Luận án Nghiên cứu xác định đột biến gen CYB11B1 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11 Beta Hydroxylase - Nguyễn Thị Phương Mai

có trứng cá, huyết áp 120/80 mmHg. Bảng 3.3. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-010 Tên xét nghiệm Nồng độ ở bệnh nhân Nồng độ mức bình thường K+ (mmol/L) 3,8 3,5 - 5,5 ACTH (pmol/L) 10,5 Dưới 18 Testosterone (nmol/L) 20,9 0,35 - 2,60 17-OHP (ng/L) 0,57 < 0,2 17CS niệu µmol/24 giờ 20,6 < 7 60 Các xét nghiệm: Nhiễm sắc thể 46,XX; SRY (-); siêu âm không có u thượng thận; X-quang tuổi xương tương đương trẻ 7 tuổi (tuổi thực 3 tuổi) và tuổi xương tương đương trẻ 13 tuổi khi tuổi thực là 8 tuổi. Kết quả xét nghiệm sinh hoá có Testosteron và 17OHP huyết thanh tăng, 17OHCS niệu tăng (Bảng 3.3). Bệnh nhân được chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh có tăng huyết áp. Bệnh nhân được điều trị bằng hydrocortisone và phẫu thuật chỉnh hình bộ phận sinh dục ngoài. 3.1.4.2. Đột biến p.E147D-N152K Nghiên cứu phát hiện 01 bệnh nhân có 03 đột biến: p.R43Q trên exon 1; 2 đột biến mới ở dạng dị hợp tử là p.E147D và p.N152K trên exon 3 trên gen CYP11B1 (Hình 3.6). Hình 3.6. Đột biến p.E147D và p.N152K ở bệnh nhân MS. CYP11B1-011 A. Vị trí đột biến trên gen CYP11B1. B. Giải trình tự gen CYP11B1 trên bệnh nhân và mẹ. Bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử kép p.R43Q trên exon 1 và đột biến p.E147D-p.N152K trên exon 3 di truyền từ mẹ. Bệnh nhân có hai đa hình c.435T>C (p.N145N) và c.459T>C (p.A153A) di truyền từ mẹ. 61 Đột biến p.E147D xảy ra tại vị trí 441 trên cDNA CYP11B1, A bị thay thế thành T, làm biến đổi bộ ba mã hóa GAA thành GAT. Sự thay thế nucleotide trên cDNA dẫn đến sự thay thế axit amin trên chuỗi protein ở vị trí codon 147, Glutamic bị thay thế thành Aspartic. Đột biến thứ 2 phát hiện trên exon này là đột biến tại vị trí 456 trên cDNA, C bị thay thế bởi G, làm biến đổi bộ ba mã hóa axit amin AAC thành AAC. Sự biến đổi của bộ ba mã hóa này cũng dẫn đến sự thay đổi của axit amin trên chuối protein, Asparagine bị thay thế bởi Lysine (Hình 3.6). Đột biến được phát hiện trên bệnh nhân là trẻ trai, là con thứ 3 trong gia đình gồm 3 anh em (Hình 3.7). Bệnh nhân được chẩn đoán mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh có cao huyết áp (110/70mmgHg). Xạm da nặng từ sau sinh. Từ năm 2 tuổi, trẻ có các triệu chứng dậy thì (dương vật phát triển, chiều dài dương vật 6,5 cm; chu vi 7cm), thể tích tinh hoàn 2 ml, lông mu bắt đầu mọc (P1), tuổi xương tương đương với tuổi thực. Hình 3.7. Bệnh nhân MS. CYP11B1-011 A. Sơ đồ phả hệ. B. Hình ảnh bệnh nhân. Bệnh nhân được tiến hành chẩn đoán các xét nghiệm hoá sinh (Bảng 3.4). và điều trị bằng thuốc Prednisolon 5mg x1v/ngày, ngoại trú định kỳ 62 trong 3 năm liên tục. Các lần khám định kỳ thấy có triệu chứng dậy thì sớm, dương vật phát triển như người trưởng thành, tuổi xương tăng nhanh (tuổi xương tương đương 12 tuổi khi trẻ 7 tuổi), huyết áp luôn ở ngưỡng cao, dao động từ 160-170/80-90mmHg. Đến 7 tuổi, bệnh nhân được chuyển điều trị sang thuốc hydrocortison 10mg x 2v/ngày. Bảng 3.4. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-011 Tên xét nghiệm Nồng độ ở bệnh nhân Nồng độ bình thường Na+ (mmol/L) 141 135 – 155 K+ (mmol/L) 3,9 3,5 - 5,5 Testosterone (nmol/L) 2,2 0,35 - 2,60 Progesterone 5,2 17-CS (ng/L) 4,4 < 7 17OHCS 2,1 LH 2,4 FSH <1,25 3.1.4.3. Đột biến IVS6+5G>T Nghiên cứu phát hiện 02 bệnh nhân (01 nam; 01 nữ) có kiểu gen đồng hợp tử đột biến IVS6+5G>T di truyền từ bố và mẹ (Hình 3.8). Hai bệnh nhân đều mắc TSTTBS thể cổ điển NHĐT. Đây là đột biến thay đổi nucleotide thứ 5 ở vùng intron 6, Guanin thành Thymine (Hình 3.8). Đột biến IVS6+5G>T là đột biến mới, chưa được chứng minh sự ảnh hưởng của đột biến tới hoạt lực enzyme CYP11B1. 63 Hình 3.8. Đột biến IVS6+5G>T bệnh nhân MS. CYP11B1-006 A. Vị trí đột biến điểm trên gen CYP11B1. B. Đột biến IVS6+5G>T. Bố, mẹ và em trai bệnh nhân dị hợp tử với đột biến IVS6+5G>T, bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử G thành T tại vị trí thứ 5 trên intron 6 (IVS6+5G>T) di truyền từ bố và mẹ. Bệnh nhân thứ nhất là trẻ trai 2 tuổi, là con thứ hai trong gia đình, đến khám và điều trị tại Khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung Ương (Hình 3.9). Bệnh nhân có các triệu chứng như phát triển dương vật nhanh, tương đương với người trưởng thành, lớn nhanh, cơ bắp vạm vỡ, chiều cao 96 cm (+3 SD so với biểu đồ tăng trưởng của Tổ chức Y tế Thế giới), huyết áp 110/60 mmHg, tuổi xương tương đương với trẻ 5 tuổi. 64 Hình 3.9. Bệnh nhân MS. CYP11B1-006 A. Phả hệ gia đình. B. Hình ảnh bệnh nhân năm 15 tuổi Ban đầu, trẻ được điều trị hormon thay thế bằng hydrocortisone 15mg/m2/ngày, nhưng sau 14 tuổi, huyết áp tăng (150/100 mmHg). Hiện nay, bệnh nhân được điều trị bằng thuốc hydrocortisone và thuốc chống tăng huyết áp. Bệnh nhân được chẩn đoán TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase. Bệnh nhân được tiến hành làm các xét nghiệm sinh hoá. Kết quả xét nghiệm sinh hoá có Testosteron tăng, 17OHP, 17OHCS tăng (Bảng 3.5). Bảng 3.5. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-006 và MS. CYP11B1-008 Tên xét nghiệm Bệnh nhân MS. CYP11B1-006 Bệnh nhân MS. CYP11B1-008 Na+ (mmol/L) 136 125 K+ (mmol/L) 3,7 4,6 Testosterone (nmol/L) 10,11↑ 10,05↑ 17-OHP (ng/dL) 1160↑ 410↑ 17CS niệu µmol/24 giờ 9,1↑ Progesterone 15,93↑ 3,68 (Ghi chú: ↑: Nồng độ xét nghiệm tăng so với chỉ số bình thường) 65 Bệnh nhân thứ hai là trẻ gái (MS. CYP11B1-008) 27 tháng, đến khám tại khoa Nội tiết, Bệnh viện Nhi trung ương. Trẻ là con đầu trong gia đình. Khi đến khám, trẻ tỉnh, không sờ thấy tinh hoàn, âm vật phì đại, lỗ niệu đạo-sinh dục sát nhau; tuổi xương tương đương với tuổi thực. Trẻ được điều trị ngoại trú bằng hydrocortisone và phẫu thuật chỉnh hình bộ phận sinh dục. Bệnh nhân được tiến hành làm các xét nghiệm sinh hoá. Kết quả xét nghiệm sinh hoá Testosteron tăng, 17OHP, 17OHCS tăng (Bảng 3.5). Bệnh nhân cũng có kiểu gen đồng hợp tử đột biến mới ở vùng trượt gen trên intron 6, IVS6+5G>T di truyền từ bố và mẹ (Hình 3.10). Hình 3.10. Đột biến IVS6+5G>T ở bệnh nhân MS. CYP11B1-008 A. Phả hệ gia đình; I: bố, mẹ; II: con. B. Giải trình tự gen phát hiện bố, mẹ có kiểu gen dị hợp tử đột biến IVS6+5G>T, bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử G thành T tại vị trí thứ 5 trên intron 6 (IVS6+5G>T) được di truyền từ bố và mẹ. 66 3.1.4.4. Đột biến Y395X Nghiên cứu phát hiện 01 bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử đột biến trên exon 7 ở vị trí nucleotide 1185, C được thay thế thành A của gen CYP11B1, dẫn đến sự thay đổi của Tyrosine 395 tạo thành Stop codon (p.Y395X) (Hình 3.11). Hình 3.11. Đột biến p.Y395X bệnh nhân MS. CYP11B1-004 A. Vị trí các đột biến ở bệnh nhân trên gen CYP11B1. B. Sơ đồ phả hệ di truyền bệnh từ bố mẹ. Ia, Ib: bố và mẹ; II: con. C. Kết quả giải trình tự gen CYP11B1. Đột biến p.Y395X được phát hiện trên bệnh nhân là trẻ trai (MS. CYP11B1-004) được gia đình đưa đến bệnh viện Nhi Trung ương tại Hà Nội lúc 4 tuổi với lí do sốt kéo dài, đau đầu. Khám lâm sàng và khai thác bệnh sử cho thấy: xạm da từ sau khi sinh, đặc biệt sạm nhiều ở bộ phận sinh dục ngoài (Hình 3.12). Bệnh nhân có các biểu hiện của dậy thì sớm như: chiều cao > 2SD so với trẻ bình thường (109 cm), trứng cá, giọng ồm, cơ bắp vạm vỡ, thể tích tinh hoàn 3 ml, chiều dài dương vật 5 cm, chu vi dương vật 7 cm; cao huyết áp (140/90 mmHg). Phim chụp tuổi xương tương đương 9 tuổi. Siêu âm tuyến thượng thận: không thấy khối u vùng tuyến thượng thận hai bên. Em gái của bệnh nhân 05 có hiện tượng mơ hồ giới tính lúc sinh ra do biểu hiện 67 bên ngoài của bộ phận sinh dục không rõ ràng và chết sớm khi được 18 tháng trong bênh cảnh suy thượng thận cấp. Hình 3.12. Bệnh nhân MS. CYP11B1-004 A. Phả hệ gia đinh. B. Bệnh nhân có triệu chứng xạm da. C. Dương vật phát triển như người trưởng thành. Đây là một trường hợp có biểu hiện rất điển hình của bệnh TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase. Bệnh nhân được điều trị bằng hydrocortisone 12.5 mg/m2/ngày. Sau 2 tuần điều trị huyết áp đo được là 130/80 mmHg; các xét nghiệm hoá sinh được thể hiện ở Bảng 3.6. Bảng 3.6. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-004 Tên xét nghiệm Nồng độ ở bệnh nhân Nồng độ mức bình thường K+ (mmol/L) 2,2↓ 3,5 - 5,5 Testosterone (nmol/L) 0,17 0,35 - 2,60 17-OHP (ng/ml) 0,57↑ Dưới 0,2 17CS nước tiểu µmol/24h 21,3↑ Dưới 7 (Ghi chú: ↑: Tăng so với nồng độ bình thường; ↓: Giảm so với nồng độ bình thường) 68 Trong quá trình điều trị, gia đình đã không cho trẻ uống thuốc hydrocortisone đều đặn và không đưa trẻ đến bệnh viện để thăm khám định kì. Kết quả thăm khám sau 6 năm như sau: chiều cao 139 cm; cân nặng 41 kg; huyết áp 130/100 mmHg. Da còn thâm nhiều, nhiều trứng cá, lông mu phát triển, tinh hoàn hai bên 3 ml, dương vật như người trưởng thành. Phim tuổi xương tương đương 13 tuổi. Siêu âm tuyến thượng thận hai bên: thượng thận phải dài 4,6 cm, dầy 1,7 cm; thượng thận trái dài 4,7 cm, dày 1,8 cm. Điện giải đồ máu: Na+ 142; K+ 2,7 và Cl- 103 mmol/l; đường máu 5,2 mmol/l. Khí máu pH 7,49; pCO2 45,3; HCO3 - 33,9. 17OHP huyết thanh là 4230 ng/ml. 3.1.5. Mối tương quan kiểu gen p.R43Q – kiểu hình Kiểu gen dị hợp tử đột biến p.R43Q chiếm 8/15 bệnh nhân. 02/15 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử đột biến p.R43Q, 01/15 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử kép p.R43Q và 2 đột biến mới trên gen CYP11B1. Hình 3.13. Kiểu hình các bệnh nhân có đột biến dị hợp tử p.R43Q Trong nghiên cứu có 08/15 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử đột biến p.R43Q (06 bệnh nhân nam và 02 bệnh nhân nữ). Trong đó, 05/06 bệnh nhân nam có kiểu hình TSTTBS thể cổ điển NHĐT, 01/06 bệnh nhân nam có kiểu hình TSTTBS thể MM. 01/02 bệnh nhân nữ có kiểu hình TSTTBS thể NHĐT và 01/02 bệnh nhân có kiểu hình TSTTBS thể không cổ điển (Hình 3.13). 69 02 bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử đột biến p.R43Q đều là trẻ trai nhưng kiểu hình hai bệnh nhân này lại khác nhau. 1 bệnh nhân có kiểu hình TSTTBS thể cổ điển nam hóa đơn thuần, có kèm theo hiện tượng cao huyết áp và 1 bệnh nhân có kiểu hình TSTTBS thể cổ điển mất muối. 3.1.5.1. Bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu hụt 11β-hydroxylase dị hợp tử đột biến R43Q có kèm theo tim bẩm sinh Bệnh nhân là trẻ trai (MS. CYP11B1-012), 1 tháng tuổi. Trẻ là con đầu, đẻ thường, tuổi thai 36 tuần 4 ngày, cân nặng khi sinh 2,5kg. Tháng đầu, trẻ phát triển bình thường, không nôn trớ, tăng 1 kg. Lúc 35 ngày tuổi, trẻ khó thở, môi tím được vào bệnh viện Sản – Nhi và được chẩn đoán viêm phổi và được chuyển đến Bệnh viện Nhi trung ương. Bảng 3.7. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân CYP11B1-012 Xét nghiệm Kết quả Giới hạn Nhận xét Testosterone 4,25 nmol/L Cao ACTH 51,34 pmol/L 7,2-63,3 Bình thường (sau điều trị cấp cứu tiêm hydrocortisone) Cortisol 7-9 giờ 953 nmol/L 171-536 Cao (sau điều trị cấp cứu tiêm hydrocortisone) 17 OHP 27,7 ng/mL 0,1 – 5,3 Cao Natri 128,7 - 131,6 mmol/L 135-145 Giảm nhẹ Kali 2,9 - 4,5 mmol/L 3,4-4,5 Giảm → Bình thường Clo 98,6 mmol/L 98-105 Bình thường 70 Thăm khám lâm sàng nhận thấy trẻ có da xạm da, mất nước. Xét nghiệm điện giải đồ máu có rối loạn, định lượng nồng độ 17 OHP huyết thanh cao cho kết quả nghi mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh (Bảng 3.7). Bệnh nhân được phân tích steroid niệu bằng GC/MS để chẩn đoán xác định. Kết quả cho thấy nồng độ THS rất cao so với trẻ bình thường. Nồng độ các sản phẩm chuyển hóa của cortisol như THE, THF, allo-THF, Cortolone, Cortol không giảm. Hình 3.14. Bệnh nhân MS. CYP11B1-012 A. Hình ảnh bệnh nhân. B. Giải trình tự gen phát hiện bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử đột biến p.R43Q Trẻ được chẩn đoán TSTTBS thể thiếu 11β-hydroxylase/Tim bẩm sinh. Trẻ được chỉ định giải trình tự gen CYP11B1. Kết quả giải trình tự gen phát hiện trẻ có dị hợp tử đột biến p.R43Q (Hình 3.14). 3.1.5.2. Bệnh nhân nữ thiếu hụt 11β-hydroxylase dị hợp tử đột biến p.R43Q có triệu chứng nam hóa Bệnh nhân là trẻ gái, là con thứ hai trong gia đình, được chẩn đoán lúc 6 tuổi 7 tháng. Trẻ có chiều cao 107 cm, nặng 17 kg, bất thường bộ phận sinh dục ngay sau đẻ, không có trứng cá, huyết áp 80/50 mmHg. 1 năm trở lại đây trẻ có xạm da và âm vật to dần. 71 Trẻ được khám lâm sàng và tiến hành các xét nghiệm sinh hóa (Bảng 3.8). Thăm khám bộ phận sinh dục ngoài thấy hai môi lớn không dính nhau, âm vật phì đại 3 cm (Prader II), không sờ thấy tinh hoàn, lỗ niệu đạo-sinh dục sát nhau. Xquang tuổi xương tương đương trẻ 8 tuổi. Siêu âm tiểu khung thấy có tử cung, buồng trứng hai bên. Karyotype 46,XX. Bảng 3.8. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-005 Xét nghiệm Kết quả Giới hạn Nhận xét Testosterone 10,05 nmol/L Cao LH 0,83 U/L Bình thường FSH 4,68 U/L Bình thường 17 OHP 410 ng/mL 0,1 – 5,3 Cao Natri 145 mmol/L 135-145 Giảm nhẹ Kali 4,6 mmol/L 3,4-4,5 Bình thường Clo 107 mmol/L 98-105 Bình thường Hình 3.15. Bệnh nhân MS. CYP11B1-005 A. Bệnh nhân 20 tuổi, anh chụp lúc mang thai lúc 25 tuần. B. Giải trình tự gen CYP11B1 phát hiện bệnh nhân dị hợp tử đột biến p.R43Q 72 Giải trình tự gen CYP21A2 không phát hiện đột biến. Giải trình tự gen CYP11B1 phát hiện bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử đột biến p.R43Q (Hình 3.15). Bệnh nhân được điều trị bằng hydrocortisone 14mg/m2/ngày. Năm 8 tuổi, trẻ được phẫu thuật chỉnh hình bộ phận sinh dục ngoài. Bệnh nhân có kinh nguyệt lần đầu vào năm 11 tuổi 10 tháng. Năm 20 tuổi, bệnh nhân mang thai lần đầu và được mổ đẻ, sinh con khỏe mạnh (Hình 3.15). 3.1.5.3. Bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase đồng hợp tử đột biến p.R43Q với triệu chứng tăng huyết áp Bệnh nhân là con đầu trong gia đình và được chẩn đoán lúc 5 tuổi với các triệu chứng da xạm rõ, mặt nhiều trứng cá, cơ bắp phát triển, lớn nhanh (118 cm; > 2SD so với biểu đồ tăng trưởng của Tổ chức Y tế Thế giới), các triệu chứng dậy thì sớm ngoại biên gồm dương vật phát triển (chiều dài 6,5 cm; chu vi 7,5 cm, thể tích tinh hoàn 3 ml), tăng huyết áp (140/100 mmHg) (Hình 3.16). Hình 3.16. Bệnh nhân MS. CYP11B1-002 A. Sơ đồ phả hệ của bệnh nhân. B. Hình ảnh bệnh nhân lúc 15 tuổi. C. Giải trình tự gen CYP11B1 phát hiện bệnh nhân đồng hợp tử đột biến ở vị trí p.R43Q 73 Bệnh nhân có em trai sinh năm 1995, cân nặng khi sinh 3000 gram, đẻ thường, sau đẻ da xạm, tử vong ngày đầu sau đẻ nghi do suy thượng thận. Các xét nghiệm hóa sinh được trình bày tại Bảng 3.9. Bảng 3.9. Xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân MS. CYP11B1-002 Xét nghiệm Kết quả Giới hạn Nhận xét Testosterone: 3,39ng/ml Cao LH 0,95 UI/l Bình thường Cortisol 8 giờ: 2.52 µg/dl 17CS 20,1 µmol/l <7µmol/l Cao 17-OHCS 8,6 µmol/l 2,8-15,5 µmol/l Bình thường 17 OHP 27,7 ng/mL 0,1 – 5,3 Cao Natri 139 mmol/L 135-145 Bình thường Kali 2,7 mmol/L 3,4-4,5 Giảm Clo 107 mmol/L 98-105 Bình thường Kết quả xét nghiệm cho thấy bệnh nhân có hạ kali máu, Testosterone huyết thanh tăng, 17CS và 17OHCS niệu tăng. Xquang tuổi xương tương đương trẻ 13 tuổi, siêu âm tuyến thượng thận sinh dục bình thường, cấu trúc thận hai bên bình thường. Bệnh nhân được chẩn đoán mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh thể nam hóa đơn thuần. Trẻ được điều trị bằng hydrocortisone 10mg x 1v/ngày. Giải trình tự gen CYP11B1 phát hiện bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử đột biến p.R43Q di truyền từ mẹ (Hình 3.15). 3.2. NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐỘT BIẾN MỚI TRÊN GEN CYP11B1 TỚI HOẠT TÍNH ENZYME CYP11B1 3.2.1. Đột biến p.R51K Tế bào COS-1 được nuôi ở tủ ấm CO2 (370C và 6% CO2) trên môi trường DMEM. Đột biến p.R51K được biểu hiện trong tế bào động vật COS- 1 và so sánh với kiểu gen bình thường. 74 Hình 3.17. Đột biến p.R51K biểu hiện trong tế bào động vật COS-1 Protein của CYP11B1-WT, p.R51K, và Mock (vector pSVL không mang cDNA của CYP11B1) được phân tách trên gel SDS/PAGE. Sau khi chuyển qua màng nitrocellulose, các protein được phát hiện bằng kháng thể thỏ kháng CYP11B người và được phát hiện trên phim bằng kit ECL. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của 11β-hydroxylase của đột biến p.R51K và wild-type đã được phát hiện với 1 băng có kích thước khoảng 48,6 kDa (Hình 3.17). Tế bào COS-1 sau khi được biến nạp với vector mang đột biến p.R51K và wild type được ủ với 5 µM 11-deoxycortisol (RSS) và 0,6 μCi[3H]-RSS được thêm vào môi trường nuôi tế bào để kiểm tra hoạt tính enzyme. Hình 3.18. Phân tích hoạt tính của 11-hydroxylase có đột biến p.R51K ở tế bào động vật COS-1 75 Sau 72h nuôi cấy, các steroid được tách chiết và phân tách trên sắc ký lớp mỏng. Các thành phần của steorid được chuyển hóa từ cơ chất RSS tới cortisol (F) thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập. Sự chuyển hóa RSS tới F của chủng wild-type được tính là 100%. Hoạt tính của đột biến được biểu hiện được so sánh với wild-type. Kết quả cho thấy đột biến p.R51K giảm hoạt tính của 11β-hydroxylase chỉ còn 29 ± 4,5% so với wild-type (Hình 3.18). 3.2.2. Đột biến p.E147D - p.N152K Các tế bào COS-1 sau biến nạp được nuôi trong môi trường có cơ chất 11-deoxycortisol (RSS). Protein của CYP11B1-WT, p.E147D, p.N152K và Mock (vector pSVL không mang cDNA của gen CYP11B1) được phân tách trên gel SDS-PAGE. Sau khi chuyển qua màng nitrocellulose, các protein được phát hiện bằng kháng thể thỏ kháng CYP11B người và được phát hiện trên phim bằng kit ECL. Hình 3.19. Đột biến p.E147D và p.N152K biểu hiện trong tế bào động vật COS-1 Sự biểu hiện của CYP11B1 hoang dại và đột biến trong tế bào động vật COS-1 được xác định lại bằng lai Western. Sự biểu hiện của 11β-hydroxylase của đột biến (p.E147D và p.N152K) và hoang dại đã được phát hiện với một băng có kích thước khoảng 48,6 kDa (Hình 3.19). Điều này chứng tỏ rằng 2 76 đột biến và hoang dại đã được biểu hiện trong tế bào động vật và không ảnh hưởng tới sự dịch mã của 11β-hydroxylase. Hình 3.20. Phân tích hoạt tính của 11β-hydroxylase có đột biến p.E147D và p.N152K ở tế bào động vật COS-1 Sau khi biến nạp, 5 µM 11-deoxycortisol (RSS) và 0,6μlCi [3H]-RSS được thêm vào môi trường nuôi tế bào. Các thành phần của steorid được chuyển hóa từ cơ chất RSS tới cortisol (F), thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại độc lập. Sự chuyển hóa RSS tới F của thể hoang dại được tính là 100%. Hoạt tính của đột biến được biểu hiện được so sánh với thể hoang dại. Sau khi sự biểu hiện protein được xác định bằng phương pháp lai Western, tế bào COS-1 được ủ với cơ chất 11β-deoxycortisol để kiểm tra hoạt tính enzyme của protein biểu hiện. Sau 72 h nuôi cấy, các steroid được tách chiết và phân tách trên sắc ký lớp mỏng. Hoạt tính của của 2 đột biến p.E147D, và p.N152K được so sánh với thể hoang dại (Hình 3.20). Đột biến p.E147D giảm hoạt tính tới 52% so với thể hoang dại. Đột biến p.N152K giảm khoảng 64% hoạt tính so với thể hoang dại. 77 3.3. PHÂN TÍCH SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘT BIẾN MỚI TRÊN GEN CYP11B1 TỚI CẤU TRÚC ENZYME CYP11B1 3.3.1. Kết quả mô hình cấu trúc 3 chiều của enzyme CYP11B1 Dựa vào nghiên cứu của Belkia, nhóm nghiên cứu đã tiến hành so sánh trình tự của các P450 trên phần mềm ClustalW2 và đưa ra trình tự các vùng helix của CYP11B1 và CYB11B2 (Hình 3.21). Kết quả cho thấy, trình tự các vùng helix, đặc biệt, 6 đoạn xoắn D, E, I, L, J và K và 6 vùng bảo thủ SCRs của CYP11B1 ở người có độ tương đồng cao với CYP11B1 ở chuột, bò, lợn (Belkina N.V. và cs, 2001). Hình 3.21-A. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1. Phần gạch dưới trình tự là các helix. Vùng bôi vàng là vùng nhận biết cơ chất trong họ CYP (Gotoh O., 1992). Điểm đột biến được đánh dấu đỏ. 78 Hình 3.21-B. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1. Phần gạch dưới trình tự là các helix. Vùng bôi vàng là vùng nhận biết cơ chất trong họ CYP (Gotoh O., 1992). Điểm đột biến được đánh dấu đỏ. 79 Hình 3.21-C. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1. Phần gạch dưới trình tự là các helix. Vùng bôi vàng là vùng nhận biết cơ chất trong họ CYP (Gotoh O., 1992). Điểm đột biến được đánh dấu đỏ. 80 Hình 3.21-D. So sánh trình tự axit amin CYP11B1 và CYP11B2 của người, bò, chuột, lợn và bằng chương trình CLUSTALW1. Phần gạch dưới trình tự là các helix. Vùng bôi vàng là vùng nhận biết cơ chất trong họ CYP (Gotoh O., 1992). Điểm đột biến được đánh dấu đỏ. Mô hình này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu trước đây về P450. Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Từ sự tương đồng của các Cytochrome P450 nhóm nghiên cứu đã xác định được các vùng nhận biết cơ chất SRS của CYP11B1. Đây là vùng cấu trúc rất quan trọng của protein, đột biến xảy ra tại vùng cấu trúc này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của protein. 3.3.2. Ảnh hưởng của đột biến mới tới cấu trúc của enzyme CYP11B1 3.3.2.1. Đột biến p.R51K Đột biến p.R51K là đột biến làm thay đổi axit amin Arginine thành Lysine. Mô hình đột biến cấu trúc 3D cho thấy, đột biến này đã làm mất đi một liên kết hydro giữa Lysine và Glutamine ở vị trí axit aimin 54 (Hình 3.22). Điều này có thể ảnh hưởng đến sự tương tác giữa các axit amin và cấu 81 trúc của phân tử protein. Đột biến p.R51K được phát hiện ở một bệnh nhân nữ. Bệnh nhân có kiểu hình TSTTBS thể cổ điển NHĐT với bộ phận sinh dục ngoài bất thường và huyết áp tăng cao. Hình 3.22. Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.R51K A: Mô hình bình thường. B: Mô hình đột biến 3.3.2.2. Đột biến p.E147D Đột biến p.E147D làm biến đổi Glutamic thành Aspartic tại vị trí axit amin 147. Đây là đột biến xảy ra trên vùng C’-helix. Kết quả mô hình đột biến cho thấy đột biến này đã làm mất đi một liên kết hydro giữa Aspartic và Arginine ở vị trí axit amin thứ 454, một liên kết hydro giữa Aspartic và Arginine ở vị trí axit amin 143 (Hình 3.23). Sự thay đổi về liên kết hydro có thể ảnh hưởng đến mối tương quan chung của các axit amin trong phân tử protein. Vì thế, đột biến này có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính của protein. Dự đoán này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu về mức độ ảnh hưởng của đột biến cũng như biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân: Huyết áp tăng cao, K+ giảm, 17 OHP tăng... Ngoài ra, theo Fish và cộng sự, đột biến này làm suy giảm đáng kể hàm lượng 11β- 82 hydroxylase, do đó, làm giảm việc chuyển đổi DOC tới corticosterone (Fisher A. và cs, 2000). Hình 3.23. Mô hình cấu trúc 3D của đột biến E147D A: Mô hình bình thường. B: Mô hình đột biến 3.3.2.3. Đột biến p.N152K Đây là đột biến làm thay đổi axit amin Asparagine thành Lysine, xảy ra tại vị trí axit amin thứ 152 trên chuỗi protein. Đột biến làm biến đổi một axit amin trung tính, không tích điện thành một axit amin mang tính kiềm tích điện dương. Sự thay đổi điện tích của axit amin sẽ làm biến đổi ái lực liên kết ion trong phân tử protein. Mô hình cấu trúc 3D của đột biến cho thấy, đột biến làm mất hai cầu nối hydro giữa Lysine và Arginine ở vị trí p.156 (Hình 3.24). Sự thay đổi về liên kết hydro sẽ làm ảnh hưởng đến sự tương tác giữa các axit amin, làm ảnh hưởng đến mối liên kết chung trong phân tử protein, vì thế có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của protein. Dự đoán trên có cơ sở thực tế vì biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này rất điển hình của bệnh TSTTBS nguyên nhân do suy giảm11β-hydroxylase: bộ phận sinh dục ngoài của nữ nhưng có kiểu hình của nam, xạm da, K+ giảm, 17OHP tăng. 83 Hình 3.24. Mô hình cấu trúc 3D của đột biến p.N152K A: Mô hình bình thường. B: Mô hình đột biến 3.3.3. Đột biến vùng trượt gen IVS6+5G>T Để phân tích đột biến có nằm trên vùng ranh giới giữa exon và intron, chúng tôi sử dụng chương trình MaxEntScan phân tích trình tự vùng ranh giới (Splicing site sequence), được thiết kế bởi tác giả Yeo và Burge (Yeo and Burge, 2004- Chương trình này sẽ so sánh giữa trình tự chuẩn không mang đột biến (gcgGTGGGT) và trình tự mang đột biến (gcgGTGGTT) (3 nucleotide cuối exon 6 và 6 nucleotide đầu intron 6) qua các giá trị MaxENT (Maximum entropy model), giá trị MDD (Maximum Dependence Decomposition Model) và giá trị PWM (Position weight matrix). Điểm càng thấp thì nucleotide đó càng có khả năng nằm trong vùng trượt gen. Đột biến IVS6+5G>T là đột biến ở vị trí nucleotide số 5 ở intron 6 có giá trị MaxEnt là -2.03 (chỉ số MaxEnt của trình tự bình thường là 6.60); chỉ số MDD là 1.88 (chỉ số MDD của trình tự bình thường là 10.38); chỉ số PWM là 1.87 (chỉ số PWM của trình tự bình thường là 5.77). Kết quả này có thể giả thuyết rằng đột biến G được thay thế bằng T ở nucleotide số 5 trên vùng intron 6 có khả năng nằm ở vùng ranh giới exon-intron và có khả năng làm thay đổi quá trình phiên mã mRNA. 84 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. CÁC ĐỘT BIẾN PHÁT HIỆN TRÊN GEN CYP11B1 Ở C