetomorpha. 80 Hình 3.15. Kết quả phân tích MS mẫu APC-N Hình 3.16. Kết quả phân tích MS mẫu APC-K Hình thái cấu trúc của chế phẩm protein concentrate được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Hình 3.17 cho thấy cấu trúc của protein concentrate có dạng tấm. Ở chế phẩm APC.N cấu trúc tấm phẳng và lớn hơn ở APC.K. Cấu trúc của protein tan trong kiềm có cấu trúc tấm nhưng nhỏ hơn và trên bề mặt có một số cấu trúc xốp. Thông thường các tấm có cấu trúc nhỏ hơn sẽ có độ hoà tan cao hơn. [163, 164]. 81 Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM đã và đang được sử dụng phổ biến để quan sát cấu trúc vi mô của các chế phẩm protein concentrate và isolate trong thực phẩm. Kỹ thuật này cũng được các nhà khoa học sử dụng để giải thích các tính chất chức năng của các chế phẩm protein trong lĩnh vực thực phẩm. Akalın và cộng sự đã sử dụng hình ảnh chụp SEM để giải thích cho sự khác biệt trong hệ gel trong các sản phẩm sữa chua. Li và cộng sự sử dụng hình ảnh chụp gel để giải thích cấu trúc gel của protein concentrate đậu nành và bắp [165, 166]. 3.8. Xác định tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate 3.8.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn Những chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm các chủng gây bệnh ở người do ATCC cung cấp: Staphylococcus aureus (ATCC 13709), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) a b c d Hình 3.17. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. (a), (b) chế phẩm APC.N; (c), (d) chế phẩm APC.K 82 Phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch được sử dụng để xác định vùng ức chế của chế phẩm protein đối với sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng kháng khẩn càng mạnh. Các mẫu được ủ ở 370C, đọc kết quả sau 24 giờ. Mẫu đối chứng sử dụng kháng sinh Kanamycin 10µg/ml thay cho dung dịch protein. Kết quả thể hiện ở phụ lục B23. Chế phẩm protein tan trong kiềm APC.K có hiệu quả ức chế vi khuẩn cao hơn chế phẩm protein tan trong nước APC.N. Hiệu quả ức chế của chế phẩm APC.K thể hiện trên cả ba chủng vi khuẩn thử nghiệm. Cụ thể, chế phẩm APC.K thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn S. aureus khi sử dụng ở nồng độ 6 mg/ml, ức chế E. coli và P. aeruginosa khi sử dụng ở nồng độ 8 mg/ml. Chế phẩm APC.N không có khả năng ức chế vi khuẩn P. aeruginosa và chỉ có thể ức chế vi khuẩn S. aureus và E. coli khi sử dụng ở nồng độ khảo sát là 10 mg/ml. Khi so sánh với đối chứng là kháng sinh Kanamycin với nồng độ khuyến nghị là 10µg/ml, hiệu quả kháng khuẩn của protein concentrate từ rong là khá tốt đối với vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa (Đường kính vòng kháng khuẩn đối với 2 vi khuẩn này tương ứng là 6 mm và 6,33 mm). Kháng sinh có hiệu quả kháng vi khuẩn E. coli cao hơn gấp đôi so với khi sử dụng protein concentrate từ rong. Tuy nhiên, giá trị MIC (nồng độ thấp nhất tại đó chế phẩm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn) của chế phẩm protein từ rong cao hơn nhiều so với đối chứng là kháng sinh Kanamycin. Điều đó cũng cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm protein từ rong còn khá thấp, chưa đủ để có thể đưa vào ứng dụng thực tế. Khả năng kháng khuẩn của rong lục cũng được nhiều nghiên cứu đề cập đến. Pierre và cộng sự đã báo cáo về khả năng kháng một số loại vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm của chế phẩm giàu carbohydrate (76,6%) được trích từ rong lục Chaetomorpha aerea. Hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất thể hiện trên ba chủng là Bacillus subtilis, Micrococcus luteus và Staphylococcus aureus với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 14mm, 13mm và 11mm. Nghiên cứu của Senthilkumar và Sudha cũng cho thấy dịch trích bằng dung môi methanol của rong lục C. linum có khả năng chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh, bao gồm S. aureus, B. cereus, E. coli, P. mirabilis, K. pneumoniae, và S. typhimurium. Marudhupandi và Kumar cũng ghi nhận dịch trích chứa fucoidan từ rong nâu Sargassum wightii có hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi 83 khuẩn gây bệnh ở người là Vibrio cholera và Salmonella typhi với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 18,6 mm và 8,6 mm [169-171]. 3.8.2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein từ rong Khả năng chống oxi hoá của hai chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha được thử nghiệm theo các cơ chế khác nhau. 3.8.2.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH Gốc tự do DPPH là một gốc tự do bền có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxi hoá thì gốc tự do DPPH bị trung hoà do nhận một electron từ chất chống oxi hoá. Hai chế phẩm protein tan trong trước APC.N và tan trong kiềm APC.K được pha loãng vào các dung môi thích hợp tới các nồng độ khác nhau. Mẫu APC.K được pha loãng trong nước cất hai lần với mẫu đối chứng âm sử dụng là nước cất hai lần. Mẫu APC.N được pha loãng trong đệm MeOH, với mẫu đối chứng âm sử dụng dung dịch đệm MeOH. Kết quả ghi nhận về tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm protein được thể hiện ở Hình 3.18 và Hình 3.19. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 H o ạ t tí n h b ắ t g ố c D P P H ( % ) Nồng độ APC-N (µg/ml) Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-N 84 Kết quả ở Hình 3.18 và Hình 3.19 cho thấy, khi tăng nồng độ mẫu thì tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm protein đều tăng. Điều đó chứng tỏ, khả năng bắt gốc tự do DPPH của các chế phẩm protein tăng tỉ lệ thuận theo chiều tăng nồng độ. Ở cùng một nồng độ, chế phẩm APC.N có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cao hơn hẳn chế phẩm APC.K. Ở cùng nồng độ thử nghiệm là 78,125 µg/ml thì tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm APC.N và APC.K lần lượt là 73,97% và 22,22%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K ở nồng độ thử nghiệm 312,55 µg/ml là 55,18%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC.N cao hơn có thể là do trong nhóm protein tan trong nước có chứa Phycocyanin là nhóm protein có hoạt tính kháng oxi hoá. Ngoài ra, phân tử protein thu nhận từ rong cũng có thể chứa các thành phần acid amin có khả năng kháng oxy hóa như cysteine (chứa nhóm thiol), các acid amin chứa nhóm phenolic như tyrosin. Bảng 3.18. Giá trị IC50 của chế phẩm protein và đối chứng vitamin C Nồng độ (µg/ml) Protein APC.N Protein APC.K Vitamin C IC50 (µg/ml) 19,11 229,02 4,91 Kết quả thu được cho thấy, chế phẩm APC.N có giá trị IC50 thấp hơn nhiều so với chế phẩm APC.K. Giá trị IC50 càng thấp thể hiện khả năng kháng oxi hóa càng cao. Điều này chứng tỏ hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC.N là cao hơn so với chế phẩm APC.K nhưng thấp hơn so với Vitamin C tinh khiết (Sigma). 0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 150 200 250 300 350H o ạ t tí n h b ắ t g ố c D P P H ( % ) Nồng độ APC-K (µg/ml) Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K 85 Thanigaivel và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng oxi hoá của dịch chiết bằng nước của Chaetomorpha antennina ở Mandapam (Ấn Độ). Kết quả cho thấy hoạt động bắt gốc tự do DPPH của chiết xuất rong biển tăng từ 45,64% lên 94,63% khi lượng dịch chiết tăng từ 10 đến 50 mg/ml. Giá trị IC50 đã được xác định là là 0,5 mg/ml. Nghiên cứu của Wu và cộng sự đã cho thấy, thành phần Phycobiliprotein ở S. platensis chứa hàm lượng cao acid glutamic, acid aspartic, alanine, leucine, arginine, isoleucine, serine, glycine và threonine. Các acid amin này được được báo cáo có liên quan đến khả năng chống oxy hóa cao. Các hoạt động bắt gốc tự do DPPH của Phycocyanin cho giá trị IC50 là 1,86 ± 0,18 mg/ml [172-174]. Sau khi thử nghiệm sơ bộ, hoạt tính kháng oxi hoá của chế phẩm APC-N là cao hơn hẳn so với chế phẩm APC-K. Với mục tiêu đánh giá khả năng ứng dụng chế phẩm APC-N trong thực phẩm chức năng giàu chất chống oxi hóa, APC-N tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu sâu hơn về khả năng chống oxi hoá bằng các cơ chế khác nhau. Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh hoá Trung tâm Sâm và Dược liệu, ĐH Y Dược, Tp HCM. 3.8.2.2. Khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ Phương pháp xác định khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ được dùng để đánh giá khả năng cho nguyên tử hydro của chế phẩm protein [175]. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.20. Hoạt tính trung hoà gốc tự do ABTS•+ tỷ lệ thuận với nồng độ protein APC-N thử nghiệm. Ở nồng độ APC-N thử nghiệm là 183,3 µg/ml hoạt tính trung hoà gốc tự do ABTS•+ là 69,64%. Giá trị IC50 là 52,24 µg/ml. Mẫu đối chứng được sử dụng để so sánh là vitamin C tinh khiết (Sigma) có giá trị IC50 là 1,49 µg/ml. Theo một số nghiên cứu, các protein mạch ngắn có thể giúp tăng hiệu quả tiếp xúc với gốc tự do ABTS•+ do hạn chế hiệu ứng không gian, nhờ đó tăng hiệu quả trung hoà gốc tự do. Tuy nhiên khả năng chống oxi hoá cũng được phát hiện trên các protein kích thước lớn (28kDa) ở cây họ cà Solanum torvum. Một số acid amin trong phân tử protein như Trp, Tyr, Met và Arg còn có khả năng ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong pha béo nên giúp cải thiện h