Luận án Tạo dòng hoa huệ (Polianthes Tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60CO) trong điều kiện In Vitro - Đào Thị Tuyết Thanh

ống hoa huệ đơn tại huyện Phong Điền, Thành Phố Cần Thơ. b: Lô đất trồng giống hoa huệ kép tại huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang. a b Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 44 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học a. Đánh giá sự đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử ISSR-PCR - Quy trình tách chiết ADN tổng số: Mẫu lá của từng giống đƣợc thu thập riêng rẽ và tách chiết AND theo mô tả bởi Rogers and Bendich (1988) có thay đổi nhỏ, sử dụng 2% dung dịch trích đệm CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (Trần Nhân Dũng, 2011). - Công thức của mỗi phản ứng PCR gồm: H2O: 16,25µl; Buffer: 2,5 µl; dNTPS: 2 µl; mồi ngƣợc và xuôi: 1 µl; Taq: 0,25µl; 3 µl ADN mẫu. Tổng cộng: 25 µl/phản ứng. - Sử dụng 14 mồi ISSR (Mengli et al., 2012; Khandagale et al., 2014) đƣợc Công ty TNHH Sinh hóa Phù sa (Phusa Biochem) sản xuất và cung cấp (Bảng 3.3). Bảng 3.3: Danh sách các mồi ISSR sử dụng đánh giá đa dạng ADN các giống/dòng huệ STT Tên mồi Trình tự (5’-3’) 1 3A01 (GA)8TC 2 3A07 (AG)7CTT 3 3A21 (TG)7ACC 4 3A39 (CA)7GTA 5 3A42 (GACA)4C 6 3A62 (TG)7ACT 7 UBC873 GACAGACAGACAGACA 8 808 (AG)8C 9 836 (AG)8YA 10 840 (AG)8YT 11 842 (AG)8YG 12 855 (AC)8YT 13 857 (AC)8YG 14 P23SR1 GGCTGCTTCTAAGCCAAC - Chu kỳ nhiệt gồm các bƣớc: Bƣớc 1: Khởi đầu: Đun hỗn hợp ở 92°C-5 phút; Bƣớc 2: Biến tính ở 92°C-1 phút; Bƣớc 3: Gắn mồi ở 35°C-30 giây; Bƣớc 4: Kéo dài ở 72°C-1 phút; Bƣớc 5: 72°C-5 phút. Thực hiện 45 chu kỳ và trữ ở 4°C. - Kết quả PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 45 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Các đoạn ADN khuếch đại là đa hình sẽ đƣợc ghi nhận và xác định vị trí các băng ADN xuất hiện mới hoặc mất đi trên 2 dòng huệ đột biến so với băng đối chứng (giống hoa huệ 12 cánh) (tính bằng bp). b. Giải trình tự vùng ITS Các mẫu ADN có chất lƣợng tốt đƣợc dùng để khuếch đại vùng gene ITS bằng cặp mồi vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Integrated ADN Technologies: ITS1: 5‟-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‟ ITS4: 5‟-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‟ (White et al., 1990). - Quy trình tách chiết ADN (Trần Nhân Dũng, 2011). - Chu kỳ nhiệt gồm các bƣớc: Khởi đầu: Đun hỗn hợp ở 95°-5 phút; Biến tính ở 95°-90 giây; Gắn mồi ở 53°-90 giây; Kéo dài ở 72°-90 giây; 72°-5 phút. Lặp lại trong 35 chu kỳ. - Công thức PCR gồm H20: 37 µl; Buffer: 5 µl; MgCl2: 3 µl; dNTPS: 3 µl; mồi xuôi: 0,25 µl; mồi ngƣợc: 0,25 µl; Taq: 0,5 µl bổ sung 2 µl ADN. Tổng cộng: 50 µl/ phản ứng. - Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự ADN - Các băng đoạn ITS sau khi đƣợc khuếch đại đƣợc giải trình tƣ ̣theo hƣớng 5‟ và 3‟ phosphate, loại bỏ trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc và đƣ ợc kiểm tra bằng công cụ BLAST (Basic Local Alignmet Search Tool) trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information) để chắc chắn các trình tự này là từ các loài thuộc chi Polianthes spp. 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu - Các số liệu thô thu từ các nội dung nghiên cứu sẽ đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel 2007. Số liệu đo và đếm đƣợc chuyển đổi bằng công thức (x + 0,5)1/2. - Sử dụng phần mềm SPSS 16.0, dùng thống kê mô tả để tính các giá trị trung bình, các số đo biến động và các giá trị xác suất. Phân tích phƣơng sai ANOVA (phép thử Duncan) để so sánh các số liệu trung bình giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%. - Vẽ đồ thị và xác định phƣơng trình tƣơng quan và hồi quy bằng phần mềm Exel 2007. - Số liệu ISSR đƣợc thu thập dựa vào thang chuẩn 100 bp sự có mặt hoặc không có mặt của một băng nào đó trên gel sẽ đƣợc quy ƣớc là 1 và 0 cho mỗi cá thể. Sau khi ghi nhận tất cả các băng trên mỗi mẫu cây, số liệu đƣợc lƣu trữ trong phần mềm Excel. Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các giống cũng dựa trên Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 46 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học ma trận hệ số tƣơng đồng (Similarity coefficient) và phân tích sơ đồ hình nhánh (Cluster) bằng phần mềm NTSYSpc v2.1 (Rohlf, 2000). - Các mẫu sau khi giải trình tự sẽ đƣợc truyền qua máy tính và phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.0.5.3. để xếp hàng (alignment) các trình tự để xác định vị trí và các dạng đột biến ADN. Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 47 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro 4.1.1 Tỷ lệ sống khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (ĐST) hai giống hoa huệ Sau 30 ngày nuôi cấy ở môi trƣờng nuôi cấy Huỳnh Thị Huế Trang và ctv (2007), đối với giống hoa huệ đơn, tỷ lệ ĐST vẫn còn sống, có màu xanh và tạo đƣợc chồi mới là 12 mẫu, chiếm tỷ lệ 40% (Bảng 4.1 và Hình 4.1). Trong khi đó, tỷ lệ này ở giống hoa huệ kép là 18 mẫu đạt tỷ lệ 60%. Tỷ lệ sống của ĐST ở hai giống hoa huệ có sự khác biệt khi nuôi cấy in vitro có thể giải thích do sức sống của từng giống và ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng mẫu. Bảng 4.1: Tỷ lệ sống của đỉnh sinh trƣởng ở hai giống hoa huệ đơn và hoa huệ kép ở 30 ngày sau khi cấy Giống hoa huệ Số mẫu nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Số mấu cấy thành công Tỷ lệ phần trăm (%) Hoa huệ đơn 30 12 40 Hoa huệ kép 30 18 60 Hình 4.1: Đỉnh sinh trƣởng phát triển sau 30 ngày nuôi cấy 4.1.2 Nhân cụm mô sẹo (callus) và cụm chồi Những mẫu chồi nuôi cấy từ đỉnh sinh trƣởng còn sống đƣợc cấy truyền sang môi trƣờng nhân chồi của Huỳnh Thị Huế Trang và ctv. (2007) là môi trƣờng cơ bản BM + 1,0 mg/l NAA + 4,0 mg/l BA. Số mẫu đƣợc nhân trong thời gian 180 ngày để đủ số lƣợng mẫu mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma ( 60 Co) ở giai đoạn kế tiếp. Ở môi trƣờng nuôi cấy này, xuất hiện nhiều Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 48 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học dạng cụm chồi có sự hình thành cùng một lúc mô sẹo và chồi cho cả hai giống hoa huệ đơn và hoa huệ kép (Hình 4.2). Điều này có thể lý giải là do ảnh hƣởng của tỷ lệ chất auxin nội sinh trong mô kết hợp auxin và cytokinin bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo (a) và cụm chồi (b) ở giống hoa huệ đơn 4.2 Xác định hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên hai giống/dòng hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro 4.2.1 Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 4.2.1.1 Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn Sau 30 ngày xử lý chiếu xạ, cụm mô sẹo có sự tái sinh (regeneration) chồi. Khi xử lý ở liều chiếu xạ càng cao thì sự tái sinh chồi càng giảm. Nghiệm thức đối chứng không xử lý cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đến 90%. Hai nghiệm thức đƣợc xử lý chiếu xạ ở liều trung bình thấp 20 và 25 Gy có tỷ lệ tái sinh chồi trung bình trên 50,0%. Trong khi đó, ở liều chiếu xạ 50 Gy, có 3 cụm mô sẹo tạo đƣợc chồi, đạt tỷ lệ 6,0%. Ở liều chiếu xạ cao nhất 60 Gy, không có cụm mô sẹo nào tạo đƣợc chồi (Bảng 4.2). Prasad et al. (1983) báo cáo rằng tỷ lệ nhân chồi phụ thuộc vào kiểu gen ở các giống hoa cúc. Tần số tái sinh và số chồi trung bình khác nhau ở các giống. Kích thƣớc chồi cũng đóng vai trò quan trọng đến hiệu quả tái sinh chồi. Wang and Ma (1978) cho rằng đỉnh chồi (shoot tip) từ 0,2-0,5 mm và đỉnh sinh trƣởng với đƣờng kính từ 0,1-0,2 mm chỉ tạo đƣợc một chồi. Những mẫu cấy lớn hơn (0,5-1,55 mm) cho nhiều chồi hơn. a b Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 49 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Bảng 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn Liều chiếu xạ (Gy) Tổng số cụm mô sẹo Số cụm mô sẹo tái sinh chồi Tỷ lệ tái sinh (%) ĐC 50 45 90,0 5 50 40 80,0 10 50 37 74,0 15 50 36 72,0 20 50 28 56,0 25 50 27 54,0 30 50 23 46,0 40 50 19 38,0 50 50 3 6,0 60 50 0 0,0 4.2.1.2 Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn Kết quả Bảng 4.3 cho thấy sau 150 ngày nuôi cấy, phần trăm cụm mô sẹo/cụm chồi chết gia tăng khi liều chiếu gia tăng. Khi không xử lý tia gamma ( 60 Co), tỷ lệ cụm chồi chết tự nhiên là 4%. Ở liều chiếu thấp nhất (5 Gy) có 22,0% cụm mô sẹo/chồi chết. Ở các liều chiếu xạ 15 Gy tăng dần đến 50 Gy cho tỷ lệ chết ở mức cao (trên 50,0%) và ở liều chiếu cao nhất (60 Gy), tất cả cụm mô sẹo/chồi bị chết. Hiệu quả của việc xử lý tia gamma trên sự sống sót tùy thuộc vào liều chiếu xạ. Khi liều chiếu xạ gia tăng sự sống sót giảm. Kết quả nghiên cứu này cũng giống với các kết quả nghiên cứu trên cây lai Torenia (Sawangmee et al., 2011) và cây Biomphalaria glabrata (Cantinha et al., 2009). Estrada-Basaldua et al. (2011) báo cáo sau khi chiếu xạ củ cây hoa huệ, đem các củ con nuôi cấy in vitro có liều gây chết hoàn toàn là 30 Gy. Salter and Hewitt. (1992) cho rằng tia gamma là nguyên nhân dẫn đến stress oxy hóa vì tăng sản sinh các các gốc oxy hoạt động nhƣ O2-, OH- và H2O2. Các gốc này có thể phản ứng nhanh với các phân tử của tế bào nhƣ protein, lipid và acid nhân. Chính các phản ứng này đã dẫn đến sự phá hủy các cơ quan của tế bào nhƣ thành tế bào, bộ máy golgi, lục lạp, nhân (Somosy, 2000; Wi et al., 2007). Các gốc oxy hoạt động này là chất chuyển hóa bình thƣờng trong tế bào dƣới điều kiện sinh trƣởng bình thƣờng của cây, nhƣng nồng độ của nó có thể tăng lên vì nƣớc bị phân ly do tia phóng xạ. Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 50 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Nếu nồng độ cao có thể làm chết tế bào (Halliwell, 1974). Tuy nhiên, sự tích lũy H2O2 phụ thuộc vào loại mô và tế bào (Kim et al., 2011). Bảng 4.3: Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy Liều chiếu xạ (Gy) Tổng số cụm mô sẹo và chồi Số cụm mô sẹo và chồi chết Tỷ lệ chết (%) ĐC 50 5 10,0 5 50 11 22,0 10 50 18 36,0 15 50 30 60,0 20 50 31 62,0 25 50 32 64,0 30 50 35 70,0 40 50 44 88,0 50 50 48 96,0 60 50 50 100,0 4.2.1.3 Liều gây chết LD50 của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn Bảng 4.4 trình bày các giá trị của liều chiếu xạ đƣợc biến đổi giá trị log10 và giá trị % chết sang giá trị xác suất ở giống/dòng hoa huệ đơn. Tất cả giá trị log10 và xác suất đƣợc sử dụng để tính tƣơng quan và hồi quy và đạt đƣợc phƣơng trình y1 = 1,99x + 2,94, R1 2 = 0,77 (Hình 4.3). Trên cơ sở phƣơng trình này, liều gây chết LD50 HĐ đạt đƣợc ở liều 10,96 Gy. Tính sai số chuẩn (SE) của LD50 đƣợc tính từ công thức (a) phần 3.2.2.1. Xác suất của 84 và 16 từ Bảng 2 (Phụ lục Bảng) là 5,99 và 4,01 (xấp xỉ 6 và 4), theo thứ tự. Ở giống/dòng hoa huệ đơn HĐ, giá trị log10LD cho xác suất 6 và 4 đạt đƣợc từ đồ thị (Hình 4.3) là 1,52 và 0,55. Giá trị log10 ngƣợc (antilog10) là 33,11 và 3,55. Sử dụng các giá trị này, SE của LD50HĐ là 2,95 Gy. Do đó, LD50 HĐ là 10,96 ± 2,96 Gy, với 95% khoảng tin cậy. Liều chiếu xạ phụ thuộc rất lớn vào mẫu đƣợc xử lý. Trên cây dâu tây, liều chiếu xạ có thể thay đổi từ 5 đến 800 Gy cho các vật liệu xử lý chiếu xạ nhƣ mô sẹo từ hạt phấn, mô sẹo từ lá, chồi nách và thân bò (Jain, 1997; Kasumi, 2002; Kaushal et al., 2004; Weimin et al., 2009). Sự khác nhau này có thể là do có sự khác nhau ở hàm lƣợng nƣớc trong mẫu cây xử lý. Songsri et al. (2011) cho rằng Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 51 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học hạt đƣợc xử lý chiếu xạ có ẩm độ thấp sẽ có khả năng chống chịu với tia chiếu xạ tốt hơn hạt có ẩm độ cao. Liều chiếu xạ 50-100 Gy, làm ức chế sự sinh trƣởng của cây Torenia (Kasetsart, 2011). Khi xử lý tia gamma, liều gây chết LD50 trên hoa Torenia là 83 Gy (Sawangmee et al., 2011). Bảng 4.4: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết ở giống/dòng hoa huệ đơn ở các liều chiếu xạ Liều chiếu xạ (Gy) Giá trị Log10 Giá trị hiệu chỉnh của tỷ lệ chết (% ) Giá trị xác suất 0 - 10,0 3,72 5 0,70 13,0 3,87 10 1,00 29,0 4,45 15 1,18 56,0 5,15 20 1,30 58,0 5,20 25 1,40 60,0 5,25 30 1,48 67,0 5,44 40 1,60 87,0 6,13 50 1,70 96,0 6,75 60 1,78 99,5 7,58 Ghi chú: -: Không xác định. Hình 4.3: Đồ thị tƣơng quan và hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ khác nhau ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy Ghi chú: Đường biểu diễn Log(LD50HĐ) Đường biểu diễn Log(LD84HĐ) và Log(LD16HĐ) Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 52 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học 4.2.1.4 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ đơn Hiệu quả của các liều chiếu xạ lên sự gia tăng trên số chồi ở thời điểm 150 ngày nuôi cấy đƣợc trình bày ở Bảng 4.5. Nhìn chung, khi xử lý liều chiếu xạ càng cao thì sự gia tăng số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ đơn càng giảm. Ở các liều chiếu xạ 5 và 10 Gy, số chồi, chiều cao chồi và số lá cao nhất. Ngƣợc lại, nghiệm thức 30 và 40 Gy, sự hình thành chồi và lá mới cũng nhƣ chiều cao chồi rất thấp. Liều 50 và 60 Gy làm hạn chế sự tạo chồi. Sự thành lập chồi trong in vitro thì liên quan đến một số chất điều hòa sinh trƣởng nội sinh trong đó có nhóm cytokinin. Hasbullah et al. (2012) giả định là sự tổng hợp các chất này bị ảnh hƣởng bởi sự chiếu xạ. Cây bị xử lý chiếu xạ ở liều cao sẽ làm thay đổi các quá trình trao đổi bên trong nhƣ sự sinh tổng hợp protein, cân bằng hormone và hoạt động của enzym. Ở liều chiếu xạ càng cao thì khả năng sinh trƣởng của các cụm chồi càng trở nên suy yếu, sự tạo chồi bị chậm lại và ức chế sự tạo chồi (Esfandiari et al., 2008). Bảng 4.5: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ đơn đã xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy Liều chiếu xạ (Gy) Số chồi Chiều cao chồi (cm) Số lá 0 3,2 b 6,4 a 14,7 b 5 4,2 a 6,2 ab 18,3 a 10 3,5 b 5,9 ab 17,5 a 15 2,5 c 5,4 b 11,0 c 20 1,9 d 3,9 c 7,9 d 25 2,0 cd 3,8 c 3,7 e 30 0,9 e 3,7 c 2,3 ef 40 0,5 e 0,7 d 1,2 fi 50 0,0 f 0,1 d 0,07 i 60 0,0 f 0,0 d 0,0 i F * * * CV (%) 22,9 21,4 26,0 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống nhau là khác biệt không có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 53 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học 4.2.1.5 Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma ( 60 Co) trên các cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ đơn Kết quả Bảng 4.6 cho thấy rằng có 4 kiểu cấu trúc bất thƣờng đƣợc ghi nhận dƣới tác động của các liều bức xạ gamma khác nhau. Khi không xử lý chiếu xạ không có hiện tƣợng cấu trúc chồi bất thƣờng. Ở các liều chiếu xạ 5; 10; 15 và 20 Gy các cụm chồi với các lá dính vào nhau với tần số xuất hiện 8,0; 4,0; 6,0 và 2,0% theo thứ tự. Các chồi với lá bị cuộn tròn hoặc co dúm lại ở các liều chiếu xạ 20; 25; 30 và 40 Gy. Ở liều 50 và 60 Gy, có hiện tƣợng các cụm mô sẹo và cụm chồi bị mất sắc tố, chuyển sang màu trắng hoặc nâu và chết dần chiếm tần số cao (lên đến 70 và 90%). Các hiện tƣợng lá bị co dúm hoặc cuộn tròn là do tia gamma gây ảnh hƣởng lên quá trình sinh tổng hợp trong cây làm hạn chế sự vận chuyển của các hormone (Hình 4.4). Antoszewski et al. (1978) đã chứng minh việc xử lý đột biến sẽ làm giảm khả năng vận chuyển IAA trong cây, cũng nhƣ hạn chế sự hấp thu IAA từ bên ngoài. Bảng 4.6: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ đơn đã xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy Liều chiếu xạ Các kiểu cấu trúc bất thƣờng Số cấu trúc bất thƣờng Tổng số cụm chồi Tỷ lệ cấu trúc bất thƣờng (%) ĐC (cấy mô) Không có dạng bất thƣờng ở lá - - - 5 Gy Lá dính nhau 4 50 8,0 10 Gy 2 50 4,0 15 Gy 3 50 6,0 20 Gy 1 50 2,0 20 Gy Lá cuộn tròn 1 50 2,0 30 Gy 3 50 6,0 25 Gy Lá co dúm 5 50 10,0 40 Gy 6 50 12,0 50 Gy Cụm mô mất sắc tố 35 50 70,0 60 Gy 45 50 90,0 Ghi chú: -: Không có dạng bất thường. a Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 54 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Hình 4.4: Các dạng cấu trúc bất thƣờng của cụm chồi giống/dòng hoa huệ đơn ở các liều chiếu xạ khác nhau sau 150 ngày nuôi cấy Ghi chú: a: ĐC cấy mô (dạng chồi bình thường); b, c, d và e : 5, 10, 15 và 20 Gy (dạng chồi có lá dính nhau, cuôn tròn); f, g, h: 25, 30 và 40 Gy lá co dúm và cuộn tròn; i và j: 50 và 60 Gy (chồi bị mất sắc tố diệp lục) 4.2.2 Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 4.2.2.1 Tỷ lệ chết của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép Tỷ lệ chết của cụm chồi giống/dòng huệ kép đƣợc theo dõi và ghi nhận sau 150 ngày nuôi cấy ở Bảng 4.7. Tỷ lệ chết càng tăng khi liều chiếu xạ gia tăng. Tuy nhiên, với các liều chiếu xạ dƣới 40 Gy, tỷ lệ chết của các cụm chồi đều dƣới 50% và tăng đột biến ở liều chiếu xạ 50 Gy và đạt tỷ lệ chết 100% ở liều xử lý 60 Gy. Các sắc tố quang hợp có thể bị phá hủy do tia gamma và dẫn đến mất khả năng quang hợp của cây. Xử lý chiếu xạ làm giảm hàm lƣợng chlorophylls, carotenoids cũng giảm đáng kể và hiệu quả quang hợp của lục lạp (Marcu et al., 2013; Kovacs and Keresztes, 2002). a b c h g j i d e f Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 55 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Bảng 4.7: Tỷ lệ chết của giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy Liều chiếu xạ (Gy) Tổng số cụm chồi Số cụm chồi chết Tỷ lệ chết (%) ĐC 50 0 0,0 5 50 3 6,0 10 50 9 18,0 15 50 10 20,0 20 50 19 38,0 25 50 20 40,0 30 50 22 44,0 40 50 24 48,0 50 50 44 88,0 60 50 50 100 4.2.2.2 Liều gây chết LD50 của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép Tƣơng tự nhƣ ở giống hoa huệ đơn, Bảng 4.8 trình bày các giá trị của liều chiếu xạ đƣợc biến đổi giá trị log10 và giá trị % chết sang giá trị xác suất ở giống/dòng hoa huệ kép. Hai giá trị ở 0 và 100% chết đƣợc hiệu chỉnh. Tất cả giá trị log10 và xác suất đƣợc sử dụng để tính tƣơng quan và hồi quy và đạt đƣợc phƣơng trình y2 = 2,79x2 + 1,19, R2 2 = 0,87 (Hình 4.5). Trên cơ sở phƣơng trình này, liều gây chết LD50 HK đạt đƣợc ở liều 22,91 Gy và SE của LD50 HK là 4,01 Gy với 95% khoảng tin cậy. Thông thƣờng, liều gây chết LD50 trong xử lý chiếu xạ đạt đƣợc không giống ở tất cả các loài cũng nhƣ tất cả các mẫu cấy khi đƣợc xử lý bằng tia gamma do nó thay đổi từ loài này sang loài khác cũng nhƣ từ mẫu cấy này sang mẫu cấy khác. Estrada-Basaldua et al.(2011) đã báo cáo khi xử lý chiếu xạ củ hoa huệ (có từ 2-21 củ con) bằng tia gamma (60Co) rồi tách các củ con (không gây tổn thƣơng) đem nuôi cấy in vitro và trồng ngoài nhà lƣới, LD50 của các cây huệ đƣợc trồng từ các chồi thuần dƣỡng sau nuôi cấy in vitro là 9,09 Gy, thấp hơn LD50 của các cây phát sinh từ củ đƣợc chiếu xạ và đƣợc trồng ngoài nhà lƣới (25,91 Gy) sau thời gian 150 ngày. Nghiên cứu của Yanshan et al. (2003) đã tính toán các liều gây chết LD50 là 15 và 25 Gy trên số lƣợng củ lớn và củ nhỏ còn sống. Trong nghiên cứu này, sử dụng vật liệu khác (cụm chồi nuôi cấy từ đỉnh sinh trƣởng) và đƣợc nuôi cấy in vitro nên có thể thấy các điều kiện về dinh dƣỡng, nhiệt độ, ánh sáng và ẩm độ sẽ tốt hơn cho sự sinh trƣởng khi trồng ngoài đồng nên liều gây chết LD50 có cao hơn khi so sánh với các nghiên cứu của tác Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 56 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học giả Yanshan et al. (2003) và Jorge et al. (2011) chỉ xử lý chiếu xạ lên củ rồi trồng ngoài đồng. Đồng thời, liều gây chết LD50 của cụm chồi hoa huệ cao hơn nhiều so với liều gây chết LD50 khi chiếu xạ củ cái rồi đem củ con nuôi cấy in vitro. Nhƣ vậy, liều gây chết LD50 thay đổi phụ thuộc vào vật liệu ban đầu và điều kiện nuôi dƣỡng. Kết quả này tƣơng tự với kết luận của Hegde (2006) những bộ phận còn rễ và đỉnh sinh trƣởng sẽ ít mẫn cảm hơn các bộ phận của cây chƣa hoặc đang tạo rễ mới và chồi mới nhƣ đoạn cắt không có rễ và có lá. Bảng 4.8: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết ở giống/dòng hoa huệ kép ở các liều chiếu xạ Liều chiếu xạ (Gy) Giá trị Log10 Giá trị hiệu chỉnh của tỷ lệ chết (% ) Giá trị xác suất 0 - 0,5 1,34 5 0,70 6,0 3,45 10 1,00 18,0 4,08 15 1,18 20,0 4,16 20 1,30 38,0 4,69 25 1,40 40,0 4,75 30 1,48 44,0 4,85 40 1,60 48,0 4,95 50 1,70 84,0 5,99 60 1,78 99,5 7,58 Ghi chú: -: Không xác định. Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 57 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Hình 4.5: Đồ thị tƣơng quan hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ khác nhau ở giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy Ghi chú: Đường biểu diễn Log(LD50HK) Đường biểu diễn Log(LD84HK) và Log(LD16HK) 4.2.2.3 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ kép Hiệu quả của các liều chiếu xạ lên sự gia tăng trên số chồi ở các thời điểm 0 và 150 ngày nuôi cấy đƣợc trình bày ở Bảng 4.9. Có sự gia tăng về số chồi ở tất cả các nghiệm thức ngoại trừ nghiệm thức 60 Gy. Ở các liều chiếu xạ từ 5; 15 và 25 Gy, số chồi gia tăng theo thời gian ở tất cả các nghiệm thức và không có sự khác biệt thống kê giữa các nghiệm thức này. Ở nghiệm thức 40 và 50 Gy, số chồi gia tăng tƣơng đối nhỏ. Liều 60 Gy đã gây ảnh hƣởng nhiều đến sự phát sinh chồi. Kryukova and Maevskaya (1976) cho thấy có mối quan hệ trực tiếp giữa nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng với sự sinh trƣởng của cây và sự ức chế sinh trƣởng của cây ở liều chiếu xạ cao là do làm giảm hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng nội sinh. Ngoài việc tia gamma gây ảnh hƣởng lên quá trình sinh tổng hợp trong cây thì hạn chế sự vận chuyển của các chất điều hòa sinh trƣởng do tia gamma cũng đƣợc ghi nhận. Stajkov et al. (1986) cho rằng cơ chế của việc tăng sinh trƣởng ở liều chiếu xạ thấp là do tăng nồng độ của auxin và gibberrellin trong cây. Một số nhà khoa học cũng cho rằng sự gia tăng sinh trƣởng do tăng nồng độ IAA và GA3 tác động lên các quá trình sinh lý hơn là tác động đến bộ gen và kích thích sự phân chia tế bào ở vùng mô phân sinh (Rabie et al., 1996; Singh and Datta, 2010). Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 58 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Bên cạnh đó, chiều cao chồi gia tăng theo thời gian ở tất cả các nghiệm thức xử lý các liều chiếu xạ khác nhau. Chiều cao chồi đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức 5 và 15 Gy. Nghiệm thức không xử lý chiếu xạ, nghiệm thức 25 và 40 Gy có sự gia tăng chiều cao chồi tƣơng đối nhỏ. Đặc biệt ở liều chiếu xạ 60 Gy chiều cao chồi gần nhƣ không gia tăng. Giải thích cho sự sinh trƣởng bị hạn chế do ảnh hƣởng của các liều chiếu xạ có thể liên quan đế chất điều hòa sinh trƣởng nội sinh và ADN (acid deoxyribo nucleic). Ảnh hƣởng của các liều chiếu xạ trên các phản ứng và cần thiết cho sự tổng hợp ADN và auxin (Jan et al., 2012). Sự hình thành lá mới của chồi hoa huệ theo liều chiếu xạ ở các mốc thời gian nuôi cấy. Số lá ở các liều chiếu xạ ở 150 ngày nuôi cấy đều tăng. Liều chiếu xạ càng cao, sự hình thành lá càng ít dần, trừ số lá gia tăng ở nghiệm thức 40 Gy (khoảng 10 lá) là khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các liều chiếu xạ 20 Gy. Nghiệm thức ở liều chiếu xạ 25 Gy tạo số lá nhiều nhất (khoảng 21 lá), có khác biệt không có ý nghĩa thống kê với liều chiếu xạ 5; 10 và 15 Gy ở 150 ngày nuôi cấy. Mặc dù ở liều chiếu xạ gây chết hoàn toàn 60 Gy không cho sự gia tăng số chồi và chiều cao chồi nhƣng vẫn có sự gia tăng số lá ở các thời điểm nuôi cấy 150 ngày. Điều này là do số chồi chết không đồng thời một lúc, thời gian các chồi đƣợc xử lý chiếu xạ chết hoàn toàn trong 150 ngày nên trong thời gian này chồi vẫn có sự gia tăng về mặt sinh trƣởng. Các chồi ở nghiệm thức này có sự gia tăng số lá nhƣng rất ít (khoảng 1,1 lá ở 150 ngày nuôi cấy theo thứ tự). Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 59 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Bảng 4.9: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ kép đã xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy Liều chiếu xạ (Gy) Ngày 0 150 Số chồi Chiều cao chồi (cm) Số lá Số chồi Chiều cao chồi (cm) Số lá 0 3,4 1,1 2,2 7,3 a 5,4 b 18,0 b 5 3,4 1,1 2,2 6,9 ab 7,0 a 18,6 ab 10 3,4 1,0 2,2 6,3 bc 6,0 b 20,1 ab 15 3,5 1,1 2,3 6,7 abc 6,6 a 21,7 a 20 3,3 1,1 2,3 6,1 c 6,2 c 10,5 c 25 3,5 1,1 2,2 6,1 c 5,6 b 21,1 a 30 3,4 1,1 2,2 4,8 d 2,7 d 4,6 d 40 3,5 1,1 2,2 4,2 de 2,4 d 9,9 c 50 3,4 1,1 2,1 3,6 ef 1,1 e 4,7 d 60 3,4 1,1 2,1 3,4 f 1,2 e 3,2 d F ns ns ns * * * CV (%) 6,4 3,6 8,6 10,6 13,3 21,8 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống nhau là khác biệt không có ý nghĩa thốn