Luận án Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất tubulysin

34.3 (C-5‟), 31.4 (C- 14), 30.1 (C-10), 28.3 (C-Boc), 26.2 (C-8‟), 24.1 (C-4), 23.3 (CH3-Ac), 22.7, 22.1 (C-21), 21.6, 20.8 (C-10‟), 20.2 (C-9‟), 19.5 (C-7‟), 18.0 (C-15), 17,6 (C-16), 16.0 (C-3), 15.9 (C-23), 11.2 (C-22). Hợp chất 90b, chất lỏng không màu 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.01 (s, 1H, H-9), 7.29-7.22 (m, 5H), 5.35 (dd, J = 11 Hz, 2 Hz, 1H, H-11), 5.09 (d, J = 10 Hz, 1H, H-1‟), 4.67 (td, J = 10.5 Hz, 4.5 Hz, 1H, H-19), 4.53 (t, J = 10.5 Hz, 1H, H-5), 4.44 (t, J = 9.5 Hz, 1H, H-13), 4.37 (m, 1H), 3.06 (s, 3H, H-17), 2.90 (m, 2H, H-6), 2,59-2,56 (m, 1H), 2.32 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.08-2.00 (m, 3H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.73-1.67 (m, 2 H), 1,68-1,63 (m, 1H), 1.51-1.37 (m, 6H), 1.41 (s, 9H), 1.18 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 1.03 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 0.9-0.88 (overlap, 9H), 48 0.70 (d, J = 7.0 Hz, 3 H, H-22). Hợp chất 91, chất lỏng không màu 1 H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.02 (s, 1H, H-6), 7.29-7.26 (m, 3H, H-phenyl), 7.18- 7.16 (m, 2H, H-phenyl), 5.64 (td, J = 3.5 Hz, 11.5 Hz, 1H, H-8), 5.10 (dd, J = 13, 2.5 Hz, 1H, H-16), 5.04 (m, 1H, H-2), 4.54-4.52 (m, 1H, H-10), 4.34 (t, J = 7 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H, OMe), 3.23 (t, J = 4 Hz, 2H, H-3), 2.98 (s, 3H, H-14), 2.96 (d, J = 7 Hz, 1H), 2.35-2.29 (m, 1H), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.09-2.06 (m, 1H), 1.44 (s, 9H, H-Boc), 1.03 (t, J = 7 Hz, 3H, H-13), 0.97 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-12), 0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-20), 0.83 (d, J = 7 Hz, 3H, H-19). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ ppm: 174.3 (C-15), 171.7 (C-7), 170.2 (CO-Ac), 170.0 (C-1), 160.3 (C-4), 156.0 (CO-Boc), 149.3 (C-5), 135.9 (C1-phenyl), 129.3 (C-6), 128.5, 127.1, 124.0 (C4-phenyl), 79.4 (C-tertBoc), 69.5 (C-8), 69.1 (C-16), 55.1 (C-2), 53.1 (OMe), 52.3 (C-10), 50.5 (C- 14), 38.2 (C-3), 37.0 (C-17), 34.7 (C-11), 29.9 (C-Boc), 28.3 (C-Ac), 24.1 (C-9), 20.8 (C-18), 19.6, 18.9 (C-12), 15.9 (C-13), 13.7 (C-20), 11.1 (C-19) Hợp chất 92, chất lỏng không màu. 1 H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.02 (s, 1H, H-6), 7.29-7.26 (m, 3H), 7.18-7.16 (m, 2H), 5.35 (td, J = 3.5 Hz, 11.5 Hz, 1H, H-8), 5.16-5.09 (dd, J = 13, 2.5 Hz, 1H, H-16), 5.04 (m, 1H), 4.54-4.52 (m, 1H, H-2), 4.34 (t, J = 7 Hz, 1H, H-10), 3.73 (s, 3H, OMe), 3.24 (t, J = 4 Hz, 2H, H-3), 3.05 (s, 3H, H-14), 2.96 (d, J = 7 Hz, 1H), 2.35-2.29 (m, 1H, H-17), 2.09-2.06 (m, 1H, H-11), 1.44 (s, 9H, H-Boc), 1.03 (t, J = 7 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 7 Hz, 3H, H-20), 0.84 (d, J = 7 Hz, 3H, H-19). 2.2.8. Tổng hợp các dẫn xuất tubulysin Quy trình phản ứng tổng hợp tetrapeptide 93, 93a Muối trifluoroacetic 90c/90a (150 mg, 0.18 mmol) trong DMF (2 mL) đƣợc thêm vào DIPEA (0.5 mL) và N-methylpipecolinic acid (27.2 mg, 0.19 mmol) đƣợc thêm vào tiếp sau, hỗn hợp đƣợc khuấy 10 phút ở nhiệt độ phòng và chất HATU (86.4 mg, 0.23 mmol) tiếp tục đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 14h. Kết thúc phản ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng nƣớc, 49 dịch EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên sắc ký cột silica gel (nHexan/EtOAc, 1/1) thu đƣợc dẫn xuất ester 93/93a (81.5 mg), hiệu suất phản ứng đạt 55%. Quy trình phản ứng thủy phân ester 93 Ester 93 (60 mg, 0.07 mmol) trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2 mL, 2/1) đƣợc thêm vào KOH (19.6 mg, 0.35 mmol). Phản ứng đƣợc khuấy ở 45 o C trong 48h. Kết thúc phản ứng, dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm. Cặn thu đƣợc đƣợc thêm nƣớc và axit hóa với dung dịch HCl 5% đến pH  4, và chiết với EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Cất loại hết dung môi và tinh chế sản phẩm thô trên cột sắc ký silica gel (DCM/MeOH, 10/1) thu đƣợc axit 94 (36 mg), hiệu suất phản ứng đạt 92%. Quy trình phản ứng acetyl hóa acid 94 Axit 94 (30 mg, 0.04 mmol) trong dung môi DCM đƣợc thêm vào acetic anhydride (4.9 mg, 0.05 mmol), lƣợng dƣ TEA (1 mL) và 5% mol DMAP. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h. Kết thúc phản ứng, thêm nƣớc và chiết với DCM, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi dƣới áp suất giảm và tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột silica gel với hệ rửa giải DCM/MeOH (20/1), thu đƣợc axit 95 (27 mg) có chứa nhóm acetyl trên mạch tuv, với hiệu suất của phản ứng acetyl đạt 90%. Hợp chất 93, chất lỏng không màu [α]D 27 -2.15 (c 0.11, MeOD), MS(ESI): [M+H] + 824.5302 (Tính cho C46H74N5O6S: 824.5360). 1 H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.01 (s, 1H, H-9), 7.26 (m, 2H, H-phenyl), 7.21-7.20 (m, 3H, H-phenyl), 5.17 (dd, J = 9.5 Hz, 1H, H- 11), 4.70 (br, 1H, H-1‟‟), 4,65 (td, J = 10.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-1‟), 4.41-4.38 (m, 50 1H, H-19), 3.74-3.71 (m. 2H, H-5, H-13), 3.46-3.44 (m, 2H, H-4‟), 3.28 (s, 3H, H- 5‟), 3.20 (m, 1H, H-6), 3.01 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.90-2.87 (m, 1H, H-20), 2.59-2.55 (m, 1H, H-2‟‟), 2.35-2.30 (m, 4H), 2.05-1.99 (m, 4H), 1.91- 1.85 (m, 6H), 1.67-1.65 (m, 4H, H-3), 1.39-1.38 (br, 1H), 1.36-1.30 (m, 1H), 1.20 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-10‟), 1.02-0.98 (m, 3H, H-9‟). 0.90 (d, J = 7 Hz, 3H, H-7‟), 0.86-0.83 (overlap, 9H, H-15, 16, 23), 0.75 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 176.2 (C-18), 175.7 (C-10), 172.2 (C- 1), 160.3 (C-24), 150.1 (C-7), 149.8 (C-8), 137.6 (C1-phenyl), 129.7 (C-9), 128.3, 126.4, 123.0 (C4-phenyl), 74.25 (C-11), 69.5 (C-1‟‟), 68.7 (C-19), 66.9 (C-1‟), 59.8 (C-13), 55.3 (C-17), 52.3 (C-5‟), 48.6 (C-4‟), 47.1 (C-6), 41.0, 40.6, 38.6, 37.8, 36.7, 34.3, 31.4, 30.8, 29.6, 27.3, 26.1, 24.9, 23.2, 22.5, 22.0, 20.8 (C-10‟), 20.0 (C- 9‟), 18.0 (C-7‟), 16.7 (C-15), (C-16), 16.1 (C-3), 11.7 (C-23), 10.7 (C-22) Hợp chất 93a, chất lỏng không màu [α]D 27 -2.96 (c 0.13, MeOD), 1 H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.01 (s, 1H, H-9), 7.26 (m, 2H), 7.21-7.20 (m, 3H), 5.67 (dd, J = 9.5 Hz, 1H, H-11), 4.70 (br, 1H, H-1”), 4,65 (td, J = 10.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-19), 4.41-4.38 (m, 1H, H-1‟), 3.74-3.71 (m. 2H, H-5, 13), 3.46-3.44 (m, 2H, H-4‟), 3.28 (s, 3H, H-5‟), 3.20 (m, 1H), 3.01 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.90-2.87 (m, 1H, H-6), 2.59-2.55 (m, 1H, H20), 2.35-2.30 (m, 4H), 2.15 (s, 3H, OAc), 2.05-1.99 (m, 4H), 1.91-1.85 (m, 6H), 1.67-1.65 (m, 4H), 1.39-1.38 (br, 1H), 1.36-1.30 (m, 1H), 1.20 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-7”), 1.02-0.98 (m, 6H, H-9”, 10”). 0.90 (d, J = 7 Hz, 3H, H-3), 0.86-0.83 (overlap, 9H, H-23, 15, 16), 0.75 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 177.6 (C-18), 176.2 (C-10), 175.7 (CO- OAc), 172.2 (C-1), 160.3 (C-24), 150.1 (C-7), 149.8 (C-8), 137.6 (C1-phenyl), 129.7 (C-9), 128.3, 126.4, 123.0 (C4-phenyl), 74.25 (C-11), 69.5 (C-1”), 68.7 (C- 51 1‟), 66.9 (C-19), 59.8 (C-5), 55.3 (C-13), 52.3 (C-17), 48.6 (C-5‟), 47.1 (C-4‟), 41.0 (C-6), 40.6 (C-20), 38.6 (C-2”), 37.8 (C-12), 36.7 (C-5”), 34.3 (C-14), 31.4 (C-8”), 30.8 (C-4), 29.6 (C-2‟), 27.3 (C-6”), 26.1 (C-21),25.8 (C-4”) 24.9 (C-3”), 23.2 (C- 3‟), 22.5 (CH3-Ac), 22.0(C-7”), 20.8 (C-9”), 20.0 (C-10”), 18.0 (C-16), 16.7 (C-15), 16.1 (C-3), 11.7 (C-23), 10.7 (C-22). Hợp chất 94, chất rắn màu trắng [α]D 27 -10.52 (c 0.12, MeOD), HRMS-ESI: [M+H] + 686.3903 (Tính cho C36H56N5O6S, 686.3951). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 8.04 (s, 1H, H-9), 7.25-7.24 (m, 4H), 7.20-7.17 (br, 1H), 5.17-5.15 (m, 1H, H-11), 4.74-4.68 (m, 2H, H-19, H-1‟), 4.42-4.35 (m, 2H, H-5) 3.73-3.71 (m, 1H, H-13), 3.60-3.5 (m, 2H, H- 5‟), 3.18 (t, 2H, H-6), 3.19 (s, 3H, H-17), 2.94 (m, 2H), 2.78-2.72 (m, 1H), 2.59- 2.57 (m, 1H), 2.55 (s, 3H, H-6‟), 2.30-2.25 (m, 2H), 1.95-1.93 (m, 2H), 1.91-1.88 (m, 2H), 1.84-1.82 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 4H), 1.17-1.5 (d, 3H, H-3), 1.07-1.04 (overlap, 3H, H-16), 0.99 (d, J = 7 Hz, 3H, H-15), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-23), 0.87 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). Hợp chất 95, chất rắn màu trắng [α]D 27 -11.26 (c 0.12, MeOD); HRMS-ESI [M+H] + :728.4051 (Tính cho C38H58N5O7S: 728.4057). 1 H- NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 8.11 (s, 1H, H-9), 7.29-7.22 (m, 5H, H-phenyl), 5.70 (td, J = 10.5 Hz, 2.5 Hz, 1H, H-11), 4.74 (overlap, 2H, H-19, 1‟), 4.58-4.53 (m, 1H, H-5), 4.40 (br, 1H), 3.72-3.71 (m, 1H, H- 13), 3,.60-3.5 (m, 2H, H-5‟), 3.23-3.18 (m, 2H, H-6), 3.11 (s, 3H, H-17), 2.94 (m, 52 1H), 2.59-2.57 (m, 1H, H-20), 2.35 (s, 3H, H-6‟), 2.15 (s, 3H, OAc), 2.30-2.25 (m, 2H), 1.91-1.88 (m, 6H), 1.69-1.58 (m, 4H), 1.16 (d, 3H), 1.07-1.04 (overlap, 3H, H- 3), 0.99-0.97 (overlap, 6H, H-15,16), 0.85 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-23), 0.80 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ ppm: 177.7 (C-1), 174.9 (C-18), 172.5 (C- 10), 171.7 (CO-OAc), 171.1 (C-7), 162.6 (C-24), 150.1 (C-8), 139.4 (C1-phenyl), 130.5 (C-9), 129.5 (C2,6-phenyl), 127.4 (C3,5-phenyl), 125.1 (C4-phenyl), 75.6 (C- 11), 71.2 (C-1‟), 69.6 (C-19), 64.4 (C-13), 55.8 (C-5‟), 55.2 (C-5), 40.6 (C-6‟), 38.6 (C-17), 35.7 (C-6), 32.3 (C-2), 31.4 (C-20), 27.6 (C-14), 25.3 (C-12), 24.9 (C-2‟), 23.2 (C-21), 22.0 (CH3-Ac), 20.0 (C-4‟), 18.0 (C-3‟), 16.7 (C-3), 16.1 (C-16), 13.13 (C-15), 11.2 (C-23), 9.2 (C-22). 2.2.9. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin 2.2.9.1. Tổng hợp chất tương tự tubulysin với thay thế isoleucine bằng leucine Hợp chất 96, chất lỏng không màu [α]D 27 -15.44 (c 0.09, MeOD). HRMS-ESI: [M+H] + 866.5481 (Tính cho C48H76N5O7S: 866.5465). 1 H- NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 8.02 (s, 1H, H-9), 7.28-7.20 (m, 5H, phenyl), 7.14 (d, J = 6 Hz, 2H, NH), 5.66 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H- 11), 4.80-4.78 (m, 1H, H-1”), 4.67 (m, 1H, H- 1‟), 4.59 (m, 1H, H-19), 4.43-4.37 (m, 1H, H-5), 3.04 (s, 3H, H-17), 2.95-2.94 (m, 1H, H-13), 2.88-2.82 (m, 1H, H-6), 2.59-2.57 (m, 1H, H-6), 2.35-2.30 (m, 2H, H-5‟), 2.28 (s, 3H, H-6‟), 2.15 (s, 3H, OAc), 2.10-1.93 (m, 4H), 1,87-1.75 (m, 4H), 1.69-1.55 (m, 6H, H-3), 1.48-1.32 (m, 2H), 1.18 (d, J = 7 Hz, 6H, H-9”,10”), 0.87 (overlap, 9H, H-15,16,7”), 0.83 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-22), 0.71 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ ppm: 176.1 (C-18), 175.7 (C-10), 173.6 (CO-OAc), 170.0 (C-1), 160.6 (C-24), 150.1 (C-7), 137.6 (C-8), 129.5 (C1-phenyl), 53 128.4 (C-9), 126.5, 123.5, 123.3 (C4-phenyl), 74.3 (C-11), 69.5 (C-1”), 69.4 (C-19) 53.1 (C-1‟), 48.8 (C-5), 47.0 (C-17), 46.9, 44.7 (C-13), 40.8 (C-6), 40.7 (C-6‟), 37.8 (C-2‟), 37.1, 36.9, 34.7 (C-5‟), 34.6, 34.3 (C-2”), 34.2, 31.4 (C-5”), 31.3, 29.9 (C- 2), 26.2, 24.9, 24.5 (C-3‟), 23.4 (CH3-Ac), 22.0 (C-7”), 20.8 (C-10”), 20.7 (C-9”), 20.0 (C-16), 19.6 (C-15), 18.0 (C-3), 16.1 (C-22), 10.9 (C-23). 2.2.9.2. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N-terminal Tƣơng tự phản ứng tổng hợp tubulysin 95, các dẫn xuất 97, 98, 99, 100, 101 đƣợc tổng hợp từ tripeptide 90 hoặc 90b qua ba phản ứng liên tiếp. Quy trình phản ứng tổng hợp các ester tetrapeptide. Muối trifluoroacetic của 90/90b (1 eq) trong DMF đƣợc thêm vào 10 eq DIPEA, và 1,1 eq các acid (3-methylpicolinic acid/ isoquinoline -1-cacboxylic acid/ 5-methyl pyrazine-2 carbocylic acid, N-allylpipecolinic acid ) đƣợc thêm vào tiếp sau, hỗn hợp đƣợc khuấy 15 phút ở nhiệt độ phòng và chất HATU (1,2eq) tiếp tục đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 14h. Kết thúc phản ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng nƣớc, dịch EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên sắc ký cột silica gel (hệ rửa giải nHexan/EtOAc, 1/1) thu đƣợc các tetrapeptide là dẫn xuất ester của menthol thu đƣợc với hiệu suất đạt từ 50-55%. Quy trình phản ứng thủy phân các dẫn xuất menthyl ester Các menthyl ester ở trên trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2/1) đƣợc thêm vào 5 eq KOH. Phản ứng đƣợc khuấy ở 45 o C trong 48 h. Kết thúc phản ứng, dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm. Cặn thu đƣợc đƣợc thêm nƣớc và axit hóa với dung dịch HCl 5% đến pH  4, và chiết với EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Cất loại hết dung môi và tinh chế sản phẩm thô trên cột sắc ký silica gel (DCM/MeOH) thu đƣợc các sản phẩm acid với hiệu suất đạt 80-85%. Quy trình phản ứng acetyl hóa Các acid nhận đƣợc từ phản ứng thủy phân menthyl trong dung môi DCM đƣợc thêm vào 1,2 eq acetic anhydride, lƣợng dƣ TEA và 5% mol DMAP. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h. Kết thúc phản ứng, thêm nƣớc và chiết với DCM, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi dƣới áp suất giảm và tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột silica gel với hệ rửa giải 54 DCM/MeOH (20/1), thu đƣợc các acid có nhóm acetyl trên Tuv gồm 97, 98 với hiệu suất của phản ứng acetyl đạt từ 90 - 95%. Hợp chất 97, chất rắn màu vàng nhạt [α]D 27 -5.27 (c 0.15, MeOD). HRMS-ESI [M+H-H2O] + : 704.3488 (Tính cho C38H50N5O6S: 704.3482). 1 H- NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.57 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H-5‟), 8.40 (dd, J = 4.5 Hz, 1 Hz, 1H, H-9), 7.88 (s, 1H, H-3‟), 7.56-7.54 (m, 1H, H-4‟), 7,31-7.20 (m, 5H, H-phenyl), 5.74 (td, J = 11.5 Hz, 2.5 Hz, 1H, H- 11), 4.97-4.95 (m, 1H, H-19), 4.55-4.51 (m, 1H, H-5), 3.47-3.43 (dd, J = 11.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-13), 3.22-3.19 (m, 2H, H-6), 3.07 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-20), 2.72-2.76 (m, 1H), 2.70 (s, 3H, H-6‟), 2.55 (m, 1H, H-2), 2.41-2.39 (m, 1H, H-14), 2.25-2.30 (m, 1H, H-12), 2.18 (s, 3H, OAc), 1.95-1.93 (m, 1H, H-12), 1.78- 1.73 (m, 2H, H-4), 1.72-1.68 (m, 2H, H-21), 1.55-1.49 (m, 1H), 1.19 (d, J = 7 Hz, 3H, H-3), 1.15 (d, J = 7 Hz, 2H), 1.07 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23), 0.97 (d, J = 7 Hz, 3H, H-15), 0.94 (overlap, 3H, H-16), 0.76 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 177.6 (C-1), 173.4 (C-18), 170.2 (C- 10), 169.2 (CO-Ac), 169.1 (C-24), 165.6 (C-7), 163.4 (C-1‟), 149.4 (C-8), 147.2 (C- 5‟), 145.7 (C-2‟), 140.5 (C-3‟), 137.1 (C-4‟), 136.6 (C1-phenyl), 129.7, 128.8, 127.3, 126.9, 125.5 (C-9), 125.1 (C4-phenyl), 69.7 (C-11), 57.0 (C-19), 56.3 (C- 13), 55.7 (C-5), 53.7 (C-6), 39.5 (C-20), 39.0 (C-2), 37.5 (C-12), 36.6 (C-3), 34.3 (C-17), 31.9 (C-14), 29.7 (C-21), 24.1 (C-6‟), 20.8 (C-15,16), 16.2 (C-3), 13.8 (C- 23), 11.2 (C-22). Hợp chất 98, chất rắn màu vàng nhạt 55 [α]D 27 -26.75 (c 0.12, MeOD); HRMS-ESI [M+H] + : 758.3566 (Tính cho C41H52N5O7S: 758.3587). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.72 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H-3‟), 8.48 (d, J = 5.5 Hz, 1H, H-9), 8.02 (s, 1H, H- 8‟), 7.83 (d, J = 8 Hz, 1H, H-5‟), 7.78 (d, J = 8 Hz, 1H, H-7‟), 7.71 (t, J = 7 Hz, 1H, H-6‟), 7.66 (t, J = 7 Hz, 1H, H-2‟), 7.29-7.27 (m, 3H, H-phenyl), 7.22-7.20 (m, 2H, H-phenyl), 5.73 (dd, J = 11.5 Hz, 2.5 Hz, 1H, H-11), 5.10-5.05 (m, 1H, H-19), 4.59- 4.56 (m, 1H, H-5), 4.39-4.38 (br, 1H, H-13), 3.15 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.92-2.83 (m, 1H, H-6), 2.63-2.58 (m, 2H, H-14,20), 2.35-2.34 (m, 1H, H-2), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.05-1.97 (m, 2H, H-12), 1.82-1.73 (m, 2H, H-4), 1.68-1.62 (m, 2H, H-21), 1.19-1.17 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-3), 1.09 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-15), 1.04 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-16), 0.87 (d, J = 7 H, 3H, H-23), 0.81 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 175.7 (C-1), 173.3 (C-18), 170.1 (C- 10), 169.9 (CO-Ac), 165.7 (C-7), 160.5 (C-24), 150.2 (C-1‟), 147.8 (C-9‟), 140.5 (C-8), 137.4 (C1-phenyl), 132.3 (C-3‟), 131.4 (C-8‟), 130.9 (C-7‟), 130.4 (C-6‟), 129.7 (C-4‟), 128.5 (C-5‟), 128.4 (C2,6-phenyl) , 128.3 (C3,5-phenyl), 127.1, 124.3 (C-9), 122.3 (C4-phenyl), 117.3 (C-2‟), 74.2 (C-11), 69.6 (C-19), 53.9 (C-5), 48.8 (C-13), 47.0 (C-6), 41.8 (C-3), 40.9 (C-20), 40.7 (C-12), 37.4 (C-17), 37.0 (C-14), 34.6 (C-21), 31.4 (CH3-Ac), 20.8 (C-16), 20.1 (C-15), 17.5 (C-3), 16.1 (C-23), 15.8 (C-22). Hợp chất 99, chất lỏng không màu 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 9.11 (s, 1H, H-4‟), 8.42 (s, 1H, H-9), 8.04 (s, 1H, H-2‟), 7.26-7.18 (m, 5H, H-phenyl), 5.42 (dd, J = 10 Hz, 4 Hz, 1H, H- 11), 5.08-5.04 (m, 1H, H-1”), 4.66-4.59 (m, 2H, H-5, 19), 4.38 (m, 1H, H-13), 3.16 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.88-2.84 (m, 1H, H-6), 2.66 (s, 3H, H-5‟), 2.62-2.59 (m, 1H, H-2), 2.44-2.39 (m, 1H, H-20), 2.33-2.32 (t, J = 7 Hz, 1H, H-14), 2.14-2.08 (m, 1H, H2”), 2.03-1.99 (m, 2H, H-4), 1.91-1.85 (m, 2H, H-21), 1.73- 56 1.65 (m, 4H), 1.39-1.38 (br, 1H, H-5”), 1.36-1.30 (m, 1H, H-8”), 1.19-1.17 (d, J = 7,5 Hz, 3H, H-3), 1.08 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23). 1.05 (d, J = 7 Hz, 3H, H-15), 0.97 (t, J = 7 Hz, 3H, H-16), 0.90 (d, J = 7 Hz, 3H, H7”), 0.85 (d, J = 7 Hz, 3H, H-9”), 0.80 (d, J = 7 Hz, 3H, H-10”), 0.68 (d, J = 7 Hz. 3H, H-22). Hợp chất 100, chất lỏng không màu. [α]D 27 -2.82 (c 0.11, MeOD); HRMS-ESI: [M+H] + 861.4950 (Tính cho C47H69N6O7S: 861.4948). 1 H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.11 (s, 1H, H-4‟), 8.60 (s, 1H, H-9), 8.10 (s, 1H, H-2‟), 7.28-7.26 (m, 4H, H-phenyl), 7.21-7.18 (m, 1H, H4-phenyl), 5.78 (dd, J = 11 Hz, 3 Hz, 1H, H-11), 5.06 (t, J = 7 Hz, 1H, H-1”), 4.63 (td, J = 11 Hz, 4.5 Hz, 1H, H-19), 4.50 (brs, 1H, H-5), 4.41-4.36 (m, 1H, H- 13), 3.4-3.2 (m, 1H), 3.16 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.88-2.84 (m, 1H, H-6), 2.66 (s, 3H, H-5‟), 2.62-2.59 (m, 1H, H-20), 2.44-2.39 (m, 1H, H-2), 2.33- 2.32 (m, 1H, H-14), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.14-2.08 (m, 1H, H-2”), 2.03-1.99 (m, 2H, H-12), 1.91-1.85 (m, 2H, H-4), 1.73-1.65 (m, 4H, H-21, 6”), 1.39-1.38 (brd, 1H, H- 5”), 1.36-1.30 (m, 1H, H-8”), 1.19 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-3), 1.08 (d, 3H). 1.05 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.98-0.96 (t, 2H), 0,95 (t, J = 7 Hz, 2H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0,85 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-7”), 0,78 (d, J = 7 Hz, 3H, H-9”), 0,75 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-10”). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 177.5 (C-1), 174.6 (C-18), 171.7 (C- 10), 171.5 (CO-Ac), 164.8 (C-24), 162.7 (C-7), 159.1 (C-3‟), 150.9 (C-2‟), 144.6 (C-8), 143.6 (C-4‟), 142.8 (C-1‟), 139.4 (C1-phenyl), 130.5 (C-9), 129.3 (C3,5- phenyl), 127.4 (C2,6-phenyl), 125.1 (C4-phenyl), 75.6 (C-11), 71.1 (C-1”), 55.4 (C- 19), 50.6 (C-13), 49.5 (C-5), 49.3 (C-2”), 42.5 (C-6), 41.8 (C-6”), 38.8 (C-4), 38.3 (C-20), 38.2 (C-12), 35.5 (C-17), 35.4 (C-2), 32.6 (C-14), 31.0 (C-5”), 27.3 (CH3- Ac), 25.1 (C-3”,4”), 24.3 (C-8”), 22.4 (C-21), 21.6 (C-9”), 21.1 (C-10”), 20.8 (C- 7”), 20.4 (C-5‟), 19.9 (C-16), 18.5 (C-15), 16.6 (C-3), 16.4 (C-23), 11.4 (C-22). 57 Hợp chất 101, chất lỏng màu vàng nhạt [α]D 27 -10.69 (c 0.13, MeOD); MS-ESI [M+H] + : 892.5 (Tính cho C50H78N5O7S: 892.5622). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.00 (s, 1H, H-9), 7.22-7.20 (m, 4H, H-phenyl); 7.14 (d, J = 9 Hz 1H, H4-phenyl), 5.83 (br, 1H, H- 7‟), 5.69 (d, 1H, H-11). 5.32 (br, 2H, H-8‟), 5.12 (br, 1H, H-1‟‟), 4.72 (br, 1H, H- 19), 4.67-4.62 (m, 1H, H-1‟), 4.40-4.34 (br q, 1H, H-5), 3.14-3.08 (m, 1H, H-13), 3.02 (s, 3H, H-17), 2.98-2.93 (m, 2H, H-6), 2.91-2.88 (m, 2H, H-5‟), 2.58 (m, 1H, H-2), 2.31 (m, 2H, H-6‟), 2.16 (s, 3H, OAc), 2.03-1.99 (m, 2H, H-12), 1.91-1.85 (m, 2H, H-20, 2”), 1.73-1.65 (m, 4H), 1.39-1.38 (brd, 1H, H-14), 1.27 (t, J = 7 Hz, 6H), 1.18 (d, J = 7.5 Hz; 3H), 1.11-1.13 (m, 2H), 1,02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-10”), 0.99 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-9”), 0.92-0.90 (m, 6H, H-14,16), 0.90 (d, 3H, H-7”), 0.86 (d, J = 7 Hz, 3H, H-3), 0.82 (t, 3H, H-23), 0.71 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). * Tổng hợp các dẫn xuất tubulysin từ tripeptide 89. Các phản ứng tổng hợp tetrapeptide từ tripeptide 89 đƣợc thực hiện trong điều kiện tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp từ tripeptide 90, với tác nhân ghép nối HATU trong dung môi DMF, phản ứng ở nhiệt độ phòng trong khoảng 12-14 h. Quy trình phản ứng tổng hợp tetrapeptide 102, 105, 106 Muối trifluoroacetic của 89 (1 eq) trong DMF đƣợc thêm vào 10 eq DIPEA, và 1,1 eq các hợp chất axit (5-methyl pyrazine-2 carbocylic acid/N- methylpipecolinic acid/N-allylpipecolinic acid) đƣợc thêm vào tiếp sau, hỗn hợp đƣợc khuấy 15 phút ở nhiệt độ phòng và chất HATU (1,2 eq) tiếp tục đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 14h. Kết thúc phản ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng nƣớc, dịch EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi và tinh chế trên cột sắc ký silica gel (nHexan/EtOAc; 1/1) thu đƣợc các hợp chất 102, 105, 106 với hiệu suất từ 55-65%. 58 Quy trình phản ứng thủy phân tetrapeptide 102, 106 Các hợp chất ester 102, 106 trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2/1), đƣợc thêm vào 10eq LiOH. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 16h. Kết thúc phản ứng, dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm. Cặn thu đƣợc đƣợc thêm nƣớc và axit hóa với dung dịch HCl 5% đến pH  4, và chiết với EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Cất loại hết dung môi và tinh chế sản phẩm thô trên cột sắc ký silica gel (DCM/MeOH) thu đƣợc sản phẩm sạch 103, 107 với hiệu suất từ 70-80%. 2.2.9.3. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu C-terminal Hợp chất 102, chất lỏng không màu [α]D 27 +28.00 (c 0.12, MeOD); HRMS-ESI [M+H] + : 754.4220 (Tính cho C40H60N5O7S: 754.4213). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.14 (s, 1H, H-9), 7.30-7.19 (m, 5H, H-phenyl), 6.77 (d, J = 9 Hz, H-4), 5.75 (dd, J = 11 Hz, 3 Hz, 1H, H-11), 5.13 (q, J = 7 Hz, 1H, H-5), 4.78 (d, J = 7 Hz, 1H, H-19), 4.43 (m, 1H, H-13), 4.24 (q, J = 7.5 Hz, 1H, H-1‟), 4.21-4.16 (m, 2H, H-1‟‟), 3.14-3.11 (m, 2H, H-5‟), 3.07 (s, 3H, H- 17), 2.97-2.94 (dd, J = 11 Hz, 2.5 Hz, 2H, H-6), 2.61 (dd, J = 11 Hz, 3.5 Hz, 1H), 2.40 (td, J = 2.5 Hz, 11 Hz, 1H), 2.34 (m, 1H, H-20), 2.21 (s, 3H, H-6‟), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.14-2.07 (m, 2H, H-12), 1.88 (m, 1H, H-14), 1.71 (s, 3H, H-3), 1.78- 1.75 (m, 3H, H-2‟‟), 1.68-1.63 (m, 2H, H-21), 1.31-1.16 (t, J = 7 Hz, 6H, H- 2‟,3‟,4‟), 1.05 (d, J = 7 Hz, 3H, H-16), 1.02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-15), 0.94 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-23), 0.84 (d, J =6.5 Hz, 3H, H-22). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm 175.1 (C-18), 173.2 (C-10), 171.9 (C- 24), 171.7 (CO-Ac), 169.2 (C-1), 162.4 (C-7), 150.6 (C-8), 140.9 (C-3), 140.8 (C- 4), 138.6 (C1-phenyl), 130.4 (C-9), 129.4 (C-2), 127.7 (C3,5-phenyl), 125.6 (C2,6- phenyl), 125.4 (C4-phenyl), 71.2 (C-11), 70.5 (C-1‟), 69.1 (C-1”), 61.9 (C-19), 56.6 59 (C-13), 54.8 (C-5‟), 50.7 (C-5), 44.8 (C-6‟), 41.5 (C-20), 40.4 (C-17), 38.7 (C-12), 37.7 (C-14), 35.5 (C-21), 31.6 (C-2‟), 30.1 (C-4‟), 26.1 (C-3‟), 25.5 (CH3-Ac), 20.8 (C-15), 20.3 (C-16), 16.3 (C-2”), 14.5 (C-3), 12.8 (C-23), 11.1 (C-22). Hợp chất 103, chất rắn màu trắng [α]D 27 +1.91 (c 0.09, MeOD); HRMS-ESI: [M+H] + 684.3773 (Tính cho C36H54N5O6S: 684.3795), 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.07 (d, J = 11 Hz, 1H, H-9), 7.27 -7.19 (m, 5H, H-phenyl), 6.61 (brs,1H, H-4), 5.13 (br, 1H, H-11), 4.7-4.68 (m, 3H, H-1‟, H-5, H-19), 3.21-3.20 (m, 2H, H-5‟), 3.18 (s, 3H, H-17), 3.16-3.12 (m, 1H, H-6), 2.96-2.94 (dd, J = 7.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-6), 2.37 (s, 3H, H- 6‟), 2.11-1.94 (br, 2H, H-12), 1.88 (m, 1H, H-14), 1.76 (s, 3H, H-3), 1.51-1.43 (m, 3H), 1.31-1.16 (br s, 3H), 1.14 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23), 1.09-0.99 (overlap, 6H, H- 15,16), 0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). * Tổng hợp dẫn xuất 104 Ester 88 (250 mg, 0.45 mmol) trong 6 mL hỗn hợp dung môi THF/H2O (2/1), đƣợc thêm vào LiOH (108 mg, 4.5 mmol). Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng trong 14h. Kết thúc phản ứng, cất loại dung môi, phần rắn đƣợc thêm nƣớc, HCl 5% đến pH ≈ 4 và chiết với EtOAc, dịch chiết rửa với NaHCO3 và làm khan bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi nhận đƣợc sản phẩm acid trung gian (189.7 mg), hiệu suất phản ứng đạt 85%. Sản phẩm acid trung gian ở trên (160 mg, 0.32 mmol) trong DMF (3 mL) đƣợc thêm vào 4-(2-aminoethyl)benzensulfonamide (65.3 mg, 0.32 mmol) và DIPEA (1 mL), hỗn hợp đƣợc khuấy 15 phút ở nhiệt độ phòng. HATU (144.4 mg, 0.38 mmol) đƣợc thêm tiếp vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng trong 14h. Kết thúc phản ứng, thêm nƣớc rửa ba lần và chiết với EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi dƣới áp suất giảm, sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên sắc ký cột silica gel (DCM/MeOH, 15/1), nhận đƣợc dẫn xuất 104 (111.4 mg, 47 %), là chất lỏng màu vàng nhạt. 60 [α]D 27 +3.65 (c 0.13, MeOD); 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.15 (s, 1H, H-3), 7.85-7.83 (m, 2H, H-5”, H-7‟‟), 7.47 (dd, J= 3.5 Hz, 8.5 Hz, 2H, H-4”, H- 8”), 5.83 (dd, J = 3.5 Hz, 11 Hz, 1H, H-5), 4.47-4.42 (m, 1H, H-13), 3.69 (t, 3H, H1‟, H1”), 3.04 (t, 3H, H-7, H-2”), 2.91 (s, 3H, H-11), 2.76-2.75 (d, 1H, H-5‟), 2.39-2.34 (m, 1H, H-5‟), 2.27-2.21 (m, 1H, H-14), 2.13 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, H-6‟), 1.85-1.80 (m, 1H, H-8), 1.40 (t, 2H, H-15), 1.34 (br t, 6H), 1.08-1.02 (m, 3 H, H-10), 0.99- (d, J = 7 Hz, 3 H, H-9), 0.92 (t, 3H, H-17), 0.87 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-16). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 174.5 (C-12), 171.9 (C-4), 171.7 (CO-OAc), 163.2 (C-18), 161.5 (C-1), 150.8 (C-2), 145.2 (C-6”), 143.1 (C-3”), 130.5 (C-5‟,7”), 127.3 (C-4”,8”), 125.2 (C-3), 75.5 (C-5), 70.6 (C-1‟), 61.7 (C- 13), 57,4 (C-7), 54,9 (C-5‟), 41.4 (C- 6‟, C-1”), 36.3 (C-14), 35.6 (C-C-2”), 31.0 (C-11), 30.7 (C- 6), 29.6 (C-8), 21.9 (C-15, C-2‟), 20.9, 20.3, 20.1, 18.7 (C-9,10) 14.6 (C- 17), 11.5 (C-16) 2.2.9.4. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N- và C-terminal Hợp chất 105