Luận án Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang

h phần phản ứng kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 và R1.2 Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Chu trình phản ứng dNTPs 5mM Buffer 10X F1.2 0,6m M R1.2 0,6mM ADN khuôn ARNse - free water Taq polymerase 1,0 2,5 0,3 0,3 1,0 19,6 0,3 95ºC/5 phút 95ºC/30 giây 60ºC/30 giây 30 chu kỳ 72ºC/30 giây 72ºC/5 phút Tổng 25 * Tinh sạch vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 được tinh sạch bằng cách sử dụng bộ Kit PurelinkTMPCR purification Kit của hãng Invitrogen (Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau: 1. Bổ sung 200 µl đệm gắn (binding buffer) vào 50 µl plasmid. Trộn đều. 2. Chuyển toàn bộ mẫu sang cột tách. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. 3. Loại bỏ dịch qua cột. 4. Bổ sung 650 µl đệm rửa (washing buffer) vào cột, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. 5. Loại bỏ dịch qua cột. 6. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại hết dịch. 7. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml. 8. Bổ sung 50 µl ARNse- free water vào giữa cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. 9. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút. Thu dịch qua cột. 10. Điện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch trên gel agarose 1%. 58 * Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 Gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 được xác định trình tự gen bằng phương pháp giải trình tự gen tự động trên máy ABI 3100. Kết quả được xử lý trên phần mềm PC/Gen và được so sánh với trình tự đã được công bố trong Ngân hàng gen quốc tế bằng chương trình BLAST (Basis Local Aligment Search Tool) qua dữ liệu của DDGJ EMBL để tìm xem mức độ tương đồng của chủng nghiên cứu với loài nào là lớn nhất. 2.3.2.3. Các phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi * Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector biểu hiện Tiến hành - Tính nồng độ vector và nồng độ mẫu ADN trong trường hợp nối đầu so le (tỷ lệ về số mol giữa vector : đoạn gen RoTAT 1.2 chèn là 1 : 4) - Tính các thành phần còn lại cho 1 phản ứng và mix phản ứng. Phản ứng kết nối đoạn ADN vừa tinh sạch vào vetor tách dòng được thực hiện trong hỗn hợp sau: Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector biểu hiện Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nước khử ion 2 Đệm T4 ligase (10X) 2 Gen RoTAT 1.2 (100 ng) 12 Vector pET28a(+) (20 ng) 2 Enzyme T4 ligase (1 u/1 µl) 2 Tổng thể tích 20 Phản ứng kết nối được thực hiện trong 2 giờ ở nhiệt độ 22oC. Sau khi kết thúc, hỗn hợp dùng để biến nạp hoặc lưu giữ ở tủ lạnh - 20oC. 59 * Phương pháp biến nạp vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 vào tế bào vi khuẩn Tiến hành - Bổ sung 1 µl vector tái tổ hợp vào ống tế bào khả biến (50 - 100 µl). - Để ổn định trong nước đá trong vòng 15 phút. - Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây, sau đó để trong nước đá 15 phút. - Bổ sung 400 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong 1 giờ, ở 37oC. - Cấy trải (100 - 150 µl) trên môi trường thạch LB chứa ampicillin (100 mg/l). - Nuôi cấy ở tủ ấm 37oC trong 12 giờ. * Phân tích vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn Để xác định chính xác ADN ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn, vector tái tổ hợp mang gen tái tổ hợp đã lựa chọn được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra. Enzyme giới hạn là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn ADN với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn ADN đó và cắt cả hai sợi của phân tử ADN. Các enzyme giới hạn thường được sử dụng để cắt ADN: (i) Tạo đầu bằng, như SalI, EcoRV cắt hai sợi ADN tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như HindIII, BamHI cắt theo vị trí lệch nhau trên hai sợi, tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Sau khi đã tách dòng thành công bằng các vector tách dòng, ADN plasmid thu được từ tách chiết plasmid tái tổ hợp cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt kiểm tra bao gồm: EcoRI, SalI, PstI, NcoI. Các dung dịch đệm thích hợp cho từng loại enzyme như sau: EcoRI và SalI (dung dịch đệm NEB3), PstI và NcoI (dung dịch đệm O). Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần: buffer 1,0 µl; ADN plasmid 8,0 µl; enzyme cắt 1,0 µl. Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 37°C trong 2 giờ, kiểm tra kết quả bằng điện di agarose 1%. 60 * Biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3) mang gen tái tổ hợp trên môi trường có chất cảm ứng IPTG Thu một khuẩn lạc trên đĩa biến nạp cấy vào 2 ml môi trường LB + ampicillin 100 µg/ml, nuôi lắc ở 37°C trong 12 giờ. Hút 200 µl dịch canh trùng bổ sung vào 2 ml LB + ampicillin 100 µg/ml, nuôi lắc trong 3 giờ ở 37°C. Sau 3 giờ, bổ sung 20 µl chất cảm ứng IPTG 100 mM, nuôi lắc ở 37°C trong 4 giờ. Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút, thu sinh khối tế bào. Rửa sinh khối tế bào bằng 200 µl Tris-HCl, pH = 6,8. Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút, thu sinh khối tế bào. Hòa tan sinh khối trong 30 µl Urea 8M. Ủ ở 37°C trong 30 phút. Ủ tiếp ở 95°C trong 5 phút. Ly tâm 12.000 vòng /phút trong 10 phút, thu dịch. Thêm 10 µl dung dịch đệm (0,5M Tris-HCl pH = 6,8, 24% glycerol, 8% SDS, 1M DTT, 0,4% Coomasive Brilliant Blue G-250) vào 10µl dịch. Ủ ở 95°C trong thời gian 5 phút. Điện di Tricine - SDS PAGE với nồng độ gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra. * Phương pháp tinh sạch protein Tiến hành Tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 100 ml môi trường thạch LB lỏng có bổ sung ampicillin và cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng là 0,1 mM, trong khoảng thời gian 5 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. - Ly tâm 400 ml dịch khuẩn 8.000 vòng/phút trong 15 phút rồi tiến hành thu cặn. - Thêm 15 ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer). - Ủ trong đá 5 phút. - Siêu âm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 30 giây/lần, trong 20 phút. - Chia nhỏ dung dịch ra các ống eppendorf 2 ml, tiến hành ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút, rồi thu dịch. - Phần dịch nổi chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột Nickel - Chelating Resin đã chuẩn bị truớc. 61 - Đảo nhẹ để giữ resin lơ lửng trong dịch nổi có chứa protein khoảng 1 giờ. - Lắng resin rồi thu dịch, bảo quản ở tủ 4oC để điện di kiểm tra. - Rửa cột với 8 ml đệm rửa (washing buffer) với thành phần: 50 ml dung dịch đệm tinh sạch (Native rification buffer) (250 mM NaH2PO4, pH = 8,0, 2,5 mM NaCl), 335 μl dung dịch imidazole 3 mM, pH = 6,0; đảo nhẹ cho resin lơ lửng, rồi lắng resin, thu dịch để ở tủ 4oC để điện di kiểm tra. - Lặp lại bước trên 3 lần. - Bổ sung 9 ml đệm hòa tan (Native Elution Buffer) để protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng đệm hòa tan có thành phần 50 mM NaH2PO4; pH = 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazole và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%. * Phương pháp điện di protein Tiến hành - Bước 1. Chuẩn bị gel SDS - PAGE: Bản gel gồm có gel phân cắt và gel phân tách protein được đổ khuôn và tạo các giếng chứa protein - Bước 2. Nhỏ mẫu: Kháng nguyên được pha loãng ở các nồng độ nồng độ khác nhau và nhuộm bằng thuốc nhuộm có chứa commasie blue và  - mercaptho ethanol rồi biến tính protein ở 95oC/5 phút. Nhỏ 15 - 20 µl mẫu vào mỗi giếng, và 10 µl marker chuẩn trên một giếng. - Bước 3. Điện di: Quá trình điện di thực hiện ở hiệu điện thế 120 V đến khi màu thuốc nhuộm chạy đến chân bản gel tách. - Bước 4. Nhuộm gel: Bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomassie blue R-250 0,1% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và có lắc. - Tẩy màu bằng dung dịch tẩy trên máy lắc, thay dung dịch tẩy khoảng 2 - 3 lần đến khi thấy các vạch điện di xuất hiện. * Phản ứng Western blot Tiến hành phản ứng: Điện di biến tính protein trên gel Tricine - SDS. Chuẩn bị màng lai: Hoạt hóa màng PVDF trong methanol khoảng 15 giây rồi rửa lại bằng nước cất 3 lần. Chuyển sang dung dịch đệm chuyển màng. Ngâm giấy thấm dùng cho điện chuyển trong dung dịch đệm chuyển màng. 62 Chuyển màng: Xếp màng PVDF và gel trong hệ thống chuyển màng theo thứ tự giấy thấm - màng PVDF - gel - giấy thấm. Lắp hệ thống chuyển màng, chuyển màng ở 100 mA trong 1 giờ 30 phút. Sau khi chuyển, màng được rửa trong PBS - T trong 5 phút, lắc nhẹ. Phủ bề mặt (blocking) màng bằng đệm phủ (blocking buffer) trong 1 giờ và lắc. Phủ kháng thể sơ cấp (kháng thể kháng RoTAT 1.2): Ủ màng trong 5 ml dung dịch chứa kháng thể sơ cấp với độ pha loãng thích hợp, lắc ở 20°C trong 12 giờ. Rửa màng 3 lần bằng PBS - T, mỗi lần 5 phút, lắc nhẹ. Phủ kháng thể thứ cấp cộng hợp enzyme peroxydase (kháng thể kháng kháng thể sơ cấp có cộng hợp peroxydase): Ủ màng trong 5 ml dung dịch chứa kháng thể 2 với độ pha loãng thích hợp, lắc 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa màng 3 lần bằng PBS - T, mỗi lần 5 phút, lắc nhẹ. Hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất TMB cho đến khi hiện băng. Kiểm tra kết quả dưới ánh sáng thường. * Phương pháp nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli Với mục đích thu được lượng lớn protein tái tổ hợp RoTAT 1.2, chủng E. coli chứa vector tái tổ hợp được nuôi cấy trong các điều kiện (pH môi trường, nồng độ kháng sinh, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG và thời gian, nhiệt độ cảm ứng) khác nhau để lựa chọn được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất. Sau đó, mẫu được chạy điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra kết quả. Mỗi giếng chạy 10 l mẫu để so sánh sự biểu hiện của gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong các điều kiện khác nhau. 2.3.2.4. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 * Tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex để phát bệnh tiên mao trùng Kháng nguyên và hạt latex có bản chất rất khác nhau. Chính vì vậy, để chế tạo được Kit, tiến hành kết hợp thử nghiệm kháng nguyên và hạt latex với các nồng độ và tỷ lệ khác nhau, ở điều kiện khác nhau. Từ đó, đánh giá và xác định được lượng kháng nguyên - hạt latex và điều kiện phản ứng phù hợp để tạo được phức hợp bền vững nhất. 63 * Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit CATT trên trâu thí nghiệm - Gây nhiễm tiên mao trùng T. evansi cho 7 trâu để lấy mẫu huyết thanh (+) và sử dụng 76 trâu không nhiễm tiên mao trùng để lấy mẫu huyết thanh (-). Kiểm tra bằng phương pháp tiêm truyền chuột để khẳng định trâu đã nhiễm (+) và không nhiễm tiên mao trùng (-). - Lấy mẫu huyết thanh trâu thí nghiêm: Mỗi trâu (+) lấy mẫu máu 7 lần ở 7 thời điểm khác nhau sau gây nhiễm; Mỗi trâu (-) chỉ lấy mẫu máu 1 lần. Tổng số mẫu đã lấy gồm 49 mẫu huyết thanh (+) và 76 mẫu huyết thanh (-). - Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit. Các mẫu huyết thanh (+) và (-) với tiên mao trùng được sử dụng để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng khi dùng Kit. + Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng được xác định theo bảng và công thức dưới đây: Kết quả Bị nhiễm tiên mao trùng Không bị nhiễm tiên mao trùng Tổng số Xét nghiệm (+) a b a + b Xét nghiệm (-) c d c + d Tổng số a + c b + d a + b + c + d Độ nhạy của phản ứng (Se) = a/(a + c) Độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) = d/(b + d) 2.3.2.5. Phương pháp nghiên cứu điều kiện bảo quản Kit Tiến hành bổ sung lần lượt các chất ức chế phân giải protein, chất ổn định protein và chất diệt khuẩn và bảo quản Kit ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Sau đó, xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng khi sử dụng Kit tại các thời điểm khác nhau. Từ đó, xác định điều kiện phù hợp để bảo quản Kit. 2.3.2.6. Phương pháp thử nghiệm Kit CATT chế tạo để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu ở thực địa Thử nghiệm Kit CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên 550 trâu ở các địa phương, sau đó so sánh hiệu quả chẩn đoán của Kit CATT, kỹ thuật ELISA với phương pháp tiêm truyền chuột. Bằng phương pháp tiêm truyền chuột, chúng tôi đã xác định được chính xác trong 550 trâu này có 66 con dương tính, 484 con âm tính 64 với T. evansi. Từ đó, xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo âm tính và giá trị dự báo dương tính; so sánh hiệu quả chẩn đoán của các phương pháp trên với phương pháp tiêm truyền chuột. Giá trị dự báo âm tính và giá trị dự báo dương tính được tính như sau: Kết quả Bị nhiễm tiên mao trùng Không bị nhiễm tiên mao trùng Tổng số Xét nghiệm (+) a b a + b Xét nghiệm (-) c d c + d Tổng số a + c b + d a + b + c + d Giá trị dự báo âm tính (%) = [a/(a+b)] × 100 Giá trị dự báo dương tính (%) = [c/(c+d)] × 100 Trong đó: + a: số mẫu dương tính thật + b: số mẫu dương tính giả + c: số mẫu âm tính giả + d: số mẫu âm tính thật 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện (2008) [31], trên phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Minitab 14.0, các phần mềm tin - sinh học gồm các chương trình ChromasLite, SeqEd1.3, MacVector8.2, GenDoc2.7 và MEGA6.06. 65 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang Nhằm nghiên cứu tình hình nhiễm tiên mao trùng, chúng tôi đã tiến hành lấy 905 mẫu máu trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang, trong đó có: 132 mẫu tại huyện Sơn Dương, 257 mẫu ở Yên Sơn, 264 mẫu ở Hàm Yên và 252 mẫu ở huyện Chiêm Hóa. Bằng phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng, chúng tôi đã xác định được tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại Tuyên Quang. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang Địa phƣơng (Huyện) Số trâu kiểm tra (con) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các huyện Yên Sơn 257 28 10,89 χ2Yên Sơn, Hàm Yên = 0,684 P = 0,408 χ2 Hàm Yên, Chiêm Hóa = 0,931 P = 0,334 χ2 Chiêm Hóa, Sơn Dương = 1,674 P = 0,196 χ2 Yên Sơn, Sơn Dương = 0,019 P = 0,889 χ2 Hàm Yên, Sơn Dương = 0,286 P = 0,593 χ2 Yên Sơn, Chiêm Hóa = 3,137 P = 0,077 Hàm Yên 264 35 13,26 Chiêm Hóa 252 41 16,27 Sơn Dương 132 15 11,36 Tính chung 905 119 13,15 χ2tính chung = 3,664 P = 0,300 Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: Trong tổng số 905 trâu kiểm tra tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang có 13,15% số trâu nhiễm tiên mao trùng. Kết quả nghiên cứu của Nguyen Q. D. và cs. (2013) [79] cho thấy, tỷ lệ trâu nhiễm tiên mao trùng ở Thái Nguyên và Cao Bằng là 66 22,4%. Nghiên cứu về bệnh tiên mao trùng ở 5 tỉnh Miền Bắc, Nguyen T. T. và cs. (2014) [80] cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên trâu là 27,1%. Như vậy, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại tỉnh Tuyên Quang là không cao so với các tỉnh trên, tuy nhiên do tính chất nguy hiểm của bệnh tiên mao trùng nên tỷ lệ nhiễm này rất có ý nghĩa trong dịch tễ học của bệnh. Đồng thời, theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) [17], ở tỉnh Tuyên Quang nói chung, ở 4 huyện Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa và Sơn Dương nói riêng có số lượng ruồi, mòng hút máu khá nhiều nên bệnh sẽ rất dễ lây lan từ trâu, bò nhiễm tiên mao trùng sang những trâu, bò khỏe. Qua bảng 3.1 cũng cho thấy, tỷ lệ trâu nhiễm tiên mao trùng giữa các huyện trong tỉnh không giống nhau. Trâu nuôi ở huyện Yên Sơn có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (10,89%). Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu của huyện Chiêm Hóa là cao nhất (16,27%). Như vậy, theo kết quả kiểm tra cho thấy, ở các huyện nói trên đều có trâu bị nhiễm tiên mao trùng. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang được thể hiện rõ hơn qua biểu đồ ở hình 3.1. 10,89 13,26 16,27 11,36 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Yên Sơn Hàm Yên Chiêm Hóa Sơn Dương Tỷ lệ nhiễm (%) Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang 67 Số liệu ở bảng 3.1 và biểu đồ ở hình 3.1 biểu thị tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu của các huyện có sự khác nhau. Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê so sánh tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng giữa các huyện lại cho thấy sự sai khác này không rõ rệt (P > 0,05). Nguyên nhân bệnh tiên mao trùng xuất hiện phổ biến ở cả 4 huyện có thể là do tỉnh Tuyên Quang nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm và mưa nhiều, là điều kiện thuận lợi cho các loài ruồi, mòng phát triển. Khi ruồi, mòng hút máu của những con trâu bị bệnh rồi lại đốt và hút máu những trâu khỏe thì sẽ truyền tiên mao trùng sang những trâu này. Vì vậy, khi trong đàn trâu có một con bị nhiễm tiên mao trùng thì những con trâu khác sẽ có nguy cơ bị nhiễm tiên mao trùng rất cao. Ngoài ra, bệnh thường diễn ra ở thể mạn tính, trâu bị bệnh gầy dần, giảm sức sản xuất, không được xét nghiệm để phát hiện căn bệnh, ít được người chăn nuôi chú ý phòng trị. Đây cũng là một trong những nguyên nhân làm cho bệnh dễ lây lan và tỷ lệ nhiễm của đàn trâu là phổ biến. Mặt khác, trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi nhận thấy, người chăn nuôi ở nhiều địa phương chưa thực sự chú ý đầu tư cho chăn nuôi trâu, công tác vệ sinh thú y môi trường chăn nuôi còn kém, vấn đề chăm sóc, quản lý và sử dụng đàn trâu còn chưa hợp lý, đặc biệt là chưa có hộ chăn nuôi nào sử dụng biện pháp tiêu diệt và hạn chế sự phát triển của côn trùng hút máu truyền bệnh. Những nguyên nhân trên dẫn đến trâu, bò có nguy cơ bị nhiễm và phát bệnh tiên mao trùng rất cao. Vì vậy, người chăn nuôi trâu, bò ở các địa phương cần chú ý thực hiện các biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu để tránh những thiệt hại do bệnh gây ra. 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang Ở mỗi lứa tuổi, vật nuôi có các đặc điểm sinh trưởng, phát triển, sinh lý, các điều kiện sống và môi trường sống khác nhau. Chính vì vậy, lứa tuổi trâu cũng có thể là yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng nói riêng. Đây là một chỉ tiêu nhằm xác định trâu ở lứa tuổi nào dễ cảm nhiễm với tiên mao trùng nhất để từ đó có kế hoạch phòng, trị bệnh thích hợp và hiệu quả. Trong quá trình lấy mẫu tại các địa phương, chúng tôi đã thu thập thông tin về tuổi của trâu và đã xác định được tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu nuôi tại 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang theo lứa tuổi. 68 Kết quả về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi của trâu trình bày ở bảng 3.2 và đồ thị hình 3.2. Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu Tuổi trâu (tuổi) Số trâu kiểm tra (con) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi ≤ 2 125 8 6,40 χ2≤2, >2-5 = 1,696 P = 0,193 χ2>2-5, >5-8 = 2,418 P = 0,120 χ2>5-8, >8 = 8,337 P = 0,004 χ2≤2, >8 = 17,579 P = 0,000 χ2>2-5, >8 = 17,611 P = 0,000 χ2≤2, >5-8 = 5,272 P = 0,022 > 2 - 5 348 36 10,34 > 5 - 8 322 46 14,29 > 8 110 29 26,36 Tính chung 905 119 13,15 χ2tính chung = 24,566 P = 0,000 Tỷ lệ nhiễm (%) 6,40 26,36 14,29 10,34 0 5 10 15 20 25 30 ≤ 2 > 2 - 5 > 5 - 8 > 8 (Tuổi) Hình 3.2. Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi 69 Bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy: Trâu nuôi tại 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang nhiễm tiên mao trùng ở tất cả các lứa tuổi. Tỷ lệ nhiễm ở trâu tăng dần theo tuổi. Trâu dưới 2 năm tuổi nhiễm với tỷ lệ thấp nhất (6,40%), tiếp đến là trâu 2 - 5 năm tuổi (10,34%), trâu 5 - 8 năm tuổi nhiễm với tỷ lệ cao hơn (14,29%), đặc biệt là những trâu trên 8 tuổi tỷ lệ nhiễm rất cao (26,36%). Theo kết quả xử lý thống kê, tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi của trâu sai khác rất rõ rệt (χ2tính chung = 24,566; P < 0,001), đặc biệt là tỷ lệ nhiễm giữa trâu 5 - 8 năm tuổi và trâu trên 8 năm tuổi, giữa trâu dưới 2 năm tuổi và trâu trên 8 năm tuổi, giữa trâu 2 - 5 năm tuổi và trâu trên 8 năm tuổi thì sự khác nhau là khá rõ rệt (P < 0,01). Chúng tôi giải thích kết quả về biến động tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi ở trâu như sau: Từ lúc mới sinh đến gần 2 năm tuổi là giai đoạn nghé theo mẹ và nhận được kháng thể từ mẹ truyền qua sữa, thời gian sống còn ít nên thời gian tiếp xúc với môi trường tự nhiên và vật môi giới truyền bệnh chưa nhiều. Vì vậy mà tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng thấp. Trâu 2 - 5 năm tuổi thường được chăn thả tập trung theo bầy đàn, đặc biệt là ở vùng núi, trâu thường được chăn thả trên các nương rẫy, các đồi núi cao với nhiều cây cối rậm rạp, ẩm thấp, nhiều côn trùng hoạt động. Do đó, trâu có nhiều cơ hội tiếp xúc với ruồi, mòng hút máu và truyền tiên mao trùng. Điều này dẫn đến sự lây lan tiên mao trùng và gây bệnh trên trâu ở lứa tuổi này cao hơn so với trâu dưới 2 năm tuổi. Đồng thời, nhiều trâu đã bị nhiễm tiên mao trùng nhưng không biểu hiện rõ triệu chứng lâm sàng của bệnh, không được dùng thuốc điều trị, bản thân chúng trở thành vật mang trùng, có thể lây truyền bệnh cho những con khỏe mạnh khác. Trong khi đó, khâu vệ sinh chuồng trại, diệt côn trùng môi giới trung gian truyền bệnh tại địa phương chưa được thực hiện tốt nên trâu nuôi càng lâu năm thì thời gian tiếp xúc với côn trùng truyền bệnh càng nhiều, làm cho tỷ lệ nhiễm tăng cao. Thực tế cho thấy, trâu trên 2 năm tuổi bắt đầu được đưa vào khai thác để phục vụ các mục đích lấy thịt, sinh sản, cày kéo, mua bán, trao đổi giữa các địa 70 phương. Điều này cũng góp phần làm tăng khả năng lây lan và tỷ lệ nhiễm bệnh. Những trâu được vận chuyển từ địa phương này sang địa phương khác thường có tỷ lệ phát bệnh cao. Đặc biệt, những trâu trên 8 năm tuổi do thời gian khai thác dài, sức đề kháng giảm nên tỷ lệ nhiễm cao và nhiều con thể hiện triệu chứng lâm sàng rõ rệt. Nếu không được điều trị kịp thời thì trâu gầy yếu dần và có thể chết khi sức đề kháng suy giảm. Trên thực tế, những trâu trên 10 năm tuổi vừa có khả năng sản xuất thấp, vừa có nguy cơ trở thành nguồn bệnh, làm bệnh lây lan trong đàn. Chính vì vậy, các địa phương nên chú ý loại thải trâu trên 10 năm tuổi có sức khỏe kém để loại trừ bớt nguồn bệnh trong tự nhiên. Phan Địch Lân (2004) [24] đã tổng hợp kết quả nghiên cứu tình hình nhiễm tiên mao trùng trên 3.172 trâu ở các tỉnh đồng bằng và cho biết: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,20 - 6,10%), trâu 3 - 5 năm tuổi nhiễm cao hơn (l0,60 - 12,70%), trâu 6 - 8 năm tuổi nhiễm cao nhất (12,90 - 14,80%), trâu trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổi. Theo Phan Văn Chinh (2006) [2], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở trâu, bò 4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất ở trâu, bò dưới 3 năm tuổi (6,92% và 2,31%). Nguyen Q. D. và cs. (2013) [79] đã nghiên cứu và cho biết, trâu lứa tuổi 5 - 8 nhiễm tiên mao trùng nhiều nhất so với với các lứa tuổi (27,60%). Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) [15] cho thấy, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu các lứa tuổi có sự khác nhau. Tỷ lệ nhiễm thấp nhất là ở trâu dưới 2 năm tuổi (4,35%); ở trâu 2 - 5 năm tuổi tỷ lệ nhiễm tăng lên (12,69%); trâu 5 - 8 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm là 20,51%, trâu trên 8 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất (21,62%). Như vậy, mặc dù đặc điểm thời tiết, khí hậu và điều kiện chăn nuôi có nhiều thay đổi (nhiệt độ cao dần lên, độ ẩm cũng tăng lên, kỹ thuật chăn nuôi cải thiện hơn so với nhiều năm trước đây), song quy luật nhiễm theo tuổi của trâu vẫn không thay đổi. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với kết quả nghiên cứu của các tác giả trên. 71 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt Để đánh giá ảnh hưởng của tính biệt đến tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu, chúng tôi đã xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu nuôi tại 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang theo tính biệt. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.3. Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt Tính biệt Số trâu kiểm tra (con) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) So sánh tỷ lệ nhiễm giữa trâu đực và trâu cái Đực 536 69 12,87 χ2đực, cái = 0,088 P = 0,767 Cái 369 50 13,55 Tính chung 905 119 13,15 Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt Qua kết quả bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy: Kiểm tra 536 trâu đực có 69 trâu nhiễm tiên mao trùng; trong 369 trâu cái được kiểm tra có 50 trâu bị nhiễm tiên mao trùng. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu đực là 12,87%, tỷ lệ nhiễm ở trâu cái là 13,55%. Theo đó, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu cái cao hơn so với trâu đực. Theo kết quả trên, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng giữa trâu đực và trâu cái có sự khác nhau, tuy nhiên qua xử lý thống kê cho thấy sự sai khác này không rõ rệt (P > 0,05). 72 Sự khác nhau nói trên có thể do nguyên nhân sau: ngoài việc cày kéo và lao tác như trâu, bò đực, trâu, bò cái còn đảm nhận chức năng sinh sản và nuôi con.