Luận án Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy cao sử dụng điện cực in Các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm - Đỗ Thị Ngọc Trâm

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.viii

DANH MỤC CÁC BẢNG. x

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ . xi

MỞ ĐẦU . 1

CHƯƠNG 1. CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN BỆNH

SỚM . 6

1.1 Cảm biến sinh học . 6

1.1.1 Đầu thu sinh học . 7

1.1.2 Bộ phận chuyển đổi tín hiệu . 13

1.1.3 Phương pháp cố định đầu thu sinh học. 15

1.1.4 Các phương pháp cố định kháng thể. 17

1.1.4.1 Hấp phụ vật lý . 18

1.1.4.2 Liên kết cộng hóa trị . 18

1.1.4.3 Ái lực tương tác sinh học . 20

1.2 Cảm biến sinh học điện hóa. 21

1.2.1 Điện cực điện hóa . 21

1.2.2 Phân loại cảm biến sinh học điện hóa. 24

1.2.2.1 Cảm biến đo dòng . 24

1.2.2.2 Cảm biến đo điện thế. 26

1.2.2.3 Cảm biến đo độ dẫn . 28

1.2.2.4 Cảm biến đo phổ tổng trở . 29

1.3 Ung thư và một số chất chỉ dấu khối u . 32

1.3.1 Chỉ dấu α-hCG và ung thư tế bào mầm tinh. 34

1.3.2 Chỉ dấu PSA và ung thư tiền liệt tuyến . 35

1.3.3 Chỉ dấu AFP và ung thư gan nguyên phát . 36

1.4 Nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu khối u . 36

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước. 36

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước . 47

1.4.3 Định hướng nghiên cứu của luận án . 47iv

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 49

2.1 Phương pháp điện hóa . 49

2.1.1 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) . 49

2.1.1.1 Mô hình mạch điện tương đương Randles . 50

2.1.1.2 Biểu diễn phổ tổng trở trong mặt phẳng phức . 51

2.1.2 Phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) . 53

2.2 Phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu . 54

2.2.1 Ảnh hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) . 54

2.2.2 Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS) . 54

2.2.3 Phổ tán xạ Raman . 54

2.3 Công nghệ vi lưu ly tâm . 55

2.3.1 Giới thiệu . 55

2.3.2 Thiết kế và quy trình chế tạo chíp vi lưu ly tâm. 55

2.3.3 Vận chuyển dung dịch trong chíp vi lưu ly tâm . 57

2.4 Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến. 58

2.4.1 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực làm việc SPCE . 58

2.4.2 Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) alkanethiol. 58

2.4.3 Tổng hợp vật liệu polyme bằng phương pháp trùng hợp điện hóa. 59

2.4.3.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa . 59

2.4.3.2 Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy-PPa

và erGO . 60

2.4.3.3 Vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng . 61

2.4.4 Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị. 61

2.4.4.1 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm amin của đầu thu sinh học . 62

2.4.4.2 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm cacboxyl của đầu thu sinh học. 63

2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến phổ tổng trở điện hóa. 63

2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm . 65

2.6.1 Độ nhạy của cảm biến. 65

2.6.2 Khoảng tuyến tính của cảm biến . 66

2.6.3 Độ lặp lại của cảm biến . 66

2.6.4 Giới hạn phát hiện của cảm biến . 66v

2.6.5 Độ chọn lọc của cảm biến. 67

CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG

CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH . 68

3.1 Mở đầu. 68

3.2 Thực nghiệm. 69

3.2.1 Hóa chất . 69

3.2.2 Điện cực và linh kiện. 70

3.2.3 Quy trình cố định mAb hCG trên điện cực vàng. 71

3.2.4 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM. 72

3.2.4.1 Vi cân tinh thể thạch anh . 72

3.2.4.2 Khảo sát hoạt động của cảm biến . 73

3.2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/SPAuE . 73

3.3. Kết quả và thảo luận . 74

3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM . 74

3.3.1.1 Hiệu suất cố định kháng thể. 74

3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến . 75

3.3.2 Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở mAb hCG/SAM(MHDA)/SPAuE . 77

3.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ. 77

3.3.2.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến . 79

3.4 Kết luận . 81

CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN

ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN . 82

4.1 Mở đầu. 82

4.2 Thực nghiệm. 83

4.2.1 Hóa chất . 83

4.2.2 Điện cực và linh kiện. 84

4.2.3 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE. 84

4.2.4 Cố định aptamer. 86

4.3 Kết quả và thảo luận . 87

4.3.1 Cảm biến aptamer phổ tổng trở điện hóa. 87

4.3.2 Cảm biến PSA-aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE. 88vi

4.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ. 88

4.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ aptamer lên tín hiệu cảm biến . 89

4.3.3 Cảm biến PSA-aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE . 90

4.3.3.1 Phân tán aptamer. 90

4.3.3.2 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ. 93

4.3.3.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến . 95

4.3.3.4 Độ chọn lọc của cảm biến. 97

4.4 Kết luận . 97

CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN

ĐOÁN UNG THƯ GAN. 98

5.1 Mở đầu. 98

5.2 Thực nghiệm. 99

5.2.1 Hóa chất và điện cực. 99

5.2.2 Cố định mAb AFP lên điện cực PPy-PPa/SPCE và PPy-PPa/erGO-SPCE . 99

5.2.3 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi SAM (p-ATP). 100

5.2.4 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt

nano vàng. 100

5.3. Kết quả và thảo luận . 101

5.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPy-PPa/SPCE . 101

5.3.1.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa trên điện cực SPCE . 101

5.3.1.2 Tối ưu hóa tỷ số hợp phần của monome Pa với Py. 103

5.3.1.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến . 104

5.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE . 107

5.3.2.1 Khử điện hóa GO trên SPCE . 107

5.3.2.2 Hình thái học bề mặt điện cực . 111

5.3.2.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến . 112

5.3.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE . 115

5.3.3.1 Ảnh hưởng của mật độ hạt nano vàng . 115

5.3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian tạo màng SAM . 118

5.3.3.3 Đặc trưng điện hóa sau mỗi bước công nghệ . 119

5.3.3.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến . 120vii

5.3.4 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE. 121

5.3.4.1 Poly(p-ATP) kết hợp hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE. 122

5.3.4.2 Phổ tán xạ Raman của màng poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE . 124

5.3.4.3 Đặc trưng điện hóa sau các bước công nghệ. 125

5.3.4.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến . 126

5.4 Kết luận . 128

CHƯƠNG 6. CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE. 129

6.1 Glucose và đường huyết . 129

6.2 Cảm biến điện hóa enzyme GOx. 130

6.3 Polyme ôxy hóa khử Osmium và cảm biến GOx . 133

6.4 Thực nghiệm. 133

6.4.1 Hóa chất và thiết bị . 133

6.4.2 Quy trình chế tạo cảm biến (GOx/Osmium)n/AuNPs-SPCE. 134

6.5 Kết quả và thảo luận . 135

6.5.1 Khảo sát hình thái bề mặt cấu trúc đa lớp (GOx/Osmium) . 135

6.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của số lớp (GOx/Osmium). 136

6.5.3 Đáp ứng dòng-thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE. 137

6.6 Kết luận . 138

KẾT LUẬN . 139

KIẾN NGHỊ. 140

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 141

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN . 160

PHỤ LỤC . - 1 -

pdf188 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 451 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy cao sử dụng điện cực in Các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm - Đỗ Thị Ngọc Trâm, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
u 1 giờ, tiến hành rửa điện cực bằng dung dịch PBS chứa 0,05% Tween 20 để loại bỏ hết các liên kết yếu và kháng thể không liên kết. Bước 3: Khóa gốc tự do: Bước này thực hiện tương tự như bước 3 mục 2.4.5.1. 2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến phổ tổng trở điện hóa Bước 1. Chuẩn bị mẫu chỉ dấu sinh học cần phân tích 64 Các chất chỉ dấu sinh học bao gồm kháng nguyên α-hCG và PSA được phân tán trong môi trường dung dịch đệm PBS 10 mM có độ pH 7,4 với nồng độ xác định. Kháng nguyên AFP được phân tán trong huyết thanh với nồng độ xác định. Huyết thanh được tách từ mẫu máu của người âm tính với bệnh ung thư gan tại bệnh viện Lão khoa Trung ương theo quy trình hình 2.13. Hình 2.13. Quy trình xử lý mẫu máu toàn phần tách lấy phần huyết thanh: (a) mẫu máu toàn phần, (b) mẫu máu sau khi để đông tự nhiên, (c) mẫu sau khi tách phần máu đông, (d) mẫu huyết thanh Mẫu máu toàn phần được để đông tự nhiên tại nhiệt độ phòng xét nghiệm trong khoảng từ 20 – 30 phút. Tách 1 mL phần huyết thanh màu vàng nhạt ở phía trên cục máu cho vào ống Eppendorf 1,5 mL. Phần huyết thanh mầu vàng được quay ly tâm với tốc độ quay 4000 - 5000 vòng/phút trong 10 phút và tách lấy phần lỏng ở trên. Mẫu được nút chặt bằng giấy parafin để tránh bốc hơi và nhiễm khuẩn. Huyết thanh có thể bảo quản ở ngăn đông của tủ lạnh thường (nhiệt độ từ -4ºC ÷ 0ºC) trong vòng 1 tuần. Nếu được để ở tủ lạnh sâu (nhiệt độ từ -40ºC ÷ -20ºC) thì huyết thanh có thể bảo quản trong vòng 1 tháng. Bước 2. Phản ứng đặc hiệu giữa đầu thu sinh học và chỉ dấu sinh học Nhỏ 3 µL dung dịch có chứa kháng nguyên lên điện cực làm việc của cảm biến và giữ tại điều kiện nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, điện cực được rửa bằng dung dịch đệm PBS 10 mM và nước cất hai lần để loại bỏ kháng nguyên không liên kết hoặc liên kết yếu. Điện cực được sấy khô nhẹ với dòng khí nitơ và tiến hành đo phổ tổng trở. Bước 3. Khảo sát phổ tổng trở điện hóa Dung dịch đo gồm có 0,1 M KCl và 5 mM [Fe(CN)6]3-/4-. Dải tần số khảo sát từ 100 kHz đến 50 mHz tại thế một chiều OCP và thế xoay chiều 10 mV. Nhỏ 35 µL dung dịch đo bao phủ toàn bộ 3 điện cực của cảm biến và tiến hành đo phổ tổng trở. Sử dụng phần mềm Invium khớp (fit) phổ tổng trở thực nghiệm với phổ tổng trở của mô hình mạch tương đương và xác định giá trị của phần tử trong mạch. Mô hình mạch điện tương đương sử dụng cho các cảm biến đã chế tạo được trình bày trên bảng 2.2. ➢ Đối với cảm biến sử dụng màng đơn lớp tự lắp ghép SAM, do bề mặt khá đồng đều nên lớp điện tích kép hình thành do các ion trong dung dịch điện ly tích tụ trên bề mặt điện cực làm việc được mô phỏng như một tụ điện lý tưởng. ➢ Đối với cảm biến sử dụng vật liệu polyme, do hình thái bề mặt điện cực không đồng nhất nên mô hình tụ điện lý tưởng Cdl sẽ không còn phù hợp. Do vậy, trong mô hình mạch tương đương phần tử pha ZCPE được thay thế cho tụ điện lý tưởng Cdl [148]. Giá trị n là hệ số CPE, hệ số này phụ thuộc vào độ gồ ghề của bề mặt điện cực. n = 1 thì phần tử pha ZCPE sẽ tương ứng như một tụ điện lý tưởng; n = 0 thì phần tử pha ZCPE sẽ (a) (b) (c) (d) 65 tương ứng như một tụ điện thuần; n = -1 thì phần tử pha ZCPE sẽ tương ứng như một cuộn cảm. Bảng 2.2. Mô hình mạch tương đương khớp phổ tổng trở thực nghiệm. Vật liệu biến tính điện cực SPCE Mô hình Mạch điện tương đương Phẩn tử trong mạch điện Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM C và Warburg (Mạch Randles) ( ) W 1/2 , , 1 , 1 Z .W dl s ct C dl R R Z j C j   = = Vật liệu polyme CPE và Warburg ( ) W 1/2 , , 1 , ( ) . 1 Z .W s ct CPE n R R Z j Q j   = = Bước 4. Xây dựng đường chuẩn của cảm biến Xây dựng đường đặc trưng chuẩn của cảm biến dựa trên sự phụ thuộc của giá trị Rct theo nồng độ kháng nguyên của chỉ dấu sinh học cần phân tích. Rct là sự thay đổi giá trị điện trở truyền điện tích Rct của cảm biến tại nồng độ kháng nguyên xác định so với mẫu trắng mẫu trắng (blank) tức là mẫu chỉ có gắn đầu thu sinh học trên bề mặt điện cực. Giá trị mỗi điểm trên đường chuẩn được xác định bằng trung bình Rct của 3 cảm biến độc lập. Sai số tại mỗi điểm đo được xác định bằng trung bình độ lệch tuyệt đối Rct của các cảm biến độc lập theo công thức (2.16): ( ) 1 n i i y y n  = − =  (2.16) yi là giá trị Rct của cảm biến trong lần đo thứ i và y là giá trị trung bình Rct của 3 mẫu tại cùng một nồng độ kháng nguyên xác định. 2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm 2.6.1 Độ nhạy của cảm biến Độ nhạy là tính đáp ứng tín hiệu của cảm biến khi thay đổi nồng độ chất cần phân tích hay khả năng phát hiện sự thay đổi tín hiệu tín hiệu khi có sự thay đổi về nồng độ chất cần phân tích. ZW Rs Cdl Rct ZW Rs Rct CPE 66 ➢ Đối với cảm biến phổ tổng trở, độ nhạy của cảm biến được xác định bởi tỷ số giữa sự thay đổi của giá trị điện trở truyền điện tích ctR và sự thay đổi nồng độ chỉ dấu sinh học tương ứng C theo công thức: ct R S C  =  (2.17) ➢ Đối với cảm biến dựa trên phép đo dòng – thế, độ nhạy được xác định bởi tỷ số giữa sự thay đổi dòng cực đại đỉnh khử (hoặc đỉnh ôxy hóa) và nồng độ chỉ dấu sinh học tương ứng C theo công thức: p I S C  =  (2.18) 2.6.2 Khoảng tuyến tính của cảm biến Khoảng tuyến tính của cảm biến được xác định từ giá trị nồng độ định lượng thấp nhất của cảm biến đến giá trị nồng độ lớn nhất mà tín hiệu đáp ứng của cảm biến tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất. Với mục tiêu nghiên cứu cảm biến phát hiện chỉ dấu sinh học ứng dụng trong chẩn đoán sớm bệnh nên khoảng nồng độ khảo sát cũng như khoảng tuyến tính sẽ tương ứng với chỉ dấu sinh học của từng bệnh. - Chỉ dấu sinh học α-hCG ứng dụng chẩn đoán u tế bào mầm tinh: 4 ng/mL ÷ 100 ng/mL - Chỉ dấu sinh học PSA ứng dụng chẩn đoán sớm ung thư tiền liệt tuyến: 2 ng/mL ÷ 10 ng/mL - Chỉ dấu AFP ứng dụng chẩn đoán sớm ung thư gan: 1 ng/mL ÷ 100 ng/mL - Chỉ dấu glucose ứng dụng chẩn đoán bệnh tiểu đường: 0 mM ÷ 10 mM 2.6.3 Độ lặp lại của cảm biến Độ lặp lại của cảm biến được xác định thông qua khảo sát hoạt động của 3 cảm biến độc lập được chế tạo với cùng quy trình thực nghiệm và được khảo sát tại cùng một thời điểm. 2.6.4 Giới hạn phát hiện của cảm biến Giới hạn phát hiện của cảm biến được xác định theo quy tắc 3 (3 lần độ lệch chuẩn của mức nhiễu trung bình) và được tính toán theo công thức [191]: 3 . = STDEV LOD Slope (2.19) Trong đó: - LOD là giới hạn phát hiện của cảm biến. - Slope là độ dốc của đường chuẩn. - STDEV là giá trị độ lệch chuẩn của mẫu trắng (blank) tức là mẫu chỉ có gắn đầu thu sinh học trên bề mặt điện cực và được xác định theo công thức (2.20). Trong đó n là số mẫu trắng được lựa chọn khảo sát và trong nghiên cứu này có giá trị bằng 5, yi là giá trị mẫu trắng ở lần đo thứ i và y là giá trị trung bình của 5 mẫu trắng. 67 ( ) 2 1 1 n i i y y STDEV n = − = −  (2.20) 2.6.5 Độ chọn lọc của cảm biến Độ chọn lọc của cảm biến phát hiện chỉ dấu khối u đạt được ở mức chọn lọc phân tử do cảm biến sử dụng đầu thu sinh học là kháng thể đơn dòng và aptamer. Kháng thể đơn dòng được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào và chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên. Aptamer là chuỗi oligonucleotide được tổng hợp bởi chuỗi SELEX có độ chọn lọc đặc hiệu ở mức độ phân tử với chỉ dấu sinh học là protein đích. 68 CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH 3.1 Mở đầu Cố định đầu thu sinh học trên bộ phận chuyển đổi có ý nghĩa quyết định đến sự thành công trong chế tạo cảm biến sinh học. Quá trình cố định phải đảm bảo duy trì được hoạt tính của đầu thu sinh học, kiểm soát được sự phân bố cũng như sự định hướng của các đầu thu sinh học trên bề mặt bộ chuyển đổi tín hiệu. Đã có rất nhiều phương pháp vật lý và hóa học được áp dụng trong cố định các phân tử sinh học như hấp phụ vật lý, liên kết cộng hóa trị, bẫy, hóa rắn hay liên kết chéo [139]. Trong các phương pháp cố định đối kháng thể, phương pháp liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm chức amin trên kháng thể chiếm ưu thế. Do số lượng các nhóm chức amin tồn tại ở điểm cuối N của chuỗi polypeptide và chuỗi bên của amino axít Lysine rất lớn trong cấu trúc kháng thể nên xác suất gắn kết kháng thể trên bề mặt điện cực là rất cao. Ngoài ra, do nhóm amin nằm trên mặt ngoài cấu trúc của kháng thể nên không làm biến đổi cấu trúc của kháng thể khi cố định [240]. Nhóm amin trên kháng thể có thể tạo liên kết cộng hóa trị với bề mặt được biến tính bởi nhóm chức epoxy [126], nhóm aldehyde [275], hay nhóm cacboxyl [79]. Ưu điểm của phương pháp cố định kháng thể bằng liên kết cộng hóa trị là liên kết bền vững, độ lặp lại cao, khả năng điều khiển được mật độ đầu thu kháng thể cố định thông qua biến tính bề mặt điện cực. Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM-Self-assembled monolayer) được hình thành bằng cách tự lắp ghép các phân tử có tính quy luật trên bề mặt của vật liệu rắn như kim loại, thủy tinh hoặc chất bán dẫn [236]. Cấu trúc của SAM gồm ba phần cơ bản là phần đầu đính kết, mạch alkyl dài và nhóm chức. Phần đầu đính kết đóng vai trò quan trọng nhất trong việc hình thành SAM, nhóm này sẽ tạo liên kết hóa học với bề mặt. Có rất nhiều nhóm chức đính kết khác nhau như alcohol, axít cacboxylic, thiol, axít sulforic, trichlorosilane, axít photphoric Dựa trên loại đầu đính kết này này, màng SAM được đặt tên như SAM ankylsiloxane, SAM alkanethiol... Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM được ứng dụng trong cảm biến sinh học do những ưu điểm: (i) đồng nhất, dễ tổng hợp, ổn định trong môi trường dung môi; (ii) được sử dụng như lớp màng chắn bảo vệ đầu thu sinh học không tiếp xúc trực tiếp với bề mặt điện cực, hạn chế sự suy giảm hoạt tính sinh học của đầu thu; (iii) có thể thay đổi các nhóm chức tùy theo mục đích cố định [257]. Trong các loại màng SAM biến tính bề mặt điện cực giúp cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị thì SAM alkanethiol được sử dụng nhiều hơn cả. SAM alkanethiol bao gồm phần đầu đính kết là nhóm chức có chứa lưu huỳnh liên kết với đế kim loại (vàng, bạc, bạch kim). Mạch alkyl có kích thước 1÷3 nm kết nối giữa phần đầu đính kết và nhóm chức. Chuỗi mạch alkyl sắp xếp theo một đơn lớp phân tử theo trật tự nhất định và nghiêng góc khoảng 20÷300 so với bề mặt điện cực. Cấu trúc ổn định của các chuỗi mạch alkyl nhờ lực 69 liên kết Van der Waals [257]. Phần nhóm chức đóng vai trò quyết định tính chất hóa lý của lớp màng SAM cũng như khả năng liên kết với đầu thu sinh học. Nhóm chức thuộc SAM alkanethiol rất đa dạng bao gồm nhóm amin (-NH2), hydroxyl (-OH), cacboxyl (-COOH). Tương tác giữa SAM và đầu thu sinh học trong dung dịch có thể là liên kết cộng hóa trị, liên kết tĩnh điện hay liên kết kỵ nước phụ thuộc vào từng loại nhóm chức. Bề mặt điện cực được biến tính bởi SAM alkanethiol cho phép cố định đầu thu kháng thể [113, 207], enzyme [20, 140] hay lectin [268] bằng liên kết cộng hóa trị. Trong nghiên cứu này, tác giả hướng tới xây dựng cảm biến miễn dịch sử dụng đầu thu kháng thể đơn dòng để phát hiện kháng nguyên α-hCG, chỉ dấu khối u trong bệnh ung thư tế bào mầm tinh. Kháng thể đơn dòng α-hCG được cố định lên điện cực vàng của linh kiện QCM và điện cực in lưới màng dày mực in vàng (SPAuE) thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm chức amin của kháng thể với nhóm chức cacboxyl của SAM 16- mercaptohexadecanoic axít (MHDA). MHDA là axít hữu cơ thuộc nhóm alkanethiol mạch dài (gồm 16 mer) có độ bền nhiệt và bền hóa học. Quy trình công nghệ tối ưu cố định đầu thu kháng thể trên bề mặt điện cực vàng được biến tính bởi màng SAM(MHDA) được nghiên cứu thông qua khảo sát hoạt động của QCM ghi nhận: khi có sự hình thành màng SAM(MHDA), khi kháng thể được cố định trên SAM(MHDA) cũng như khi xảy ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể cố định. Bên cạnh đó, với mục đích hướng tới phát triển cảm biến sử dụng một lần trong các thiết bị cầm tay, tác giả cũng đã phát triển cảm biến điện hóa sử dụng điện cực SPAuE trên cơ sở quy trình công nghệ cố định kháng thể đã được nghiên cứu trong cảm biến nhạy khối lượng. Điện cực SPAuE có giá thành rẻ hơn nhiều so với linh kiện QCM và yêu cầu một lượng nhỏ dung dịch mẫu (3µL). 3.2 Thực nghiệm 3.2.1 Hóa chất Axít 16-mercaptohexadecanoic (MHDA), ester N-hydroxysuccinimide (NHS), 1-ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodimide (EDC), Tween 20, Kali ferrocyanide (K- 4[Fe(CN)6]), Kali ferricyanide (K3[Fe(CN)6]), axít H2SO4 được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrich. Dung dịch đệm muối photphat PBS (pH =7.4 bao gồm NaCl 8,00 g/L, KCl 0,20 g/L, Na2HPO4 1,38 g/L và KH2PO4 0,2 g/L), ethanol, acetone, NaOH, HCl, H2O2 được cung cấp bởi hãng Merck. Kháng kháng thể đơn dòng mAb α-hCG, kháng nguyên đơn giá α-hCG, huyết thanh bò (Bovine serum albumin - BSA) được cung cấp bởi hãng Abcam (Mỹ). Các hóa chất có độ sạch cao ở mức dùng cho phân tích nên được sử dụng ngay mà không qua bất kỳ bước tinh chế nào. Tất cả các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu này đều được phân tán trong nước khử ion có điện trở suất lớn hơn 18 MΩ.cm. 70 3.2.2 Điện cực và linh kiện Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng linh kiện QCM 5 MHz được chế tạo bởi hãng Stanford Research Systems, Mỹ. QCM có cấu trúc bánh kẹp giữa phiến tinh thể thạch anh với điện cực vàng kích thước 126 mm2 (hình 3.1a). Thiết bị QCM 200 và bộ phát dao động 5 MHz được ghép với hệ thiết bị đo tần số SR620 có dải tần số từ 0,001 Hz đến 1,3 GHz (hình 3.1b). Hệ thiết bị được sử dụng khảo sát hoạt động của linh kiện QCM sau mỗi bước của quy trình công nghệ chế tạo cũng như đáp ứng của cảm biến với kháng nguyên α-hCG phân tán trong dung dịch đệm PBS 10mM (pH 7,4). Linh kiện QCM được khảo sát ở chế độ khảo sát động với dung dịch được bơm vào buồng giữ mẫu bởi vi bơm xilanh. Hình 3.1. (a) Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM 5 MHz được ghép nối với bộ tạo dao động QCM25 của hãng Stanford Research Systems, (b) Hệ thiết bị khảo sát hoạt động của QCM ở chế độ đo động. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng điện cực SPAuE chế tạo theo công nghệ in lưới màng dày của hãng BioDevice Technology, Nhật Bản. Cấu trúc của SPAuE gồm ba điện cực được tích hợp trên đế nhựa: điện cực làm việc (mực in vàng), điện cực đối (mực in các bon), điện cực so sánh (mực in Ag/AgCl) (hình 3.2a-b). Diện tích bề mặt của điện cực làm việc là 3,67 mm2. Hình 3.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in vàng, (b) Điện cực mực in vàng SPAuE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa AutoLab PGSTAT 12. Thiết bị phân tích điện hóa AutoLab PGSTAT 30 (EcoChemie B.V., Ultrecht, Hà Lan) được sử dụng thực hiện phép đo phổ tổng trở để khảo sát hoạt động của cảm biến khi tương (a) (b) (a) (b) (c) 71 tác với kháng nguyên (hình 3.2c). Phép đo phổ trở kháng phức này được thực hiện trong dung dịch gồm có 0,1 M KCl và 5 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] với dải tần số từ 100 kHz đến 50 mHz với biên độ điện áp xoay chiều 10 mV. 3.2.3 Quy trình cố định mAb hCG trên điện cực vàng Hình 3.3. Quy trình công nghệ cố định mAb α-hCG lên điện cực vàng thông qua màng SAM(MHDA). Bước 1. Tạo màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (MHDA) Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (MHDA) được tổng hợp trên điện cực mực in vàng SPAuE và điện cực vàng của QCM như quy trình thực nghiệm đã trình bày trong mục 2.4.2 của chương 2. Sau bước này bề mặt điện cực vàng của cảm biến được biến tính bởi nhóm cacboxyl (-COOH). Bước 2. Hoạt hóa nhóm chức –COOH của MHDA bằng NHS/EDC Nhóm cacboxyl (-COOH) của MHDA được hoạt hóa bằng dung dịch bao gồm NHS và EDC như quy trình thực nghiệm đã trình bày trong mục 2.4.5.1 của chương 2. Lượng hóa chất sử dụng cho điện cực SPAuE là 3 µL và linh kiện QCM là 50 L. Bước 3. Cố định kháng thể đơn dòng α-hCG Nhỏ dung dịch có chứa kháng thể đơn dòng α-hCG với nồng độ 100 µg/mL lên bề mặt điện cực SAM(MHDA) như quy trình thực nghiệm đã trình bày trong mục 2.4.5 của chương 2. Bước 4. Khóa gốc tự do trên bề mặt điện cực bằng BSA Để loại các liên kết không đặc hiệu, điện cực sau khi cố định kháng thể được khóa các gốc tự do còn lại trên bề mặt bằng dung dịch PBS 10 mM có chứa 1% BSA. (EDC) R1-N=C=N-R2 (NHS) (Kháng thể) -NH2 (BSA) Cố định kháng thể S O OH Au O OH S O OH S O OH S O OH S S O O Au O O S O O S O O S O O S OO N OO N OO N OO N OO N Loại bỏ các liên kết không đặc hiệu Màng đơn lớp tự lắp ghép MHDA Au NH NH NH S O Au O S O S O S S O NH NH S O NH NH NH S O Au O O S O S O O S OO N OO N 72 3.2.4 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM 3.2.4.1 Vi cân tinh thể thạch anh Vi cân tinh thể thạch anh (Quartz Crystal Microbalance - QCM) được chế tạo từ tinh thể thạch có độ nhạy cao đối với sự thay đổi khối lượng trên bề mặt linh kiện. Linh kiện QCM gồm một phiến tinh thể thạch anh kẹp giữa hai điện cực kim loại vàng. Tùy theo mục đích sử dụng mà QCM được thiết kế theo nhiều kiểu cấu trúc khác nhau như planar, bi-meas, plano-convex [11]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng linh kiện QCM cấu trúc phẳng (planar). Khi đặt một điện áp xoay chiều có tần số thích hợp lên hai mặt của tinh thể thạch anh AT-cut, tinh thể sẽ dao động theo mode dao động trượt dọc theo bề mặt tinh thể. Khi tần số dao động riêng của tinh thể thạch anh bằng tần số dao động của điện áp đặt vào thì sẽ có hiện tượng cộng hưởng. Năm 1959, Sauerbrey đã đưa ra phương trình biểu diễn mối liên hệ giữa độ dịch tần số cộng hưởng của tinh thể thạch anh với sự thay đổi khối lượng trên một đơn vị diện tích bề mặt của tinh thể. . = − f K m (3.1) Trong đó, K là hệ số tỉ lệ, m biểu diễn sự biến thiên khối lượng trên một đơn vị bề mặt diện tích của tinh thể, f là độ dịch tần số cộng hưởng của tinh thể thạch anh. Dựa vào phương trình (3.1) ta có thể xác định được sự thay đổi khối lượng hấp phụ trên bề mặt tinh thể thạch anh. Khi xét dao động của linh kiện QCM trong môi trường chất lỏng, độ dịch tần số cộng hưởng của linh kiện QCM phụ thuộc vào khối lượng các chất hấp phụ trên bề mặt và độ nhớt của dung dịch theo công thức (3.2) [24]. 2 0 0 2 l l m l q qq q m f f f f fA          =  +  = − +     (3.2) Trong đó:  mf là sự dịch tần số do khối lượng hấp phụ trên bề mặt và  lf là sự dịch tần số do dung dịch. A là diện tích điện cực của QCM; 0f là tần số cộng hưởng của linh kiện QCM; l và l lần lượt là mật độ và độ nhớt của dung dịch, q và q lần lượt là mật độ và modul trượt của tinh thể thạch anh có giá trị 32,648 g/cmq = và 11 22,947.10 g/cm.sq = . Đối với phép đo trong pha lỏng chúng tôi sử dụng dung dịch đệm PBS nên độ nhớt l và mật độ l của dung dịch được xem như hằng số. Vì vậy biểu thức (3.2) thể rút gọn: 2 2 0 0 2 . . q q m m f f C f AA      = − = − (3.3) Trong cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM, đầu thu sinh học sẽ được cố định trực tiếp trên bề mặt điện cực của linh kiện. Khi có sự tương tác giữa đầu thu sinh học và đối tượng cần phân tích dẫn đến khối lượng hấp phụ trên bề mặt của QCM thay đổi. Nồng độ của đối tượng cần phân tích được xác định dựa trên sự suy giảm là tần số dao động của linh kiện QCM. Cảm biến loại này có ưu điểm là độ nhạy cao, thời gian đáp ứng nhanh và có thể sử dụng trong môi trường lỏng hoặc khí [78]. 73 3.2.4.2 Khảo sát hoạt động của cảm biến Hình 3.4. Sơ đồ hệ đo khảo sát hoạt động của cảm biến sinh học nhạy khối lượng sử dụng linh kiện QCM. Cảm biến được khảo sát ở chế độ đo động với sơ đồ ghép nối hệ đo được trình bày trên hình 3.4. Từ kết quả nghiên cứu trước của nhóm, chúng tôi lựa chọn điều kiện thực nghiệm khảo sát hoạt động của cảm biến nhạy khối lượng trong pha lỏng động với tốc độ dòng chảy của dung dịch là 3 mL/giờ, độ pH của dung dịch đo là 7,4 [102]. Kháng nguyên α-hCG được phân tán trong dung dịch PBS 10 mM (pH 7,4) để đạt được nồng độ như yêu cầu và bơm vào bộ giữ mẫu phân tích với tốc độ 3 mL/giờ. Sự suy giảm tín hiệu tần số cộng hưởng của linh kiện QCM được ghi nhận ngay trong quá trình bơm dung dịch. Thời gian cho mỗi phép phân tích khảo sát tương tác kháng nguyên-kháng thể là 80 phút. Hoạt động của cảm biến QCM được khảo sát trong dải nồng độ kháng nguyên α-hCG từ 100 pg/mL đến 27 ng/mL. 3.2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/SPAuE Hình 3.5. Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa. Kháng nguyên α-hCG được phân tán trong dung dịch PBS 10 mM để đạt được nồng độ như yêu cầu và được bảo quản tại nhiệt độ 4 oC. Trong nghiên cứu này, hoạt động của cảm ∆RCT -Zim (Ω) Zre(Ω) W RS RCT ZW Cdl RS [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- 74 biến điện hóa sử dụng điện cực SPAuE được khảo sát trong dải nồng độ kháng nguyên α- hCG từ 0,1 ng/mL đến 100 ng/mL. Quy trình khảo sát hoạt động của cảm biến được trình bày trong mục 2.4.6 của chương 2. Như đã trình bày trong chương 1, phép đo phổ tổng trở điện hóa faradaic sử dụng cặp chất ôxy hóa-khử [Fe(CN)6]3-/4- nên tín hiệu của cảm biến liên quan đến dòng Faraday của điện tử được sinh ra từ phản ứng ôxy hóa-khử của cặp chất [Fe(CN)6]3-/4- trong dung dịch điện ly và truyền đến điện cực. Khi phản ứng miễn dịch xảy ra giữa kháng nguyên và kháng thể trên bề mặt điện cực sẽ hình thành khối điện môi cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực (hình 3.5) nên điện trở truyền điện tích Rct tăng tỷ lệ với lượng kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể trên bề mặt điện cực cảm biến. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa điện trở truyền điện tích Rct và nồng độ kháng nguyên α-hCG. 3.3. Kết quả và thảo luận 3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM 3.3.1.1 Hiệu suất cố định kháng thể Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát quá trình hình thành màng SAM (MHDA) và cố định kháng thể trên điện cực vàng của linh kiện QCM thông qua sự thay đổi tần số dao động của linh kiện QCM. Đầu tiên, màng SAM (MHDA) phát triển định hướng trên điện cực vàng thông qua liên kết Au - S bền vững. Sau đó, EDC và NHS được sử dụng như một chất trung gian nhằm chuẩn bị cho bước cố định kháng thể mAb hCG. Mỗi kháng thể được cố định bằng cách thay thế nhóm ester của NHS - MHDA bằng liên kết peptide. Sau mỗi bước trong quy trình công nghệ, bề mặt của linh kiện QCM đều được rửa bằng dung dịch PBS nồng độ 10 mM và sấy khô bằng dòng khí nitơ và khảo sát tần số dao động trên hệ đo QCM 200. Khi khảo sát QCM trong môi trường chất lỏng, sự gia tăng khối lượng trên bề mặt linh kiện được xác định theo công thức (3.4): 2 6 2 0 0 . 1 . ( ) . 2,264.10 A f A f m g C f f−    = − = − (3.4) Trên hình 3.6 trình bày độ dịch tần của cảm biến sau mỗi bước tạo màng SAM, gắn nhóm NHS-este và cố định kháng thể. Trong suốt quá trình bơm dung dịch PBS vào tế bào đo chứa điện cực sau mỗi bước chế tạo, tín hiệu tần số ổn định chứng tỏ các liên kết bền vững trên bề mặt điện cực và không bị rửa trôi khi tiến hành đo trong môi trường lỏng. Bảng 3.1 trình bày kết quả tính toán khối lượng và số phân tử MHDA, NHS và kháng thể cố định trên bề mặt QCM. 75 Hình 3.6. Độ dịch tần sau mỗi bước chế tạo cảm biến nhạy khối lượng sử dụng linh kiện QCM. Bảng 3.1. Số phân tử cố định trên bề mặt linh kiện QCM sau mỗi bước chế tạo. Màng Mw ∆f (Hz) ∆m (ng) Mol (nmol) N MHDA 288,49 357 1785,6 6,19 3,73.1015 Este NHS 115,09 55,2 276,1 2,40 1,45.1015 Kháng thể α-hCG 13000 180 900,3 0,069 4,17.1013 Khi màng SAM đã hình thành trên bề mặt của linh kiện QCM độ suy giảm tần số là 357 Hz tương đương với số phân tử MHDA gắn trên điện cực là 3,73.1015 phân tử với mật độ là 1,32.1014 phân tử/mm2. Giá trị này lớn hơn so với các kết quả của nhóm nghiên cứu khác đã công bố [206, 251] chứng tỏ thời gian 12 giờ là phù hợp cho hiệu suất hình thành màng SAM là cao. Sau phản ứng tạo NHS-este trên màng SAM, tần suy giảm thêm một lượng là 55,2 Hz nhỏ so với khi màng SAM hình thành. Tính tỷ lệ phần trăm của số phân tử NHS với số phân tử MHDA thu được giá trị là 38,9% tức là cứ 5 phân tử MHDA bị kích hoạt bởi 2 phân tử NHS. Sau bước cố định kháng thể, tần số giảm 180 Hz tương đương với số kháng thể cố định được trên bề mặt là 4,17.1013. Để tính hiệu suất cố định kháng thể, sử dụng công thức (Nkháng thể/NNHS) x 100% chúng tôi thu được kết quả là 2,88%, cao hơn so với nghiên cứu của Wang chỉ là 0,14% [251]. Như vậy có thể thấy quy trình cố định kháng thể chúng tôi đưa ra là tối ưu. 3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến Hình 3.7 trình bày độ dịch tần số theo thời gian khi bơm dung dịch chứa kháng nguyên (với nồng độ xác định) vào tế bào đo. Kết quả cho thấy, khi bơm nồng độ kháng nguyên thấp (từ 100 pg/mL đến 1 ng/mL), tần số giảm suốt trong khoảng 25 p

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_va_che_tao_cam_bien_sinh_hoc_dien_hoa_do.pdf
Tài liệu liên quan