Luận án Nghiên cứu tổng hợp một số tác nhân quang hoạt từ beta - Cyclodextrin để ứng dụng trong phân tích các chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản

-CD tăng từ 25 mM đến 50 mM thì độ phân giải của đồng phân miconazol sẽ tăng, nhưng nếu tăng đến 75 mM thì độ phân giải sẽ giảm. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 2 3 4 5 6 pH dung dịch điện ly nền Đ ộ p h â n g iả i R-và S-Miconazol 6, 76 9 13 ,0 37 13 ,2 55 16 ,6 39 17 ,1 31 18 ,3 92 18 ,9 92 a b c d 56 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ TRIS lên độ phân giải của đồng phân miconazol Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ tác nhân Khảo sát hiệu quả tách của các tác nhân β-CD, HP-β-CD và HB-β-CD trên đồng phân miconazol trong điều kiện dung dịch TRIS-phosphat 50 mM, pH 2,5. Bảng 3.14. Ảnh hưởng nồng độ các tác nhân quang hoạt lên độ phân giải và thời gian di chuyển của đồng phân miconazol Nồng độ (mM) β-CD HP-β-CD HB-β-CD tM (phút) Rs tM (phút) Rs tM (phút) Rs Pic 1 Pic 2 Pic 1 Pic 2 Pic 1 Pic 2 2 16,973 17,437 2,35 17,326 17,792 2,48 18,562 19,104 2,51 5 17,527 17,903 2,34 18,023 18,506 2,37 19,273 19,816 2,35 10 18,925 19,275 1,45 19,204 19,682 1,96 20,427 20,916 2,08 - Kết quả cho thấy cả 3 tác nhân β-CD, HP-β-CD và HB-β-CD đều có tính chọn lọc trên đồng phân miconazol. 3.4.1.2. Nefopam hydroclorid Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền Khảo sát hiệu quả tách của đồng phân nefopam khi pH của dung dịch TRIS- phosphat 50 mM có chứa 30 mM HB-β-CD thay đổi trong khoảng từ 2,5 đến 5. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 20 40 60 80 Nồng độ dung dịch điện ly nền (mM) Đ ộ p h ân g iả i R-và S-Miconazol 57 Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH lên khả năng tách đồng phân nefopam: (a) pH 2,5; (b) pH 3,5; (c) pH 4,5; (d) pH 5,5. Kết quả khảo sát cho thấy khi pH tăng thì thời gian di chuyển của các đồng phân và độ phân giải giảm. Tại giá trị pH 2,5 độ phân giải giữa hai đồng phân nefopam có giá trị cao nhất. Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền Hình 3.14. Ảnh hưởng nồng độ TRIS lên độ phân giải của đồng phân nefopam Khảo sát hiệu quả tách của đồng phân nefopam trong điều kiện dung dịch điện ly nền có 30 mM HB-β-CD; 25% acetonitril và nồng độ TRIS-phosphat pH 2,5; thay đổi từ 25 mM đến 75 mM. 7, 78 8 15 ,0 47 7 5 16 ,6 62 15 ,7 56 13 ,0 38 13 ,2 09 16 ,3 64 a b c d 13 ,5 12 13 ,6 97 12 ,2 61 12 ,4 97 1 3, 79 8 13 ,9 86 25 mM (RS = 1,52) 50 mM (RS =1,84) 75 mM (RS =1,43) 58 Kết quả khảo sát cho thấy độ phân giải của đồng phân nefopam sẽ tăng khi nồng độ TRIS tăng đến 50 mM. Nếu tiếp tục tăng đến 75 mM thì độ phân giải giữa hai pic đồng phân sẽ bắt đầu giảm. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung môi hữu cơ thêm vào dung dịch điện ly nền Methanol và acetonitril được sử dụng để khảo sát sự thay đổi độ chọn lọc đồng phân nefopam khi có mặt dung môi hữu cơ. - Khi thêm methanol vào dung dịch điện ly nền sẽ kéo dài thời gian di chuyển của các đồng phân (khoảng 32 phút) và pic của các đồng phân bị kéo đuôi, đồng thời đường nền bị nhiễu nhiều. - Kết quả khảo sát cho thấy độ phân giải giữa các đồng phân được cải thiện khi có sự hiện diện của acetonitril, thời gian di chuyển của các đồng phân ngắn, đường nền ít bị nhiễu. Trị số RS tăng khi nồng độ acetonitril tăng từ 0% đến 25%, nhưng nếu tiếp tục tăng quá 25% thì hiệu quả tách sẽ bắt đầu giảm. Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ acetonitril lên độ phân giải của đồng phân nefopam Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ tác nhân quang hoạt 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 5 10 15 20 25 30 35 Nồng độ acetonitril (%) Đ ộ p h ân g iả i R-và S-nefopam 59 Bảng 3.15. Ảnh hưởng nồng độ các tác nhân quang hoạt lên độ phân giải của đồng phân nefopam Nồng độ MeCN (%) Nồng độ tác nhân (mM) β-CD HP-β-CD HB-β-CD tM (phút) RS tM (phút) RS tM (phút) RS Pic 1 Pic 2 Pic 1 Pic 2 Pic 1 Pic 2 25 10 10,76 11,02 1,68 11,97 12,27 1,64 10,75 10,90 0,81 15 11,45 11,78 1,84 20 12,16 12,42 2,42 13,82 14,27 2,21 12,39 12,56 1,37 30 14,92 15,45 3,14 12,26 12,49 1,83 Kết quả khảo sát cho thấy cả 3 tác nhân quang hoạt β-CD, HP-β-CD và HB-β- CD đều có tác dụng chọn lọc trên đồng phân nefopam. 3.4.1.3. Amlodipin besilat Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền Trong điều kiện pH của dung dịch TRIS-phosphat 50 mM có chứa 5 mM HP-β- CD thay đổi từ 2,5 - 5,5 thì đồng phân amlodipin sẽ có độ phân giải cao nhất tại pH 2,5 Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền lên độ phân giải của đồng phân amlodipin Khảo sát nồng độ của dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 1 2 3 4 5 6 7 pH dung dịch điện ly nền Đ ộ ph ân g iả i R-và S-amlodipin 60 Trong điều kiện pH 2,5 với 5 mM HP-β-CD thì độ phân giải của đồng phân amlodipin sẽ tăng khi nồng độ TRIS-phosphat tăng từ 25 mM đến 50 mM, nhưng sau đó nếu tiếp tục tăng đến 75 mM thì độ phân giải cũng tăng không đáng kể. Với nồng độ 50 mM TRIS-phosphat thì hai đồng phân amlodipin đã tách hoàn toàn, thể hiện bằng trị số Rs = 1,78. Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ TRIS lên độ phân giải của đồng phân amlodipin Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tác nhân HP-β-CD Khi nồng độ HP-β-CD của dung dịch TRIS-phosphat pH 2,5 tăng thì độ phân giải và thời gian di chuyển của các đồng phân tăng. Thời gian di chuyển tăng rõ rệt ở nồng độ HP-β-CD từ 10 mM đến 20 mM. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 5 10 20 Nồng độ dung dịch HP beta-CD (mM) Đ ộ ph ân g iả i S- và R-amlodipin 15 20 25 30 5 10 20 Nồng độ dung dịch HP beta-CD (mM) T h ờ i g ia n d i c h u yể n (p hú t) Pic đồng phân 1 Pic đồng phân 2 Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ HP-β-CD lên độ phân giải và thời gian di chuyển của đồng phân amlodipin Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ HB-β-CD 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 25 50 75 Nồng độ dung dịch điện ly nền Đ ộ ph ân g iả i R-và S-amlodipin R 61 Khi nồng độ HB-β-CD tăng từ 3 mM đến 10 mM thì độ phân giải và thời gian di chuyển của các đồng phân cũng sẽ tăng. Nồng độ 5 mM HB-β-CD là nồng độä có thể cho trị số RS và thời gian phân tích phù hợp. Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ HB-β-CD lên độ phân giải và thời gian di chuyển của đồng phân amlodipin Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân β-CD Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ β-CD lên độ phân giải của đồng phân amlodipin. Kết quả cho thấy ở điều kiện dung dịch điện ly nền 50 mM TRIS- phosphat pH 2,5 có nồng độ β-CD từ 3 mM - 20 mM thì hỗn hợp racemic amlodipin besilat vẫn không tách. Hình 3.20. Điện di đồ tách đồng phân amlodipin bằng các tác nhân quang hoạt khác nhau 21 ,9 84 21 ,2 54 0 1 2 3 4 5 0 5 10 15 Nồng độ HB-beta-CD (mM) Đ ộ p h â n g iả i R-và S-amlodipin R 15 20 25 30 0 5 10 15 Nồng độ HB-beta-CD (mM) Th ờ i g ia n di c hu yể n (p hú t) Pic đồng phân 1 Pic đồng phân 2 21 ,6 61 21 ,1 35 10 mM HP-β-CD 5 mM HB-β-CD 20 mMβ-CD 62 Như vậy, chỉ có hai dẫn chất HP-β-CD và HB-β-CD có độ chọn lọc trên đồng phân amlodipin. 3.4.1.4. Ofloxacin Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH lên độ phân giải của đồng phân ofloxacin Kết quả khảo sát khả năng tách đồng phân trong hỗn hợp racemic của ofloxacin của dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat 50 mM có chứa 10 mM HB-β-CD với pH thay đổi trong khoảng từ 2,5 đến 5,0 cho thấy pH càng tăng thì thời gian di chuyển và độ phân giải sẽ càng giảm. Tại giá trị pH 5,5 thì độ phân giải bằng 0 và RS có giá trị cao nhất tại pH 2,5. Hình 3.22. Điện di đồ của đồng phân ofloxacin ở các pH khác nhau : (a) pH 5,5; (b) pH 4,5 ; (c) pH 3,5 ; (d) pH 2,5. 1 6, 61 8 1 6, 86 0 1 5, 38 3 15 ,5 8 1 3, 99 5 1 2, 99 9 a b c d 1 3, 86 5 0 0.5 1 1.5 2 2 3 4 5 6 pH dung dịch điện ly nền Đ ộ p h ân g iả i R-và S-ofloxacin 63 Khảo sát nồng độ của dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat Khảo sát khả năng ảnh hưởng của nồng độ TRIS trong dung dịch đệm pH 2,5 có 10 mM HB-β-CD. Hình 3.23. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ TRIS lên độ phân giải của đồng phân ofloxacin Kết quả khảo sát cho thấy khi nồng độ dung dịch TRIS-phosphat tăng từ 25 mM đến 75 mM thì độ phân giải sẽ tăng. Khi nồng độ TRIS-phosphat tăng đến 75 mM thì độ phân giải thay đổi rất ít nhưng lúc đó cường độ dòng sẽ tăng cao (89 µA) và thời gian di chuyển của các đồng phân cũng tăng. Do đó nồng độ TRIS- phosphat 50 mM là nồng độ thích hợp được chọn Khảo sát nồng độ của β-CD, HB-β-CD và HP-β-CD Khảo sát khả năng tách của đồng phân ofloxacin trong dung dịch điện ly nền 50 mM TRIS-phosphat pH 2,5 khi nồng độ tác nhân β-CD, HB-β-CD và HP-β-CD thay đổi từ 5 mM đến 30 mM. Kết quả cho thấy nồng độ các tác nhân càng tăng thì khả năng tách càng tốt. Ở nồng độ 30 mM, cảø hai tác nhân HB-β-CD và HP-β-CD đều cho khả năng tách tốt nhất thể hiện qua độ phân giải RS = 2,56. Đối với tác nhân β-CD thì không có độ chọn lọc trên đồng phân của ofloxacin. 0 0.5 1 1.5 2 0 20 40 60 80 Nồng độ dung dịch điện ly nền (mM) Đ ộ p h ân g iả i R-và S-ofloxacin 64 Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn khả năng tách đồng phân ofloxacin với các nồng độ của các tác nhân quang hoạt HB-β-CD và HP-β-CD Như vậy chỉ có dẫn chất HP-β-CD và HB-β-CD có tác dụng chọn lọc trên đồng phân ofloxacin. 3.4.1.5. Propranolol hydroclorid Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền Khảo sát sự thay đổi hiệu quả tách khi pH của dung dịch điện ly nền TRIS- phosphat 50 mM có 10 mM HB-β-CD thay đổi từ 2,5 đến 5,5. Hình 3.25. Đồ thị và điện di đồ biểu diễn ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền lên độ phân giải của đồng phân propranolol: (a) pH 5,5; (b) pH 4,5 ; (c) pH 3,5 ; (d) pH 2,5 d b c a 17 ,8 64 18 ,1 22 11 ,5 80 11 ,4 79 15 ,6 80 15 ,4 99 6, 43 9 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 10 20 30 40 Nồng độ tác nhân (mM) Đ ộ ph ân g iả i R-và S-ofloxacin (HB-beta-CD) R-và S-ofloxacin (HP-beta-CD) 0 0.5 1 1.5 2 1 2 3 4 5 6 pH dung dịch điện ly nền Đ ộ p h ân g iả i R-và S-propranolol R 65 Khi pH của dung dịch điện ly nền tăng dần từ 2,5 đến 5,5 thì thời gian di chuyển của các đồng phân sẽ giảm và độ phân giải cũng giảm dần. Tại giá trị pH 2,5 độ phân giải giữa hai pic đồng phân đạt giá trị cao nhất. Khảo sát nồng độ của dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat Hình 3.26. Đồ thị và điện di đồ biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ TRIS lên độ phân giải của đồng phân propranolol Khi tăng nồng độ TRIS từ 25 mM đến 50 mM của dung dịch điện ly nền pH 2,5 có chứa 10 mM HB-β-CD, thì độ phân giải giữa các đồng phân sẽ tăng lên, nhưng nếu tiếp tục tăng lên 75 mM thì độ phân giải không được cải thiện mà còn giảm xuống rõ rệt và thời gian di chuyển của các đồng phân tăng. Khảo sát nồng độ của tác nhân quang hoạt Khảo sát nồng độ của HB-β-CD Khảo sát dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat 50 mM pH 2,5 với nồng độ tác nhân thay đổi từ 10 mM - 30 mM. Kết quả cho thấy, khi nồng độ tác nhân càng tăng thì thời gian dịch chuyển của chất phân tích càng dài và độ phân giải giữa hai pic đồng phân cũng thay đổi. Ở nồng độ 10 mM, thời gian dịch chuyển tương đối ngắn nhưng độ phân giải kém (RS = 0,98), ở nồng độ 30 mM thời gian dịch chuyển quá dài (34 phút) và độ phân giải cũng thấp (RS = 0,84). Do đó trong 0 0.5 1 1.5 2 0 20 40 60 80 Nồng độ dung dịch điện ly nền (mM) Đ ộ p h ân g iả i R-và S-propranolol R 2 9, 76 9 2 9, 40 8 1 8, 12 2 17 ,8 64 1 7, 63 8 17 ,9 92 25 mM (RS= 0,83) 75 mM (RS= 0,92) 50mM (RS= 0,98) 66 khoảng khảo sát, nồng độ 20 mM là thích hợp, tuy độ phân giải vẫn chưa đạt (RS < 1,5) nhưng có thể cải thiện độ phân giải bằng cách thêm dung môi hữu cơ là methanol vào dung dịch điện ly nền. Hình 3.27. Điện di đồ của đồng phân propranolol với sự thay đổi nồng độ tác nhân quang hoạt HB-β-CD Khảo sát nồng độ dung môi hữu cơ thêm vào dung dịch điện ly nền Hình 3.28. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ methanol lên độ phân giải của đồng phân propranolol Khi nồng độ methanol tăng từ 5% đến 20% thì độ phân giải và thời gian di chuyển của các đồng phân càng tăng. Ở nồng độ 20% hai đồng phân tách nhau hoàn toàn thể hiện qua trị số độ phân giải lớn hơn 1,5. Nếu tăng nồng độ methanol lên 25% thì độ phân giải sẽ giảm xuống. 17 ,8 64 34 ,4 03 26 ,2 43 10 mM 20 mM 30 mM 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 10 20 30 Nồng độ methanol (%) Đ ộ ph ân g iả i R-và S-propranolol 67 Khảo sát nồng độ của HP-β-CD Khảo sát khả năng tách của đồng phân propranolol khi nồng độ tác nhân HP-β- CD trong dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat 50 mM; pH 2,5; 20% methanol thay đổi từ 10 mM - 30 mM. Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ HP-β-CD lên độ phân giải của đồng phân propranolol Kết quả khảo sát cho thấy đối với tác nhân HP-β-CD, ở nồng độ 30 mM sẽ cho độ phân giải cao nhất. Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân β-CD Kết quả khảo sát cho thấy đồng phân propranolol không thể tách được bằng tác nhân quang hoạt β-CD. Hình 3.30. Điện di đồ của đồng phân propranolol với các tác nhân quang hoạt khác nhau 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 10 20 30 40 Nồng độ dung dịch HP beta-CD (mM) Đ ộ p h ân g iả i S-và R-propranolol 37 ,9 82 38 ,5 64 25 ,1 46 38 ,8 20 38 ,1 72 20 mM β-CD 30 mM HP-β-CD 20 mM HB-β-CD 68 Như vậy chỉ có hai dẫn chất HP-β-CD và HB-β-CD có tính chọn lọc trên đồng phân propranolol. 3.4.1.6. Promethazin Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền Hình 3.31. Ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền lên độ phân giải của đồng phân promethazin: (a) pH 2,5; (b) pH 3,0; (c) pH 4,0; (d) pH 5,0 Kết quả khảo sát khả năng tách đồng phân của promethazin trong điều kiện pH của dung dịch TRIS-phosphat 50 mM có chứa 20% methanol và 10 mM HB-β- CD; thay đổi từ 2,5 đến 5,0 cho thấy khi pH dung dịch điện ly nền càng tăng thì thời gian di chuyển của các đồng phân càng ngắn và độ phân giải giữa các pic càng kém. Ở giá trị pH 2,5 thì độ phân giải của đồng phân promethazin cao nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi hữu cơ Acetonitril, methanol, 2-propanol được thêm vào dung dịch điện ly nền để cải thiện khả năng tách. Kết quả khảo sát cho thấy methanol là dung môi thích hợp để cải thiện độ phân giải của đồng phân promethazin. Khi thêm methanol vào dung dịch TRIS-phosphat nồng độ 50 mM pH 2,5 và 10 mM HB-β-CD, độ phân giải sẽ tăng dần khi nồng độ methanol tăng từ 0% đến 20%, nhưng ở nồng độ 25% methanol thì hiệu quả tách bắt đầu giảm. 17 ,6 83 a 18 ,1 15 16 ,7 83 16 ,9 13 26 ,3 80 1 9, 27 6 18 ,9 93 26 ,0 26 b c d 0 0.5 1 1.5 2 1 2 3 4 5 6 pH dung dịch điện ly nền Đ ộ p h ân g iả i R-và S-promethazin 69 Hình 3.32. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ methanol lên khả năng phân giải của đồng phân promethazin Khảo sát nồng độ của β-CD, HB-β-CD và HP-β-CD Với tác nhân HB-β-CD Khi nồng độ tác nhân HB-β-CD trong dung dịch 50 mM TRIS-phosphat pH 2,5 có 20% methanol tăng từ 10 mM đến 30 mM thì độ phân giải sẽ tăng. Hình 3.33. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tác nhân quang hoạt HB-β-CD lên độ phân giải của đồng phân promethazin Ảnh hưởng nồng độ của dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat lên độ phân giải đồng phân. 0 0.5 1 1.5 2 0 10 20 30 Nồng độ MeOH trong dung dịch BGE (%) Đ ơ p h ân g iả i R-và S-promethazin 0 0.5 1 1.5 2 5 15 25 35 Nồng độ dung dịch HB-beta-CD (mM) Đ ộ ph ân g iả i R-và S-promethazin R 70 Khi nồng độ TRIS - phosphat pH 2,5 có 30 mM HB-β-CD và 20% MeOH tăng từ 25 mM đến 100 mM thì độ phân giải của đồng phân promethazin cũng tăng. Ở nồng độ từ 50 mM đến 100 mM thì trị số RS > 1,5 Hình 3.34. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ dung dịch điện ly nền lên độ phân giải của đồng phân promethazin Với tác nhân HP-β-CD Khi nồng độ tác nhân HP-β-CD trong dung dịch 100 mM TRIS-phosphat pH 2,5; 20% methanol thay đổi từ 25 mM đến 35 mM thì khả năng phân giải của đồng phân promethazin cũng sẽ thay đổi. Khi nồng độ tăng đến 35 mM thì độ phân giải giữa các đồng phân cũng chỉ đạt 0,7 và thời gian di chuyển khoảng 27,837 - 28,059 phút. Do đó, nếu tăng thêm nồng độ HP-β-CD thì phải giảm điện thế do cường độ dòng điện quá cao và nhiễu đường nền lớn. Tuy nhiên Rs vẫn đạt trị số dưới 1,5. Hình 3.35. Điện di đồ của đồng phân promethazin với sự thay đổi nồng độ tác nhân quang hoạt HP-β-CD (a) 25 mM, (b) 30 mM, (c) 35 mM 0 0.5 1 1.5 2 0 50 100 Nồng dộ dung dịch điện ly nền (mM) Đ ộ ph ân g iả i R-và S-promethazin 22 ,1 59 22 ,3 82 25 ,3 10 25 ,4 43 28 ,0 59 27 ,8 37 25 mM (Rs = 0,26) 30 mM (Rs = 0,67) 35 mM (Rs =0,71) 71 Vậy tác nhân HP-β-CD không thích hợp để tách đồng phân promethazin. Với tác nhân β-CD Với sự hiện diện của 30 mM β-CD trong dung dịch 100 mM TRIS-phosphat pH 2,5; 20% methanol thì đồng phân trong hỗn hợp racemic của promethazin vẫn không tách. Hình 3.36. Điện di đồ tách đồng phân promethazin với các tác nhân quang hoạt khác nhau: 30 mM β-CD, 30 mM HP-β-CD, 30 mM HB-β-CD Như vậy, chỉ có tác nhân quang hoạt HB-β-CD là thích hợp để tách đồng phân promethazin . 3.4.1.7. Ketoconazol Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền Hình 3.37. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH dung dịch điện ly nền lên độ phân giải của đồng phân ketoconazol 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 2 3 4 5 6 7 pH dung dịch điện ly nền Đ ộ ph ân g iả i R-và S-ketoconazol 27 ,4 36 28 ,6 34 25 ,3 10 25 ,4 43 2 9, 05 8 β-CD HP-β-CD HB-β-CD 72 Khi giá trị pH của dung dịch TRIS-phosphat 50 mM có chứa 15 mM HB-β-CD thay đổi từ 2,5 - 6,0 thì thời gian di chuyển của các pic đồng phân càng ngắn và độ phân giải giữa các pic càng kém. Ở giá trị pH 3,0 thì hai đồng phân của ketoconazol tách hoàn toàn. Khảo sát nồng độ của dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat Hình 3.38. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ TRIS lên độ phân giải của đồng phân ketoconazol Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch TRIS pH 3,0 có thêm 15 mM HB-β- CD lên độ phân giải của đồng phân ketoconazol cho thấy khi tăng nồng độ dung dịch TRIS-phosphat từ 25 mM đến 50 mM thì độ phân giải sẽ tăng lên, nhưng nếu tiếp tục tăng lên 75 mM thì độ phân giải tăng không đáng kể. Khảo sát nồng độ của HB-β-CD, HP-β-CD và β-CD Khảo sát khả năng tách đồng phân ketoconazol trong điều kiện pH 3,0 của dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat 50 mM và thay đổi nồng độ tác nhân quang hoạt Với tác nhân HB-β-CD Khi nồng độ thay đổi từ 5 mM - 15 mM thì độ phân giải giữa các đồng phân sẽ tăng dần, nhưng đến nồng độ 20 mM thì độ phân giải giảm. Với tác nhân HP-β-CD Khi nồng độ HP-β-CD tăng từ 15 mM - 25 mM thì độ phân giải giữa hai đồng phân cũng tăng. Nhưng đến nồng độ 25 mM thì độ phân giải chỉ đạt 1,1; thời 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 20 40 60 80 Nồng độ dung dịch điện ly nền (mM) Độ p hâ n gi ải R-và S-ketoconazol R 73 gian di chuyển tương đối dài (khoảng 38 phút) và cường độ dòng điện quá cao (> 100 µA). Hình 3.39. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ HP-β-CD và HB-β-CD lên độ phân giải của đồng phân ketoconazol Với tác nhân β-CD Hình 3.40. Điện di đồ tách đồng phân ketoconazol với các tác nhân quang hoạt β-CD, HP-β-CD, HB-β-CD ở nồng độ 15 mM Kết quả khảo sát cho thấy tác nhân β-CD không có tính chọn lọc trên đồng phân ketoconazol. Như vậy, trong ba tác nhân β-CD, HP-β-CD, HB-β-CD chỉ có tác nhân HB-β-CD có độ chọn lọc trên đồng phân ketoconazol. 3.4.2. Đánh giá quy trình phân tích đồng phân của một số chất quang hoạt Điều kiện điện di thích hợp để phân tích đồng phân của một số chất quang hoạt: Điều kiện cố định + Cột silica nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài tổng cộng 63,5 cm và chiều dài hiệu quả 54 cm. 20 ,8 51 21 ,3 51 36 ,6 75 37 ,2 66 β-CD 18 ,9 14 HB-β-CD HP-β-CD 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 5 10 15 20 25 Nồng độ dung dịch HB-beta-CD (mM) Đ ộ ph ân g iả i R-và S-ketoconazol 0 0.5 1 1.5 2 10 15 20 25 30 Nồng độ dung dịch HP-beta-CD (mM) Đ ộ ph ân g iả i R-và S-ketoconazol 74 + Điện thế: 20 kV. + Nhiệt độ mao quản: 25 oC. + Phương pháp tiêm: 50 mbar x 5 giây. + Bước sóng phát hiện: bước sóng hấp thụ cực đại của mỗi hoạt chất. Điều kiện khảo sát Điều kiện dung dịch điện ly nền và nồng độ tác nhân quang hoạt để phân tích đồng phân của một số chất quang hoạt được trình bày ở bảng 3.16. Bảng 3.16. Điều kiện dung dịch điện ly nền và nồng độ tác nhân quang hoạt của các quy trình phân tích đồng phân Hoạt chất BGE Tác nhân quang hoạt TRIS (mM) pH DMHC (%) β-CD (mM) HP-β-CD (mM) HB-β-CD (mM) AcCN MeOH MIC 50 2,5 2 2 2 NEF 50 2,5 25 30 30 20 AML 50 2,5 10 5 OFL 50 2,5 30 30 PRL 50 2,5 20 30 20 PRM 100 2,5 20 30 KET 50 3,0 15 75 3.4.2.1. Tính phù hợp của hệ thống Bảng 3.17a. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của các quy trình phân tích Hoạt chất Mẫu Pic β-CD HP-β-CD HB-β-CD RSD (%) AS RS RSD (%) AS RS RSD (%) AS RS Corr Area tM Corr Area tM Corr Area tM MIC Chuẩn Pic 1 0,59 1,62 1,1 2,30 0,10 1,11 1,1 2,52 0,48 1,33 0,9 2,49 Pic 2 0,69 1,88 1,1 0,14 1,10 1,1 0,16 1,81 0,9 Thử Pic 1 0,31 1,68 0,9 2,27 0,12 1,05 1,0 2,47 0,49 1,64 0,9 2,47 Pic 2 0,55 1,63 0,9 0,13 1,08 1,1 0,31 1,56 0,9 NEF Chuẩn Pic 1 1,92 1,00 1,1 2,60 1,50 0,50 1,1 3,20 1,57 1,02 0,9 1,85 Pic 2 0,90 0,86 1,1 1,34 0,53 1,1 1,90 1,06 1,0 Thử Pic 1 1,30 0,54 1,0 2,51 1,51 0,48 0,9 3,10 0,78 0,75 0,9 2,00 Pic 2 1,44 0,46 1,0 1,86 0,36 1,1 0,69 0,54 0,9 Bảng 3.17b. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của các quy trình phân tích Hoạt chất Mẫu Pic HB-β-CD RSD (%) AS RS Corr Area tM PRM Chuẩn Pic 1 0,81 1,26 1,2 1,75 Pic 2 0,69 1,05 1,2 Thử Pic 1 0,96 1,31 1,1 1,79 Pic 2 1,03 1,12 1,1 KET Chuẩn Pic 1 0,36 0,31 1,0 2,67 Pic 2 0,32 0,32 1,1 Thử Pic 1 0,13 0,31 1,1 2,78 Pic 2 0,20 0,30 1,1 76 Bảng 3.17c. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của các quy trình phân tích Hoạt chất Mẫu Pic HP-β-CD HB-β-CD RSD (%) AS RS RSD (%) AS RS Corr Area tM Corr Area tM AML Chuẩn Pic 1 0,89 1,72 1,1 2,28 0,42 0,75 1,0 2,82 Pic 2 0,80 1,73 1,1 0,60 0,78 1,0 Thử Pic 1 0,83 1,64 1,1 2,33 0,45 0,80 1,1 2,76 Pic 2 0,96 1,63 1,1 0,89 0,83 1,1 OFL Chuẩn Pic 1 0,45 0,18 1,1 2,57 0,49 0,40 1,1 2,55 Pic 2 0,30 0,19 1,09 0,39 0,42 1,1 Thử Pic 1 0,19 0,88 1,1 2,54 0,43 1,02 1,2 2,56 Pic 2 0,16 0,87 1,1 0,30 1,03 1,2 PRL Chuẩn Pic 1 0,24 0,86 1,1 1,73