Luận án Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co - 60 để chế tạo β - glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia

Saccharomyces như protein và những hợp chất khác dễ bị thủy phân bởi kiềm. Chitin trong môi trường kiềm c ng sẽ bị đề acetyl hóa thành chitosan tạo điều kiện loại bỏ chúng dễ dàng trong bước xử lý với axít tiếp theo sau nên nồng độ NaOH càng cao thì khả năng thủy phân các hợp chất này càng mạnh. Ngoài ra, β-glucan với liên kết glycoside chỉ tương đối bền với kiềm ở nồng độ thấp nên khi xử lý với kiềm ở nồng độ cao thì mạch polysaccharide của β-glucan c ng bị thủy phân một phần nào đó. Ở nghiệm thức xử lý NaOH với nồng độ 4%, hiệu suất tách chiết β-glucan giảm mạnh so với nghiệm thức xử lý NaOH với nồng độ 2% (giảm 1,32%). Trong khi đó, nghiệm thức xử lý NaOH với nồng độ 3%, hiệu suất tách chiết β-glucan có giảm nhưng không đáng kể so với nghiệm thức xử lý NaOH với nồng độ 2%. Kết quả từ bảng 3.2 c ng cho thấy ở nghiệm thức xử lý NaOH với nồng độ 1 và 2%, tuy hiệu suất β-glucan thu được là cao nhưng hàm lượng protein còn tồn lại trong sản phẩm vẫn còn cao (trên 2%) và độ tinh khiết sản phẩm còn thấp (85,11%). 54 Trong khi đó, ở nghiệm thức xử lý NaOH với nồng độ 4%, sản phẩm β-glucan thu được có chứa hàm lượng protein thấp (1,73%) và độ tinh khiết sản phẩm cao 91,99%) nhưng hiệu suất thu được giảm mạnh so với nghiệm thức xử lý NaOH nồng độ 2%. Trong khi nghiệm thức xử lý NaOH nồng độ 3% thì hiệu suất tách chiết β-glucan có giảm nhưng không đáng kể so với nghiệm thức xử lý NaOH với nồng độ 2% (giảm 0,59%), nhưng hàm lượng protein trong sản phẩm β-glucan lại khá thấp (~1,75%) và độ tinh khiết sản phẩm là khá cao (91,13%). Kết quả này cho thấy để quy trình tách chiết β-glucan vừa đạt hiệu suất cao vừa có hàm lượng protein thấp, độ tinh khiết sản phẩm cao và tiết kiệm hóa chất, dung dịch NaOH với nồng độ 3% được lựa chọn như nồng độ tối ưu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình tách chiết β-glucan từ bã men bia. 3.1.3.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết Thời gian phản ứng c ng là nhân tố quan trọng trong phản ứng chiết β- glucan trong thành tế bào nấm men bởi lẽ cả protein và β-glucan đều bị thủy phân bởi kiềm, tuy nhiên β-glucan thường bền với kiềm hơn so với protein. Do đó lựa chọn thời gian thích hợp để tại thời điểm đó hàm lượng protein bị thủy phân là cao nhất và mạch polymer của β-glucan bị thủy phân ít là điều rất cần thiết trong quá trình tách chiết β-glucan. Trong thí nghiệm này thời gian chiết được khảo sát ở 3, 6, 9 và 12 giờ. Kết quả bảng 3.3 cho thấy, hiệu suất thu nhận β-glucan giảm dần theo thời gian phản ứng. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan Thời gian chiết (giờ) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hàm lƣợng protein (%) 3 17,97 ± 0,30 84,96 1,93 6 17,12 ± 0,30 86,15 1,49 9 16,13 ± 0,11 91,52 1,41 12 14,97 ± 0,10 92,08 1,34 Khi tiến hành chiết trong 3 - 12 giờ thì hiệu suất tách chiết giảm 3%, trong đó ở 3 nghiệm thức 3, và 6 giờ hiệu suất thu được không thay đổi nhiều. Nhưng ở 55 nghiệm thức 9 giờ và 12 giờ thì hiệu suất thu được giảm đi đáng kể. Điều này có thể là do trong thời gian đầu từ 3-6 giờ, NaOH chỉ tác dụng đối với protein, nhưng khi đun với thời gian lâu hơn từ 9-12 giờ, liên kết glycoside bị kiềm phá hủy dần nên mạch polymer của β-glucan c ng bị thủy phân một phần. Ngoài ra, hàm lượng protein còn lại trong β-glucan khi tách chiết trong thời gian từ 3 - 12 giờ đều dưới 2%. Tuy nhiên, độ tinh khiết của sản phẩm được xử lý 9-12 giờ là khá cao. Kết quả này cho thấy thời gian tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men trong 9 giờ là hiệu quả nhất để thu được sản phẩm β-glucan có độ tinh sạch cao. 3.1.3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi Bảng 3.4.Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi thủy phân đến hiệu suất thu nhận β- glucan Tỉ lệ mẫu/dung môi (g/mL) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hàm lƣợng protein (%) 1/3 17,42 ± 0,14 85,19 1,90 1/5 16,13 ± 0,11 92,01 1,41 1/7 16,15 ± 0,08 92,98 1,34 Do tỉ lệ mẫu/dung môi c ng là yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả của quy trình chiết β-glucan, do đó trong thí ngiệm này, sự thay đổi tỉ lệ mẫu/dung môi lần lượt là 1/3, 1/5 và 1/7 (g/mL) được khảo sát trong quá trình tách chiết β-glucan nhằm lựa chọn tỉ lệ chiết tối ưu để hiệu suất tách chiết hiệu quả đồng thời tiết kiệm nguyên liệu. Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy hiệu suất thu nhận sản phẩm β-glucan giảm dần khi tỉ lệ chiết tăng dần, dao động từ 16,13 đến 17,42%. Hàm lượng β- glucan thu được khi xử lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/3 cao hơn khi xử lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/5 và 1/7. Điều này có thể giải thích rằng khi tỉ lệ chiết tăng, khả năng tiếp xúc của các thành phần có trong thành tế bào (protein, chitin, mannan) với NaOH nhiều hơn, nên NaOH dễ dàng tác dụng lên chúng. Tại nghiệm thức xử lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/7, hàm lượng sản phẩm β-glucan thu được là tương đương với nghiệm thức xử lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/5 (khoảng 16%). Kết quả c ng ghi nhận hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm β-glucan thu được khi xử lý mẫu ở các tỉ lệ đều dưới 56 2% nhưng độ tinh khiết sản phẩm khi xử lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/5 và 1/7 là cao hơn. Tuy nhiên, để tiết kiệm dung môi tách chiết đồng thời giảm tác động đối với môi trường thì tỷ lệ 1/5 được xem là tối ưu. Do đó tỉ lệ chiết mẫu/dung môi là 1/5 được sử dụng để hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan. Bên cạnh đó, một số nhóm nghiên cứu như Suphantharika, Lý Thị Minh Hiền và Phạm Việt Cường c ng đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ NaOH sử dụng, thời gian chiết và tỉ lệ mẫu/dung môi đến hiệu suất tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bia [3, 26, 30]. Tuy nhiên, các nhóm này chủ yếu đánh giá hàm lượng polysaccharide tổng mà chưa có những đánh giá chính xác về hàm lượng β-glucan như trong nghiên cứu này. Hơn thế nữa, các kết quả đạt được trong nghiên cứu này cho thấy β-glucan thu được có độ tinh khiết (~92%) cao hơn hẳn so với các nghiên cứu kể trên (~51-85%) [3, 26, 81]. 3.1.3.5. Hoàn thiện quy trình chế tạo sản phẩm β-glucan từ bã nấm men bia a. Tách chiết sản phẩm β-glucan từ bã nấm men bia quy mô lớn (500 lít/mẻ) Bảng 3.5. Hiệu suất tách chiết sản phẩm β-glucan từ bã men bia ở quy mô 500 lít/mẻ Lần tách chiết Thể tích dịch bã nấm men bia (lít) Khối lƣợng khô tế bào nấm men (kg) Hàm lƣợng khô thành tế bào nấm men (kg) Hàm lƣợng sản phẩm β- glucan thu đƣợc (kg) Hiệu suất (%) 1 500 15,89 4,44 0,7122 16,02 2 500 16,10 4,35 0,7285 16,76 3 500 16,51 4,77 0,7411 15,53 TB 500 16,17 ± 0,32 4,521 ± 0,22 0,7273 ± 0,01 16,11 ± 0,62 Từ kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu ở giai đoạn chiết kiềm đã có, quy trình tách chiết mẫu β-glucan được hoàn thiện và chế tạo thử nghiệm với số lượng mẫu lớn hơn. Kết quả thu nhận được từ 3 mẻ khác nhau từ 500 lít dịch bã thải nấm men bia của nhà máy bia Sài Gòn Bình Dương ở điều kiện tối ưu (nồng độ NaOH 3%, thời gian chiết 9 giờ, nhiệt độ thủy phân thành tế bào nấm men là 90oC và tỉ lệ 57 mẫu/dung môi là 1/5) ở bảng 3.5 cho thấy tổng lượng sản phẩm β-glucan thu được là 2,18 kg từ 13,56 kg thành tế bào nấm men. Như vậy quy trình này có hiệu suất tạo sản phẩm β-glucan từ thành tế bào nấm men trung bình khoảng 16,1%. Sản phẩm β-glucan thu được có màu nâu nhạt trước khi sấy và nâu đậm sau khi sấy ở 60 oC như hình 3.3. Hình 3.3. Mẫu β-glucan sau khi tách chiết từ thành tế bào nấm men sau khi thu nhận (A), sau khi sấy khô ở 60oC (B) và ảnh SEM (C) b. Xác định hàm lượng β-glucan Bảng 3.6. Hàm lượng các loại glucan trong mẫu tách chiết Hàm lƣợng trong mẫu (%) Glucan tổng số α-glucan β-glucan 93,34 ± 0,41 1,56 ± 0,07 91,78 ± 0,34 A B C 58 Trong nghiên cứu này, hàm lượng β-glucan trong mẫu chế tạo được bằng phương pháp sử dụng bộ KIT xác định hàm lượng β(1-3,1-6)-glucan (K-YBGL) do Hãng Megazyme (Ai-len) cung cấp với các bước chính thực hiện theo hướng dẫn của Hãng và đo bằng phương pháp so màu trên máy UV-Vis. Kết quả phân tích từ bảng 3.6 cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm β-glucan thu nhận được từ quy trình là khoảng 91,78% β-glucan và có chứa một lượng nhỏ (khoảng 1,5%) α-glucan. c. Xác định đặc trưng cấu trúc mẫu β-glucan sau khi chế tạo Sản phẩm β-glucan tách chiết từ thành tế bào nấm men từ quy trình nói trên c ng được khảo sát đặc trưng cấu trúc bằng phổ hồng ngoại và so sánh với mẫu chuẩn cùng loại của Sigma. Kết quả từ hình 3.4 cho thấy các đỉnh chính xuất hiện trong dải từ 400 - 4000 cm-1 và được liệt kê ở bảng 3.7 cho thấy đỉnh xuất hiện ở 3333 cm -1 thuộc liên kết O-H xuất hiện với cường độ cao và có vai rộng, trong khi đỉnh xuất hiện ở 2896 cm-1 với cường độ trung bình và có vai hẹp cùng với đỉnh có cường độ yếu xuất hiện ở 2088 cm-1 điều thuộc liên kết C-H [41, 88]. Các đỉnh tại 1640 và 1079 cm -1 là đặc trưng của liên kết CO. Trong khi đó các đặc trưng của liên kết CCH, C-O-C và CC được biểu hiện ở các đỉnh tương ứng là 1371, 1156 và 1040. Có thể thấy mẫu β-glucan tách chiết được có đặc trưng cấu trúc khá tương đồng với mẫu β-glucan cùng loại do Sigma cung cấp. 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 A b s 1/cm Mẫu chuẩn của Sigma Mẫu tách chiết 3 3 8 3 2 8 9 6 1 6 4 0 8 9 0 1 0 4 0 1 0 7 9 11 5 6 1 3 7 1 59 Hình 3.4. Phổ FTIR của mẫu β-glucan tách chiết tách từ thành tế bào nấm men bia và mẫu β-glucan chuẩn của hãng Sigma 60 Bảng 3.7. Các đỉnh các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan TT Đỉnh (cm -1 ) Nhóm chức 1 3383 OH 2 2896 CH2 3 1640 CO 4 1371 CCH 5 1156 COC 6 1079 CO 7 1040 CC 8 890 CO của β-glucan d. Thiết lập sơ đồ quy trình tách chiết β-glucan từ bã men bia quy mô 500 lít mẻ Từ những kết quả nhận được trong quá trình thực nghiệm cho thấy có một số kết quả đáng chú ý như sau: - Bã thải nấm men bia của nhà máy bia Bia Sài Gòn Bình Dương có thể sử dụng để tách chiết thu nhận thành tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân. - Điều kiện thủy phân tối ưu thành tế bào nấm men bia để thu nhận β-glucan tổng số bao gồm: nhiệt độ thủy phân là 900C, nồng độ dung dịch NaOH là 3%, thời gian chiết là 9 giờ và tỉ lệ mẫu/dung môi là 1/5 (w/v) và hiệu suất tách chiết đạt ~16%. - Đã xác phân tích và xác định được hàm lượng β-glucan là thành phần chính trong mẫu chế tạo được và dao động trong khoảng 91,8%. - Đã đo phổ hồng ngoại (FTIR) cho thấy sự xuất hiện các đỉnh của các nhóm đặc trưng trong cấu trúc β-glucan và không có sự khác biệt so với mẫu chuẩn cùng dạng của Hãng Sigma. Từ những kết quả nói trên, quy trình tách chiết β-glucan từ bã thải nấm men bia được hoàn thiện như mô tả ở hình 3.5. 61 Hình 3.5. Sơ đồ khối quy trình tách chiết β-glucan từ dịch bã men bia quy mô 500 lít/mẻ Dịch bã nấm men bia Tế bào nấm men Thành tế bào nấm men β-glucan thô β-glucan bán thành phẩm β-glucan tinh chế dạng ƣớt 1 2 β-glucan thành phẩm Loại bỏ tạp chất Phá vỡ tế bào 3 4 5 6 Xử lý với NaOH Xử lý với HCl Chiết lipid Tạo thành phẩm và kiểm tra chất lượng Bƣớc 1: Loại bỏ tạp chất và thu nhận tế bào nấm men - Lọc qua ray có kích thước 0,5 mn để loại bỏ tạp chất rắn, - Ly tâm 5000 vòng phút và rửa với nước cất 3 lần. Bƣớc 2: Phá vỡ tế bào và thu nhận thành tế bào - Pha 15% trong nước cất và đun cách thủy ở 50 o C trong điều kiện khuấy 200 vòng/phút để tiến hành tự phân trong 20 giờ. - Hấp 121 o C trong 15 phút và ly tâm 5500 vòng/phút để thu nhận phần lắng, sau đó rửa với nước cất để thu nhận thành tế bào nấm men. Bƣớc 3: Chiết kiềm - Thành tế bào nấm men được hòa trong dung dịch NaOH 3% ở tỷ lệ 1/5 (w/v) và đun cách thủy ở 90 0 C trong 9 giờ, - Ly tâm 5500 vòng/phút để thu phần lắng, - Rửa phần lắng với nước cất và ly tâm 5500 vòng/phút để thu nhận β-glucan thô. Bƣớc 4: Chiết axít - β-glucan thô có nồng độ 15% (w/v) được chiết 3 lần trong dung dịch HCl ở các nồng độ lần lượt là 2,45; 1,75 và 0,94 M ở 75 0 C trong 2 giờ, - Ly tâm 7000 vòng/phút để thu nhận phần lắng, - Rửa với nước cất và ly tâm 7000 vòng/phút để thu nhận β-glucan bán thành phẩm. Bƣớc 5: Chiết lipid - Rửa β-glucan bán tinh khiết với cồn tuyệt đối (tỷ lệ mẫu là 15%, w/v) và ly tâm 7000 vòng/phút để thu phần lắng, - Tiếp tục ngâm rửa với diethyl ether (tỷ lệ mẫu là 15%, w/v) và ly tâm 8000 vòng/phút để thu nhận β- glucan tinh chế dạng ướt. Bƣớc 6: Sấy khô, nghiền nhỏ và kiểm tra chất lƣợng sản phẩm - β-glucan tinh khiết dạng thô được sấy khô ở 60 0 C, nghiền nhỏ và rây qua rây 0,5 mm để thu nhận ~0,7273 kg β-glucan thành phẩm, - Xác định hàm lượng β-glucan trong sản phẩm bằng KIT (K-YBGL), hàm lượng protein bằng phương pháp AOAC 987.04-1997, Mw bằng GPC, và đặc trưng cấu trúc bằng phổ FTIR. 62 3.2. Cắt mạch β-glucan bằng phƣơng pháp chiếu xạ 3.2.1. Xác định hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phương pháp chiếu xạ β- glucan β-glucan tách chiết từ tế bào nấm men là β-glucan hầu như không tan trong nước. Nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng axít đậm đặc hay enzyme để cắt mạch β- glucan nhằm tạo ra các sản phẩm β-glucan tan trong nước. Tuy nhiên, các phương pháp này có những hạn chế nhất định như hiệu quả cắt mạch không cao (khoảng 20%), tốn nhiều thời gian, đặc biệt là ảnh hưởng đến môi trường và khó kiểm soát quá trình cắt mạch, đồng thời giá thành sản phẩm cao do phải trải qua nhiều công đoạn tinh chế [31, 32]. Trong khi đó cắt mạch polysaccharide bằng phương pháp chiếu xạ đã được ứng dụng thành công đối với nhiều loại polysaccharide như pectin, alginate, chitosan, carrageenan [30, 34, 35, 80]. Kết quả cho thấy phương pháp này khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp cắt mạch thông thường bằng hóa học hay sinh học. Tuy nhiên cho đến nay có rất ít nghiên cứu cắt mạch β-glucan không tan trong nước bằng phương pháp bức xạ được công bố ở Việt Nam và trên thế giới. Trong đó,.các nhà khoa học Hàn Quốc [32] đã nghiên cứu chiếu xạ cắt mạch tạo β-glucan trọng lượng phân tử thấp từ β-glucan nấm men nhưng có độ tan nước là 50% và các nhà khoa học Thái Lan [41] c ng đã tiến hành chiếu xạ β-glucan tan nước tách chiết từ thành tế bào của một loại nấm đông trùng hạ thảo (Ophiocodyceps dipterigana) để chế tạo oligo-β-glucan. Ngoài ra, trong nước c ng có nhóm tác giả Nguyễn Ngọc Duy và ctv c ng đã nghiên cứu cắt mạch β-glucan bằng phương pháp bức xạ với hiệu quả rất tốt (thu được β-glucan có Mw~9 kDa). Tuy nhiên, nhóm tác giả này sử dụng β-glucan tan nước hoàn toàn (chế tạo bằng phương pháp hấp thuỷ nhiệt với H2O2) [44]. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu cắt mạch hỗn hợp huyền phù β- glucan không tan trong nước với nồng độ 10% trong nước bằng phương pháp chiếu xạ với dải liều 100 - 300 kGy. Sản phẩm sau khi chiếu xạ được tiến hành xác định hàm lượng β-glucan tan nước và sự thay đổi khối lượng phân tử ở các liều xạ khác nhau. Kết quả nhận được từ hình 3.6 cho thấy hàm lượng β-glucan tan thu được tăng tuyến tính theo sự gia tăng của liều xạ. β-glucan chưa chiếu xạ hầu như không 63 tan trong nước, sau khi chiếu xạ khả năng tan của β-glucan đã tăng lên đáng kể. Liều chiếu xạ càng cao thì hàm lượng β-glucan tan thu được càng tăng. Cụ thể là khi β-glucan chiếu xạ ở dạng hỗn hợp 10 liều 100 kGy có hàm lượng β-glucan tan thu nhận được là khoảng 25,8%. Trong khi đó, tại liều chiếu xạ 200 kGy, hàm lượng β-glucan tan nước tăng lên là 23,2% so với liều chiếu xạ 100 kGy, và khi gia tăng liều xạ lên 300 kGy thì hàm lượng β-glucan tan nước thu được là khoảng 66,7%. Điều này có thể được giải thích: dưới tác dụng của tia gamma liên kết glycoside bị bẻ gãy nên cấu trúc phân tử của β-glucan bị cắt thành những phân đoạn β-glucan có khối lượng phân tử nhỏ hơn từ đó dẫn đến tăng khả năng tan của β- glucan. Liều chiếu xạ cao đồng nghĩa với thời gian chiếu xạ lâu, nên tác động phá vỡ các liên kết glycoside của tia gamma lên phân tử β-glucan mạnh hơn, tạo ra nhiều phân đoạn β-glucan khối lượng phân tử nhỏ hơn. Chính vì thế khả năng tan của β-glucan tăng theo liều xạ. Hình 3.6. Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan 10% ở các liều xạ khác nhau Nhiều nghiên cứu trước đây khi cắt mạch cellulose và các dẫn xuất của nó đã cho thấy rằng khi chiếu xạ các polysaccharide bởi tia gamma Co-60 thì quá trình cắt mạch chủ yếu diễn ra tại liên kết glycoside [32, 39, 40, 89]. Hay nói cách khác, tia gamma chủ yếu làm đứt gãy các liên kết glycoside trong phân tử polysaccharide. Khi các phân đoạn của mạch β-glucan có chiều dài mạch nhỏ hơn thì tan được trong 64 nước. Liều chiếu xạ cao đồng nghĩa với thời gian chiếu xạ lâu, nên tác động phá vỡ các liên kết glycoside của tia gamma lên phân tử β-glucan mạnh hơn, tạo ra nhiều phân đoạn β-glucan khối lượng phân tử nhỏ hơn. Chính vì thế khả năng tan của β- glucan tăng theo liều xạ. Kết quả hình chụp bằng SEM của Byun và cs đã chứng minh điều này, hình dạng của β-glucan thay đổi theo liều xạ, mảnh β-glucan càng nhỏ khi liều chiều xạ càng cao [32]. 3.2.2. Sự suy giảm khối lượng phân tử Hình 3.7. Sự suy giảm Mw của β-glucan tan theo liều xạ Sự suy giảm khối Mw của β-glucan tan nước thu nhận được từ mẫu chứa 10% β-glucan ở các liều xạ khác nhau ở hình 3.7 cho thấy Mw của β-glucan tan nước giảm dần và tỷ lệ nghịch với sự gia tăng của liều xạ. Ở khoảng liều chiếu xạ 100 kGy thì Mw của β-glucan tan nước thu được giảm mạnh (từ trên 64 kDa xuống còn khoảng 31 kDa) và sau đó giảm chậm hơn và đạt khoảng 11 kDa ở liều xạ 300 kGy. Kết quả này có sự khác biệt so với kết quả đã công bố của Byun và ctv ở chỗ Mw của β-glucan trong công bố của tác giả này giảm rất nhanh trong khoảng liều chiếu là 50 kGy [32]. Tuy nhiên kết quả nhận được trong nghiên cứu này là hoàn toàn hợp lý do mẫu β-glucan sử dụng để chiếu xạ trong nghiên cứu này là mẫu hầu như không tan trong nước trong khi Byun và ctv đã sử dụng mẫu β-glucan có độ hòa tan trong nước là 50% vì thông thường khi mẫu có độ hoà tan cao thì sự cắt mạch trong quá trình chiếu xạ diễn ra nhanh hơn do các gốc tự do (chủ yếu là ●OH) 65 sẽ khuyếch tán nhanh hơn từ đó tấn công và cắt mạch các phân tử polysaccharide trong dung dịch (đồng pha) hiệu quả hơn so với khi chiếu xạ mẫu dạng huyền phù (dị pha) [32]. 3.2.3. Phân tích phổ UV Hình 3.8. β-glucan tan nước từ mẫu β-glucan 10% chiếu xạ ở các liều xạ khác nhau Nhiều kết quả đã công bố khi chiếu xạ mẫu polysaccharide như alginate, chitosan và pectin đã cho thấy phổ UV của các dung dịch sau khi chiếu xạ có sự xuất hiện đỉnh hấp thụ mới với cường độ tăng theo liều xạ là do sự hình thành của các oligosaccharide trong quá trình chiếu xạ [32, 39, 40, 89]. Trong nghiên cứu này các mẫu β-glucan tan nước chế tạo từ mẫu β-glucan 10% chiếu xạ ở các liều khác nhau c ng được đo phổ trên máy quang phổ UV-Vis. Có thể thấy khá rõ từ hình 3.8 rằng các dung dịch β-glucan tan thu được bằng phương pháp chiếu xạ có màu sắc thay đổi theo liều xạ từ nâu đến nâu đậm và liều càng cao thì màu càng sẫm. Điều này có thể là do các β-glucan tan ở các liều chiếu càng cao có trọng lượng phân tử càng nhỏ và do đó làm cho màu của dung dịch càng đậm hơn và kết quả này c ng tương tự với kết quả nghiên cứu trước đây trên đối với các polymer tự nhiên khác như alginate và chitosan [32, 90]. Thêm vào đó, kết quả nhận được từ hình 3.9 cho thấy rằng ở mẫu không chiếu xạ thì hoàn toàn không có sự xuất hiện đỉnh trong dải bước sóng từ 200 - 400 nm do chưa có β-glucan có Mw thấp trong dung dịch. Trong khi đó phổ của các mẫu β-glucan chiếu xạ đều xuất hiện đỉnh với đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng là 273 nm, đây là kết quả của quá trình cắt các liên kết glycoside giữa các phân tử 66 glucan để tạo thành các phân đoạn β-glucan Mw thấp. Các đỉnh hấp thụ có cường độ càng cao theo sự gia tăng của liều chiếu xạ chứng tỏ sự hiện diện của các phân đoạn có Mw thấp trong dung dịch càng nhiều. Điều đó cho thấy rằng ở liều xạ càng cao thì hiệu quả cắt mạch càng mạnh. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả đã công bố của của các tác giả khác khi tiến hành cắt mạch bức xạ các loại polysaccharide khác nhau [32, 39, 90]. Hình 3.9. Phổ UV-vis β-glucan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ 3.2.4. Phân tích phổ FTIR Phổ hồng ngoại (FTIR) đã được xem là phương pháp khá hiệu quả để phân tích đặc trưng c ng như sự thay đổi trong cấu trúc của các phân tử sinh học nói chung và polysaccharide nói riêng [37, 91]. Trong nghiên cứu này, kết quả nhận được ở hình 3.10 cho thấy đối với mẫu β-glucan khi chiếu xạ ở các liều xạ khác nhau thì hầu hết số lượng và vị trí đỉnh của các đỉnh đều không thay đổi so với mẫu không chiếu xạ. Tuy nhiên có sự xuất hiện đỉnh có số sóng đỉnh tại 1731 cm-1 với cường độ tăng dần theo liều xạ (mẫu đối chứng không chiếu xạ chỉ có vai rất yếu ở đỉnh có số sóng này) và đỉnh này được cho là biểu hiện của liên kết C=O trong phân tử β-glucan sau khi cắt mạch [32, 39, 90]. 67 Hình 3.10. Phổ IR của β-glucan chiếu xạ nồng độ 10% ở các liều xạ khác nhau Thêm vào đó, khi phân tích cường độ của đỉnh có tần suất đỉnh là 1156 cm-1 là biểu hiện của nhóm C-O-C của liên kết glucoside trong phân tử β-glucan của các mẫu chiếu xạ cho thầy có dấu hiệu giảm giảm dần theo liều xạ. Hình 3.11. Sự thay đổi tỷ lệ cường độ đỉnh C-O-C (1156 cm-1)/cường độ đỉnh C-C (1040 cm -1 ) của trong phổ của mẫu β-glucan theo liều xạ Nếu so sánh vị trí đỉnh này so với vị trí đỉnh biểu hiện cho liên kết C-C trong phân tử vốn được xem là bền với bức xạ có đỉnh tại số sóng 1040 cm-1 ở hình 3.10 cho thấy tỷ lệ cường độ đỉnh C-O-C (1156 cm-1)/cường độ đỉnh C-C (1040 cm-1) 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 A b s 1/cm 0kGy 250kGy 200kGy 150kGy 100kGy 300kGy 3 3 8 3 2 8 9 6 1 6 4 0 8 9 0 1 0 4 0 1 0 7 9 1 1 5 6 1 3 7 1 1 7 3 1 68 càng giảm theo sự tăng của liều xạ và kết quả được thể hiện rõ ở hình 3.11. Điều đó cho thấy sự cắt mạch của phân tử β-glucan đã diễn ra trong qua trình chiếu xạ và chủ yếu là ở các liên kết glucoside. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của nhiều tác giả trên đối tượng polysaccharide [32, 39, 90]. Có thể nhìn thấy rất rõ ở đây là sự suy giảm tỷ lệ cường độ đỉnh C-O-C (1156 cm- 1)/cường độ đỉnh C-C (1040 cm-1) này khá tương đồng với sự suy giảm Mw ở hình 3.7 và sự gia tăng cường độ đỉnh ở bước sóng 273 nm trong phổ UV ở hình 3.9. 3.2.5. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C Hình 3.12. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (a) và 13C (b) của β-glucan tan nước có Mw~25 kDa Để có thể khẳng định thành phần chất trong tan nước chính là β-glucan, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C của mẫu β-glucan tan trong nước chế tạo được có Mw~25 kDa được tiến hành đo trên máy Utrashield 500 plus (USA) và kết quả hình 69 3.12a cho thấy độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) quan sát được ở 4,48; 3,43; 3,59; 3,45; 3,47 và 3.82 ppm là lần lượt biểu thị cho các liên kết H-1, H-2, H-3, H- 4, H-5 và H-6 trong phân tử β-glucan tan nước sau khi chiếu xạ. Trong khi đó kết quả nhận được từ hình 3.12b cho thấy độ dịch chuyên hóa học biểu thị cho các nguyên tử C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 và C-6 trong phân tử β-glucan tan trong nước sau khi chiếu xạ quan sát được lần lượt ở các giá trị 102,55; 72,32; 84,12; 68,14; 75,56 và 60,73 ppm. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả đã công bố của Byun và ctv và Methacanon và ctv khi phân tích cấu trúc của β-glucan tách chiết từ tế bào nấm men [32, 41]. Như vậy kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C đã cho thấy thành phần chính của mẫu β-glucan Mw thấp tan trong nước sau khi cắt mạch là β-glucan. 3.2.6. Phân tích hàm lƣợng β-glucan C ng giống như kết quả phân tích hàm lượng các loại glucan trong mẫu glucan sau khi tách chiết từ thành tế bào nấm men, kết quả phân tích trong mẫu glucan tan nước sau khi chiếu xạ và sấy khô ở nhiệt độ 60oC được thể hiện ở bảng 3.8. Kết quả cho thấy, so với mẫu đối chứng không chiếu xạ thì hàm lượng glucan tổng số trong mẫu sau khi chiếu xạ đã tăng nhẹ (lên ~97,88%) trong đó hàm lượng α-glucan giảm nhẹ (còn ~0,91%) và chủ yếu vẫn là β-glucan với hàm lượng khoảng 96,97%. Kết quả này cho thấy trong quá trình chiếu xạ tia gamma cắt mạch các phân tử β-glucan là chủ yếu và sản phẩm sau khi chiếu xạ có độ tinh khiết là rất cao. Bảng 3.8. Kết quả phân tính hàm lượng các loại glucan trong mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa Loại glucan Hàm lƣợng trong mẫu (%) Trƣớc khi chiếu xạ Sau khi chiếu xạ Glucan tổng số 93,34 ± 0,41 97,88 ± 0,89 α-glucan 1,56 ± 0,07 0,91 ± 0,36 β-glucan 91,78 ± 0,34 96,97 ± 0,25 70 3.3. Hoạt tính sinh học của β-glucan tan nƣớc chế tạo bằng phƣơng pháp chiếu xạ 3.3.1. Hoạt tính kháng oxi hóa của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vitro Phương p