Luận án Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh

on phân tử ban đầu [M+H]+ = 216 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 81 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H6O. Hình 3.14. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất K m. Các ion sản phẩm của hợp chất tZ C10H13N5O C10H13N5 Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 24 V, OH- bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 220 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 202, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H13N5. C5H5N5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 30 V, C5H8O - bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 220 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 136 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5. C6H7N5 Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C4H5O - bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 220 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 148 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C6H7N5. Hình 3.15. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZ 55 Hợp chất tZ có khối lƣợng phân tử là 219 với công thức phân tử là C10H13N5O và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.15. Ở chế độ ion dƣơng [M+H] + , hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 220 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 220 là mảnh phổ 202 (mất đi 18 khối lƣợng); mảnh 136 (mất đi 84 khối lƣợng) và mảnh 148 (mất đi 52 khối lƣợng). Theo đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ tZ đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.15. n. Các ion sản phẩm của hợp chất tZR Hợp chất tZR có khối lƣợng phân tử là 351 với công thức phân tử là C15H21N5O5 và công thức hóa học đƣợc trình bày ở Hình 3.16. Ở chế độ ion dƣơng [M+H] + , hợp chất này có khối lƣợng phân tử là 352 với mảnh phổ nhƣ trong Hình 3.2. Các ion sản phẩm đƣợc phân mảnh từ mảnh 352 là mảnh phổ 220 (mất đi 31 khối lƣợng); mảnh 202 (mất đi 300 khối lƣợng) và mảnh 136 (mất đi 116 khối lƣợng). Theo đó, các mảnh khối lƣợng bị mất đi và các ion sản phẩm đƣợc hình thành từ tZR đƣợc giả thiết nhƣ Hình 3.16. C10H13N5O Ion sản phẩm 1: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 22 V, C4H9O4 - bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 352 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 220, tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H13N5O. C15H21N5O5 C10H13N5 Ion sản phẩm 2: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 28 V, C4H9O4 - và OH - bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 352 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 202 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C10H13N5. C5H5N5 Ion sản phẩm 3: xảy ra ở mức năng lƣợng phân mảnh CE = 31 V, C4H9O4 - và C5H9O - bị tách khỏi ion phân tử ban đầu [M+H]+ = 352 tạo thành ion sản phẩm [M+H]+ = 136 tƣơng ứng với hợp chất có CTPT là C5H5N5. Hình 3.16. Các hƣớng phân mảnh và ion sản phẩm của hợp chất tZR 56 3.1.1.3. Khảo sát các thông số của nguồn ion hóa Sau khi xác định đƣợc các điều kiện chuyển hóa ion của hệ thống MS, điều kiện của nguồn ion hóa phun điện tử tiếp tục đƣợc khảo sát với sự có mặt có hệ dung môi pha động. Hỗn hợp dung dịch chuẩn của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật có nồng độ 1 µg.mL-1 đƣợc tiêm vào hệ thống LC kết hợp với các dung môi pha động gồm MeOH (+0,1 FA) và nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA, tốc độ dòng 0,5 mL.phút -1 , không dùng cột sắc ký. Phần mềm Xcalibur đƣợc sử dụng để điều chỉnh các thông số trên máy. Điều kiện phân tích khối phổ sau khi đƣợc tối ƣu hóa đƣợc thiết lập nhƣ sau: nhiệt độ nguồn phun 100oC, tốc độ dòng khí mang 25 L.phút -1 , tốc độ dòng khí bổ trợ 5 L.phút-1, tốc độ dòng khí quét buồng ion hóa 0 L.phút -1, điện thế nguồn phun của ion dƣơng và ion âm lần lƣợt là 3,6 kV và -3,0 kV, nhiệt độ ống mao quản 200oC, điện thế ống mao quản của ion âm là -31 V và ion dƣơng 4 V; và điện thế thấu kính hội tụ: ion âm là -125 V và ion dƣơng là 70 V (Bảng 3.2). Tất cả các chất rửa giải đƣợc theo dõi theo chế độ giám sát phản ứng chọn lọc. Để gia tăng độ nhạy của hệ thống, các chƣơng trình phân tách đƣợc thực hiện dựa trên cơ sở ổn định thời gian lƣu để các ion chỉ rửa giải trong một thời gian lƣu nhất định. Bảng 3.2. Các thông số của nguồn ion đƣợc tối ƣu hóa TT Thông số Đơn vị Giá trị tối ƣu 1 Nhiệt độ nguồn oC 100 2 Tốc độ dòng khí mang L/phút 25 3 Tốc độ dòng khí bổ trợ L/phút 5 4 Tốc độ dòng khí quét buồng ion hóa L/phút 0 5 Điện thế nguồn phun - Ion âm - Ion dƣơng kV kV -3,0 3,6 6 Nhiệt độ ống mao quản oC 200 7 Điện thế ống mao quản - Ion âm - Ion dƣơng V V -31 4 8 Điện thế thấu kính hội tụ: - Ion âm - Ion dƣơng V V -125 70 57 Nhƣ vậy với các điều kiện của nguồn ion hóa khối phổ đƣợc tối ƣu cho phép phân tích các hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh, trong đó, mỗi hợp chất xác định đƣợc 2 ion sản phẩm tƣơng ứng phục vụ cho việc định lƣợng và xác nhận chúng. Điều này đảm bảo yêu cầu về tính chọn lọc của một phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng các chất theo yêu cầu của Liên minh Châu Âu [118]. 3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng 3.1.2.1.Khảo sát cột phân tích và dung môi pha động Pha tĩnh trong sắc ký lỏng đóng vai trò phân tách các chất phân tích với nhau và các thành phần khác có trong mẫu. Trong nghiên cứu này, các cột pha đảo Hypersil và Purospher đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật. Đây là các cột sắc ký lỏng phổ biến với nhiều ƣu điểm nhƣ: phạm vi ứng dụng rộng, khả năng phân tách các chất phân tích ổn định, phù hợp với việc sử dụng các dung môi phân cực nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớc (rẻ tiền). Bên cạnh đó, ƣu điểm của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ là khả năng nhận biết các chất theo tỷ số khối lƣợng trên điện tích nên đảm bảo cho việc phát hiện tín hiệu của các chất phân tích. Đây đƣợc xem là một trong những kỹ thuật phổ biến đang đƣợc sử dụng trong việc nghiên cứu phân tách các chất ở nhiều cơ quan, đơn vị nghiên cứu và các trƣờng đại học ở Việt Nam. Pha động sử dụng cho hệ thống sắc ký lỏng là các dung môi có độ phân cực cao, có ảnh hƣởng đến quá trình phân tách của các chất, quá trình ion hóa và tín hiệu của các chất phân tích. Các pha động đƣợc bổ sung thêm axít để cải thiện hình dáng của các píc sắc ký và cung cấp proton H+ trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dƣơng. Dung dịch 0,1% FA đƣợc tạo thành bằng cách pha 1 mL axít foocmic trong 1 L dung môi pha động. FA và MeOH là các dung dịch đƣợc nhiều nhà khoa học sử dụng trong việc phân tích, xác định và định lƣợng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong các mô thực vật sử dụng thiết bị sắc ký lỏng ghép nối với khổi phổ [119, 120]. Bên cạnh đó, ACN cũng là dung môi đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu sử dụng trong việc phân tách các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong các mẫu sinh học [121, 122]. Do đó, trong nghiên cứu này, nghiên cứu sinh đã khảo sát và đánh giá hiệu quả phân tách, rửa giải các chất kích thích sinh 58 trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh giữa hệ dung môi pha động khác nhau, gồm: ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA và MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA. Bên cạnh đó, khả năng phân tách của các cột sắc ký Hypersil và Purospher đƣợc đánh giá đồng thời cùng với các hệ dung môi pha động thí nghiệm. a. Kết quả khảo sát trên cột Hypersil Hình 3.17. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 Kết quả khảo sát khả năng phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật của cột sắc ký Hypersil cho thấy: khi sử dụng hệ pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc (Ion hóa âm) (Ion hóa dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 59 siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 thì hầu hết các chất phân tích đƣợc phân tách hoàn toàn với tín hiệu píc rõ ràng. Tuy nhiên, có 2 hợp chất phân tích theo chế độ ion hóa âm là ICA và IPA rửa giải không hoàn toàn và một hợp chất phân tích theo chế độ ion hóa dƣơng là tZ có píc sắc ký bị chẻ ngọn, chân píc rộng khoảng 1,0-1,2 phút (Hình 3.17). Ở điều kiện tƣơng tự khi sử dụng hệ pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA cho thấy tất cả các chất kích thích sinh trƣởng thực vật phân tích theo hai chế độ ion hóa âm và ion hóa dƣơng trên cột Hypersil có píc sắc ký rõ ràng, sắc nét, với chân píc gọn và độ rộng chân píc khoảng 0,3-0,6 phút (Hình 3.18). Hình 3.18. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Hypersil sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR (Ion hóa âm) (Ion hóa dƣơng) 60 b. Kết quả khảo sát trên cột Purospher Kết quả khảo sát khả năng phân tách các chất KTST trên cột Purospher sử dụng hệ dung môi ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA đƣợc biểu thị ở Hình 3.19 và Hình 3.20. Ở điều kiện tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1, hầu hết các chất phân tích theo chế độ ion hóa âm có tín hiệu không rõ ràng, trong khi đó, các hợp chất phân tích theo chế độ ion hóa dƣơng có píc sắc ký tù, chân píc choãi, độ rộng của chân píc lên tới 5-6 phút. Khi tăng tốc độ dòng lên 0,3 mL.phút-1 thì nhiều hợp chất phân tích theo chế độ ion hóa âm không xuất hiện tín hiệu nhƣ: IAA, IBA, IPA và GA4; và tất cả các hợp chất phân tích theo chế độ ion hóa dƣơng rửa giải không hoàn toàn với hình dạng píc xấu, chẻ ngọn và chân píc rộng 1-2 phút. Hình 3.19. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR (Ion hóa âm) (Ion hóa dƣơng) 61 Hình 3.20. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1 Khi sử dụng hệ pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 để rửa giải các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trên cột sắc ký Purospher cho thấy tất cả các chất nghiên cứu có tín hiệu píc không rõ ràng và độ nhiễu cao, một số chất khác không xuất hiện tín hiệu (Hình 3.21). Khi tăng tốc độ dòng dung môi lên 0,3 mL.phút-1, các hợp chất ICA, IPA, GA4, K, Z, tZ, iPR, tZR và DHZR có píc sắc ký rõ ràng, sắc nét với độ rộng chân píc khoảng 0,2-0,8 phút; trong khi đó, hai hợp chất iP và BA có tín hiệu nền tƣơng đối cao, và các hợp chất IAA, IBA, GA3 và GA7 không xuất hiện tín hiệu píc (Hình 3.22). Ở điều kiện tốc độ dòng dung môi pha động 0,5 mL.phút-1, các chất phân tích (Ion hóa âm) (Ion hóa dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 62 IAA, iP, iPR, tZ, tZR và BA có hình dạng píc đẹp, sắc nét, rõ ràng với độ rộng chân píc khoảng 0,2-0,3 phút; tuy nhiên, các hợp chất còn lại nhƣ: IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, K và DHZR không xuất hiện tín hiệu píc (Hình 3.23). Kết quả khảo sát ở tốc độ dòng 1 mL.phút-1 cho thấy, chỉ có hai hợp chất IPA và GA3 có tín hiệu píc rõ ràng; các hợp chất GA4, iP, K, tZ và BA có độ nhiễu tƣơng đối cao; các hợp chất IAA, IBA, ICA, GA7, iPR, tZR và DHZR không xuất hiện tín hiệu (Hình 3.24). Hình 3.21. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,1 mL.phút-1 ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR (Ion hóa âm) (Ion hóa dƣơng) 63 Hình 3.22. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,3 mL.phút-1 (Ion hóa âm) (Ion hóa dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 64 Hình 3.23. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 0,5 mL.phút-1 iP K tZ BA iPR tZR DHZR ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 (Ion hóa dƣơng) (Ion hóa âm) 65 Hình 3.24. Sắc ký đồ của các chất KTST đƣợc phân tách bởi cột Purospher sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng 1 mL.phút-1 Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng, có sự khác nhau về hiệu quả phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật khi sử dụng các hệ dung môi pha động khác nhau trên cùng một cột sắc ký nhƣ nhau; và khi sử dụng cùng một chế độ dung môi pha động, các cột sắc ký khác nhau có khả năng phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật khác nhau. Trong đó, cột sắc ký Hypersil cho hiệu quả phân tách các chất nghiên cứu ở cả hai chế độ ion hóa âm và ion hóa dƣơng tốt hơn so với cột Purospher. Việc sử dụng pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA cho kết quả phân tách các chất kích thích sinh trƣởng thực vật tốt hơn (Ion hóa dƣơng) (Ion hóa âm) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 66 so với pha động ACN (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA. Sự kết hợp của cột sắc ký Hypersil và pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA cho kết quả phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật tốt nhất với tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, cƣờng độ tín hiệu cao, chân píc hẹp và sắc nét. Do đó, cột Hypersil và pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA đƣợc lựa chọn và sử dụng để khảo sát các điều kiện phân tích khác phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này. 3.1.2.2. Khảo sát chế độ gradient của pha động Tốc độ dòng dung môi và chế độ rửa giải đƣợc khảo sát và đánh giá để lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp, đảm bảo các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu phân tích đƣợc phân tách hoàn toàn, với các píc có tín hiệu cao nhất, rõ ràng và cân đối, nhằm tiết kiệm thời gian phân tích mẫu, hóa chất, dung môi sử dụng và giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị phân tích. Nhiệt độ của cột sắc ký là một trong những yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng phân tách và thời gian rửa giải các chất phân tích, do đó, để tránh sự biến đổi của nhiệt độ môi trƣờng đến kết quả nghiên cứu, cột phân tích sắc ký đƣợc kiểm soát ở điều kiện 40oC để đảm bảo cho quá trình tách các chất đƣợc ổn định. Hỗn hợp chuẩn của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật có nồng độ 0,5 µg.mL-1 đƣợc sử dụng để khảo sát chế độ gradient của pha động. Điều kiện khối phổ: đƣợc kiểm soát theo các chế độ đƣợc tối ƣu hóa ở Bảng 3.1 và 3.2. Chế độ gradient của pha động sử dụng trong phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc khảo sát theo sự gia tăng của tỷ lệ dung môi rửa giải và tốc độ dòng dung môi tƣơng ứng với các gradient đƣợc mã hóa từ gradient 1-5. Kết quả khảo sát các chế độ gradient của pha động MeOH (+0,1% FA) + nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA đƣợc trình bày ở Bảng 3.3. 67 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát gradient của pha động (A = 0,1% FA; B = MeOH + 0,1% FA) Điều kiện gradient Tốc độ dòng Nhận xét Gradient 1 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=10%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10% Từ khi bắt đầu đến 2 phút 10% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút. 0,1 (mL.phút-1) Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,75-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA rửa giải chƣa hoàn toàn. Gradient 2 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=20%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10% Từ khi bắt đầu đến 2 phút 20% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút. 0,1 (mL.phút-1) Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,42-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA vẫn chƣa rửa giải hoàn toàn. Gradient 3 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=30%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10% Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút. 0,1 (mL.phút-1) Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,07-6,31 phút. Tất cả các hợp chất phân tích đƣợc rửa giải hoàn toàn và các píc gọn, sắc nét, cân đối, rõ ràng, độ rộng chân píc khoảng 0,2-0,5 phút. Gradient 4 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=30%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10% Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút. 0,3 (mL.phút-1) Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng có tín hiệu píc sắc ký đƣợc rửa giải sớm hơn so với tốc độ dòng 0,1 mL/phút với thời gian lƣu khoảng 1,5 phút. Gradient 5 đƣợc mã hóa theo % của MeOH là: 0-2p=30%; 2-10p↑90%; 10-13p=90%; 13-13,5p↓10%; 13-15p=10% Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% B, sau đó tăng lên 90% B từ 2 đến 10 phút, giữ 90% B trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tổng thời gian 15 phút. 0,5 Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng đƣợc phát hiện ở thời gian lƣu từ 0,8 đến 1,2 phút; sớm hơn so với các điều kiện gradient ở trên. Ghi chú: píc sắc ký của các gradient được trình bày ở phần Phụ lục 2. 68 Kết quả khảo sát điều kiện gradient của pha động trong phân tích các chất kích thích sinh trƣởng thực vật cho thấy: sự thay đổi của tỷ lệ dung môi MeOH (+0,1% FA) với nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA và tốc độ dòng dung môi có ảnh hƣởng rõ rệt đến tín hiệu của chất phân tích, hình dạng píc sắc ký và thời gian rửa giải của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật. Trong các gradient đƣợc khảo sát, gradient 3 có điều kiện phân tách tốt nhất, với tín hiệu chất phân tích rõ ràng, sắc nét, chân píc gọn, và các chất đƣợc rửa giải hoàn toàn, do đó điều kiện của gradient này đƣợc lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu phân tích đƣợc tách bằng cột sắc ký C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) và rửa giải bằng dung môi pha động MeOH (+0,1% FA) và nƣớc siêu sạch chứa 0,1% FA với tốc độ dòng dung môi là 0,1 mL.phút-1, trong tổng thời gian phân tích là 15 phút. Trong đó, tỷ lệ của các dung môi pha động có sự thay đổi theo thời gian rửa giải, thành phần dung môi methanol chiếm 30% trong 2 phút đầu tiên, sau đó tăng dần nồng độ đến 90% trong khoảng thời gian từ phút thứ 2 đến phút thứ 10 và duy trì ở tỷ lệ này trong khoảng 3 phút; tiếp đó tỷ lệ methanol đƣợc giảm xuống điều kiện ban đầu 30% trong thời gian 0,5 phút và duy trì cho đến hết chu trình gradient trƣớc khi chuyển sang phân tích các mẫu tiếp theo (Bảng 3.4). Bảng 3.4. Điều kiện gradient tối ƣu sử dụng phân tích các chất KTST trong rau Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL.phút -1 ) Kênh A: H2O (với 0,1% FA) Kênh B: MeOH (+0,1% FA) 0 0,1 70 30 2 0,1 70 30 10 0,1 10 90 13 0,1 10 90 13.5 0,1 70 30 15 0,1 70 30 69 3.2. Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc xây dựng và phát triển bằng cách biến đổi và bổ sung một số bƣớc cần thiết trong quy trình tách chiết các hoocmon thực vật ở loài cây Arabidopsis thaliana thuộc Họ Cải, ở Columbia theo nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự [83]. Đây là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện và có thể áp dụng cho nhiều đối tƣợng mẫu khác nhau. Tuy nhiên, lƣợng mẫu ban đầu sử dụng tƣơng đối ít nên sẽ không đảm bảo việc mang tính đại diện cho một mẫu nghiên cứu. Bên cạnh đó, dung dịch 1-propanol sử dụng trong phƣơng pháp là chất hữu cơ có nhóm –OH đính vào vị trí cuối trong cấu trúc phân tử làm cho chất này kém phản ứng, ít ổn định đồng thời hạn chế phạm vi ứng dụng của nó. Mặt khác, mẫu nghiên cứu chỉ đƣợc nghiền một cách đơn thuần, sau đó đƣợc chiết theo phƣơng pháp rắn lỏng thông thƣờng nên có thể một phần nhỏ các chất phân tích trong các mảnh vụn thực vật lớn sau nghiền không đƣợc chiết hết khỏi mẫu, do đó, có thể làm giảm hiệu suất chiết của phƣơng pháp. Phần dung dịch trong suốt ở lớp trên có thể chứa một lƣợng chất phân tích nhất định cần đƣợc phân tích nhƣng tác giả không sử dụng phần mẫu này. Hơn nữa, việc bơm trực tiếp mẫu không qua màng lọc vào thiết bị có thể là nguyên nhân ảnh hƣởng đến cƣờng độ tín hiệu của các chất phân tích cũng nhƣ tiềm ẩn nguy cơ gây tắc ống mao quản của thiết bị phân tích. Để khắc phục những hạn chế trên, dung dịch 1-propanol đƣợc thay thế bởi dung dịch 2-propanol, là dung dịch này có nhóm –OH gắn ở vị trí giữa của cấu trúc phân tử tạo nên các đặc tính đặc trƣng nhƣ: khả năng phản ứng mạnh hơn, ổn định hơn, và ít axít hơn, do đó, phạm vi ứng dụng của chất này rộng hơn. Bên cạnh đó, nghiên cứu sinh thực hiện các biến đổi trong quy trình xử lý mẫu và tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật với các bƣớc cụ thể nhƣ sau: 70 Hình 3.25. Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong các mẫu rau xanh đƣợc phát triển và tối ƣu hóa Bước 1: Mẫu rau sau khi thu thập đƣợc đông cứng trong nitơ lỏng chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ dƣới 0oC cho đến khi phân tích. Bước 2: Tiến hành nghiền nhỏ mẫu với khối lƣợng khoảng 1 kg, sau đó, cân chính xác một lƣợng 300 mg mẫu cho vào ống teflon 15 mL, có nắp vặn chặt. Bước 3: Thêm 3 mL 2-propanol/H2O/HCl (2:1:0.002, v/v/v) sau đó rung lắc mẫu với tốc độ 100 vòng.phút-1 trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 4oC. Tiến hành siêu âm mẫu trong thời gian 5 phút. Bƣớc 5: Lắc mẫu và chiết siêu âm Bƣớc 1: Đông cứng mẫu trong nitơ lỏng Bƣớc 2: Nghiền nhỏ và cân 300 mg mẫu vào ống ly tâm Teflon 15 mL Bƣớc 3: Lắc mẫu và chiết siêu âm Bƣớc 7: Hút 1 mL dung dịch lớp dƣới Bƣớc 8: Phân tích trên HPLC-ESI-MS2 Bƣớc 6: Ly tâm mẫu Bƣớc 4: Ly tâm mẫu và hút dịch lớp trên Dịch trong suốt 4000 vòng.phút-1, ở 4oC Lắc 30 phút, ở 4oC Siêu âm 5 phút Lắc 30 phút, ở 4oC Siêu âm 5 phút Thêm 3 ml 2-propanol/H2O/HCl Thêm 6 mL dichloromethane 4000 vòng.phút-1, ở 4oC Cô cạn bằng nitơ, hòa tan trong MeOH 71 Bước 4: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 ở điều kiện nhiệt độ 4oC trong thời gian 5 phút. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1mL phần dung dịch trong suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm cho vào eppendorf đựng mẫu có thể tích 2 mL. Bước 5: Thêm 6 mL dung dịch dichloromethane và rung lắc mẫu trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC, sau đó, tiếp tục chiết siêu âm trong thời gian 5 phút. Bước 6: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 trong thời gian 5 phút, có hai lớp chất lỏng khác nhau đƣợc hình thành sau ly tâm và các mảnh vụn thực vật phân bố ở giữa hai lớp. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch trong suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào eppendorf đựng phần dung dịch hút ra ở bƣớc 4. Tiến hành xoáy mẫu trên máy Votex trong thời gian 5 phút để trộn lẫn hai phần dung dịch này với nhau. Sau đó, dùng micropipet hút 1 mL mẫu cho vào lọ đựng mẫu 1,5 mL để phân tích trên máy HPLC-ESI-MS2. Bước 7: Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch của lớp phía dƣới ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào lọ thủy tinh có dung tích 15 mL. Tiến hành cô cạn bằng dòng khí nitơ, hoà tan các chất sau cô cạn bằng 1 mL dung môi MeOH. Bước 8: Thực hiện lọc mẫu qua màng lọc PTFE 0,22 µm trƣớc khi phân tích trên thiết bị HPLC-ESI-MS2.  Hàm lƣợng của các chất phân tích đƣợc xác định bằng tổng hàm lƣợng của các chất thu đƣợc ở các phân đoạn đƣợc thực hiện ở bƣớc 4, 6 và bƣớc 7. Kết quả so sánh hiệu quả tách chiết các chất kích thích sinh trƣởng thực vật của 1-propanol và 2-propanol theo quy trình nghiên cứu của Xiangqing và cộng sự [83] đƣợc biểu thị ở Hình 3.26. Quy trình sử dụng 1-propanol thu đƣợc hiệu suất chiết trung bình 66,93±4,84%. Trong đó, hiệu suất chiết cao nhất đạt 75% đƣợc phát hiện ở hợp chất ICA, tiếp đến là hợp chất tZ có hiệu suất 74%, sau đó là ba hợp chất GA4, iP và tZR có hiệu suất chiết 70%. Có 8 hợp chất có hiệu suất chiết trung bình đạt từ 62-68% gồm: DHZR, IBA, IPA, iPR, IAA, GA3, GA7 và K; đặc biệt, hiệu suất chiết thấp nhất đƣợc tìm thấy ở hợp chất BA với 57%. Đối vớ