Luận án Tách dõng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của Endochitinase từ Bacillus Thuringiensis phân lập ở Việt Nam - Trịnh Thị Thu Hà

MÔ ĐÀU 1

Chương 1: TONG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1. Vì khuấĩì Bacillus thuringiensis 5

ỉ.1.1. Sơ lược về B. thuringìensỉs 5

1.1.2. Sự phát triên và ứng dụng cùa chitinase từ B. thuringiensis trên thẻ giới 7

1.2. Chitinase tự nhiên 10

1.2.1. Nguồn gôc của chitinase 11

1.2.2. Phân loại chitinase 12

1.2.3. Cáu trúc của chitinase 14

1.2.4. Cơ chê hoạt động cùa chitinase 16

1.2.5. Các yêu tô ảnh hưởng đèn hoạt tính cùa chitinase 18

1.2.6. Các yêu tô ánh hưởng đèn quá trình sinh tông hợp chitinase 20

1.3. Chitinase tái tổ hợp ~ 22

1.3.1. Hệ biêu hiện Escherichiacoli 26

1.3.2. Một sô yêu tô ảnh hường đến quá trình lên men tông hợp chitinase

tải tố hợp 29

1.3.3. Thu hôi và tinh sạch chitinase tái tô hợp 30

1.4. Ú ng dụng của chitinase . 31

1.4.1. Trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường 31

1.4.2. ửng dụng trong công nghiệp 33

1.4.3. ửng dụng trong y dược 34

1.4.4. ứng dụng trong ước tinh sinh khối nấm 34

1.4.5. ứng dụng trong công nghệ sinh học. 35

1.5. Sơ lược về tình hình sâu bệnh hại cây trồng 36

IV

Chưong 2: VẶT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHẤP NGHIÊN CƯU 39

2.1. Vật liệu nghiên cứu 39

2.1.1. Chùng giống và plasmid 39

2.1.2. Thiết bị 39

2.1.3. Hóa chất 40

2.1.4. Môi trường n nôi cấy 40

2.1.5. Dung dịch 41

2.2. Phương pháp nghiên cứu 41

2.2.1. Phương pháp vi sinh 41

2.2.2. Phương pháp hỏa sinh 43

2.2.3. Phương pháp sinh học phân từ. 45

2.2.4. Tồi ưu diều kiện hiếu hiện theo phương pháp hề mật dàp ứng 52

2.2.5. Nghiên cứu tính chất hóa lý của chitinase rãi tố hợp 52

2.2.6. Phương pháp thừ nghiệm 54

2.2.7. Xừìýsồliệu 56

2.2.8. Sơ đo nghiên cứu 57

Chương 3: KÉT QUÁ NGHIÊN CƯU 58

3.1. Phân lập si khuân Bacillus thuringiensis có khá năng sinh

chitinase ờ Mệt Nam 58

3.1.1. Phân lập vi khuân B. thuringiensis 58

3.1.2. Phán loại dưới loài các chúng B. thuríngiensisphân lập 61

3.1.3. Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin cùa cảc chung B. thuringiensis

se ro var kurstaki 63

3.1.4. Sàng lọc gen endochitinase (ch ỈA) cùa các chúng B. thuringiensis

se ro var kurstaki 65

3.1.5. Sàng lọc hoạt tinh kháng nám của các chung B. thuringiensis

se ro var kurstaki 66

3.2. Kháo sát diều kiện sinh tổng họp chitinase cùa chúng Bacillus

thuringiensis var. kurstaki MSS1.1 66

3.2.1. ĩììờí gian nuôi cầy 67

3.2.2. Nhiệt độ nuôi cấy 67

3.2.3. Nguồn cơ chất 67

3.2.4. Nồng độ cơ chắt 68

3.2.5. pH môi trường nuôi cắy 68

3.2.6. Nguồn cacbon 69

3.2.7. Nguồn ni tơ 69

3.2.8. Môi trường thay thể 70

3.3. Nhân dòng gen chiA mã hóa chitinase từ chùng vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki MSSỈ.l 70

3.4 Biếu hiện gen chìA trong vi khuấn E coli BL21 74

3.4.1. Thiết kề vector biếu hiện gen chiA trong vi khuân E.coli BL21 74

3.4.2. Biểu hiện chiẢ tái tố hợp trong E. coìi BL2KDE3) 77

3.4.3. Nghiên cứu điều kiện biếu hiện gen chiA cùa chùng tái tố hợp 79

3.4.4. Tôi tru khá năng biêu hiện rChiA bang phương pháp bê mặt đáp

ứng 84

3.4.5. Kiếm tra sự tương thích giữa mỏ hinh và thực nghiệm 88

3.4.6. Tình sạch và xác định hoạt tinh cùa chitinase tái tố hợp 89

3.5. Nghiên cứu tính chất của chitinase tái tổ họp 90

3.5.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt 90

3.5.2. pH tồi tru và độ bền pH 91

3.5.3. Anh hưởng cùa ion kim loại và EDTA lén hoạt tinh chitinase 92

3.5.4. Anh hưởng cùa chất tẩy rửa 92

3.5.5. Anh hưởng cùa dung môi hữu cơ 93

3.5.6. Động học cùa phàn úng enzyme 93

3.5.7. Sàn phẩm cùa sự th ủy phán cơ chất bời chitinase 95

3.6. Thử nghiệm khã năng kháng nấm gây bệnh thực vật và tăng

hoạt tinh diệt sâu cùa chitinase tái tổ họp 95

3.6.1. Khá nâng khàng nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp 95

3.6.2. Hỗ trợ hoạt tinh diệt sâu Bộ cánh vấy cua chitinase rãi tô hợp 97

Chirong 4: BÀN LUẬN KÉT QUẢ 99

4.1. Phân lập si khuân Bacillus thuringiensis có khá năng sinh

chitinase ở Mật Nam 99

4.1.1. Phân lập vi khuân B. thuringiensis 99

4.1.2. Phân loại dưới loài kurstaki các chủng B. thuríngiensísphân lập. 100

4.1.3. Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin cùa cảc chung B. thuringiensis

serovar kurstaki 100

4.1.4. Sàng lọc gen endochitina.se (ch ỈA) cùa các chúng B. thuringiensis

se ro var kurstaki 101

4.1.5. Sàng lọc hoạt tinh kháng nẩm của các chùng B. íhuringien.sis

serovar kurstaki 101

4.2. Kháo sát diều kiện sinh tổng họp chitinase cũa chủng Bacillus

thuringiensis var. kurstaki MSS1.1 102

4.2.1. Thời gian nuôi cay 102

4.2.2. Nhiệt độ nuôi cấy 103

4.2.3. Nguồn cơ chất 103

4.2.4. Nồng dộ cơ chất 104

4.2.5. pH môi trường nuôi cầy 104

4.2.6. Nguồn các hon 105

4.2.7. Nguồn ni tơ 105

4.2.8. Môi trường thay thể 10Ố

4.3. Phân tích trình tự gen chiA và cấu trúc mô phóng cũa protein

Chi A 107

4.4. Biếu hiện rChiA trong vi khuấn E. coli BL21 (DE3) 108

4.4.1. Biếu hiện rChiA trong vi khuẩn 108

4.4.2. Tổi ưu điều kiện biếu hiện 109

4.4.3. Tồi tru khá nâng hiếu hiện rChìA bằng phương pháp bề mặt đáp

ứng 112

4.4.4. Tình sạch và xác định hoạt tinh cùa chitinase tái tồ hợp 113

4.5. Nghiên cứu tính chất của chitinase tái tổ họp 114

4.5.1. Nhiệt độ toi ưu và độ bền nhiệt 114

4.5.2. pH tồi tru và độ bền pH 115

4.53. Anh hưởng cùa ton kim loại và EDTA ì én hoạt tinh chitinase 115

4.5.4. Anh hưởng cùa chất tây rữa 1 lố

4.5.5. Anh hưởng cũ a dung môi hữu cơ. 117

4.5.6. Động học cùa phân ứng enzym. 117

4.5.7. Sàn phẩm cùa sự th ủy phán cơ chất bới chitinase 11 s

4.6. Thử nghiệm khã năng kháng nấm gây bệnh thực vật và tăng

hoạt tính diệt sâu cùa chitinase tái tổ họp 118

4.6.1. Khá nâng khảng nấm gã)' bệnh thực vật cùa chitinase tái tố hợp 118

4.6.2. Hỗ trợ hoạt tinh diệt sâu Bộ cánh vấy cùa chitinase tái tổ hẹp. 119

KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 122

CÁC CÔNG TRÌNH ĐẢ CÔNG BÓ UÈN QUAN ĐÉN LUẬN ÁN_. 123

TOM TẢT KÉT QUẢ LUẬN AN BẢNG TIÊNG ANH 124

TÀI LIỆU THAM KHAO 130

PHỤ LỤC