MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN.3
1.1 Giới thiệu về các hợp chất ketone α,β-không no .3
1.1.1 Đặc điểm cấu tạo, quang phổ.3
1.1.2 Các hợp chất ketone α,β-không no có nguồn gốc thực vật.5
1.1.2.1 Các chalcone.5
1.1.2.2 Các flavone.7
1.1.2.3 Các ketone α,β-không no có nguồn gốc thực vật khác.8
a. Giới thiệu về zerumbone.9
b. Một số chuyển hóa chính của zerumbone .12
c. Giới thiệu về chalcone .14
1.1.3 Phản ứng tổng hợp chalcone.16
1.1.3.1 Tổng hợp chalcone bằng phản ứng Claisen-Schmidt.16
1.1.3.2 Tổng hợp chalcone bằng phản ứng Wittig .18
1.1.3.3 Tổng hợp chalcone từ các bazơ Schiff .19
1.1.3.4 Tổng hợp chalcone từ các hợp chất cơ kim.19
1.1.3.5 Tổng hợp chalcone từ các dẫn xuất α,β-dibromochalcone.20
1.1.3.6 Tổng hợp chalcone bằng phản ứng quang hóa Fries.20
1.1.3.7 Tổng hợp chalcone từ các β-chlorovinyl ketone .20
1.1.4 Hoạt tính sinh học của các ketone α,β-không no.21
1.1.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào.21
1.1.4.2 Hoạt tính chống sốt rét .23
1.1.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn.24
1.1.4.4 Hoạt tính kháng nấm .25
1.1.4.5 Hoạt tính kháng viêm .26
1.1.4.6 Hoạt tính kháng virus .27
1.2 Giới thiệu về hoạt tính IDO và hoạt tính ức chế sự hình thành và phát triển
khối u ba chiều trên thạch mềm .28
1.2.1 Hoạt tính ức chế IDO (indoleamine-2,3-dioxygenase).28
1.2.2 Hoạt tính ức chế sự hình thành và phát triển khối u 3 chiều trên thạchmềm.31
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.32ii
2.1 Đối tượng nghiên cứu.32
2.2 Phương pháp nghiên cứu.33
2.2.1 Đối với zerumbone và dẫn xuất zerumbone oxide .33
2.2.2 Đối với các phản ứng tổng hợp chalcone .34
2.3 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu. .35
2.3.1 Hóa chất, dung môi.35
2.3.2 Thiết bị dùng cho nghiên cứu .36
2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào .36
2.4.1 Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) .36
2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự hình thành và phát triển
khối u 3 chiều trên thạch mềm in vitro. .37
2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính IDO in vitro.38
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM.39
3.1 Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone.39
3.1.1 Tổng hợp các tổ hợp (112-114) của azazerumbone và azazerumboneoxide với AZT.39
3.1.1.1 Chuẩn bị các azazerumbone (102, 103) .39
a. Tổng hợp zerumbone oxime (100, 101) .39
b. Chuyển vị Beckmann zerumbone oxime.39
3.1.1.2 Chuẩn bị các azazerumbone oxide (107, 108) .40
a. Tổng hợp zerumbone oxide (104) .40
b. Tổng hợp zerumbone oxide oxime 105, 106.40
c. Chuyển vị Beckmann zerumbone oxide oxime.40
3.1.1.3 Tổng hợp các azazerumbone và azazerumbone oxide propargyl
(109-111) .40
3.1.1.4 Qui trình chung cho phản ứng đóng vòng Click triazole của các
azazerumbone propargyl (109, 110) và azazerumbone oxide propargyl
(111) với AZT.41
3.1.2 Tổng hợp các tổ hợp của các azazerumbone và azazerumbone oxide
với artemisinin (116-118) .41
3.1.2.1 Tổng hợp 2-(10β-dihydroarteminoxy)ethyl bromide (92) .42
3.1.2.2 Qui trình chung cho tổng hợp các tổ hợp của các azazerumbone,
azazerumbone oxide với artemisinin (116-118).42
3.1.3 Tổng hợp các tổ hợp của azazerumbone và azazerumbone oxide với
PBr 121-122 .43iii
3.1.3.1 Tổng hợp PBr 120 .43
3.1.3.2 Qui trình chung tổng hợp các sản phẩm của azazerumbone và
azazerumbone oxide với PBr (121-122).43
3.1.4 Tổng hợp azazerumbone acetic acid (124) .43
3.1.4.1 Tổng hợp ethyl azazerumbone acetate (123).43
3.1.4.2 Tổng hợp azazerumbone acetic acid (124).44
3.2 Tổng hợp các chalcone chứa các nucleobase và dẫn xuất có nguồn gốc
thiên nhiên .44
3.2.1 Tổng hợp các chalcone chứa vòng thymine (148-158) .44
3.2.1.1 Tổng hợp 5ꞌ-chloromethyl-2ꞌ-hydroxyacetophenone (126).44
3.2.1.2 Tổng hợp 5ꞌ-thyminylmethyl-2ꞌ-hydroxyacetophenone (127) .45
3.2.1.3 Tổng hợp 3-chloromethyl-4-methoxybenzaldehyde (130a).45
3.2.1.4 Qui trình chung cho tổng hợp các dẫn xuất của 4-
methoxybenzaldehyde (143-145) .45
3.2.1.5 Tổng hợp các chalcone chứa vòng thymine không chứa nhóm –
OH ở hợp phần aldehyde 148-152, 156-158 .46
3.2.1.6 Tổng hợp các chalcone chứa vòng thymine có nhóm –OH ở hợp
phần aldehyde 153-155.47
3.2.2 Tổng hợp các chalcone chứa vòng uracil 159-168 .50
3.2.2.1 Tổng hợp 5ꞌ-uracilylmethyl-2ꞌ-hydroxyacetophenone (128).50
3.2.2.2 Tổng hợp các chalcone chứa vòng uracil không chứa nhóm -OH
ở hợp phần aldehyde (159-162, 166-168) .50
3.2.2.3 Tổng hợp các chalcone chứa vòng uracil có hợp phần aldehyde
chứa nhóm –OH (163-165).51
3.2.3 Tổng hợp các chalcone chứa vòng 5-fluorouracil (171-179) .53
3.2.3.1 Tổng hợp 5ꞌ-(5-fluorouracilyl)methyl-2ꞌ-hydroxyacetophenone
(169).53
3.2.3.2 Qui trình chung cho tổng hợp 4-methoxy-3-
thyminylmethylbenzaldehyde (146) và 4-methoxy-3-
uracilylmethylbenzaldehyde (147) .53
3.2.3.3 Qui trình chung để tổng hợp các chalcone chứa vòng 5-
fluorouracil (171-179) .54
3.2.3.4 Tổng hợp các tổ hợp của chalcone và 5-fluorouracil thông qua
cầu liên kết 1,2,3 triazole (189-193).55
3.3 Tổng hợp các ketone α,β-không no khác .60iv
3.3.1 Tổng hợp các ketone α,β-không no chứa nhóm imidazole 196-202 .60
3.3.1.1 Tổng hợp 5ꞌ-(1-imidazolyl)methyl-2ꞌ-hydroxyacetophenone (195).60
3.3.1.2 Tổng hợp các chalcone chứa vòng imidazole .61
3.3.2 Tổng hợp các ketone α,β-không no chứa nhóm phenylacetamide 205-211.62
3.3.2.1 Tổng hợp 5ꞌ-cyanomethyl-2ꞌ-hydroxyacetophenone 203 .62
3.3.2.2 Tổng hợp 3'-acetyl-4'-hydroxyphenylacetamide 204 .62
3.3.2.3 Qui trình chung tổng hợp các 2'-hydroxy-5'-chalconylacetamide205-211.63
3.3.3 Tổng hợp các ketone α,β-không no chứa nhóm methoxymethyl 216-230.64
3.3.3.1 Tổng hợp các ketone α,β-không no chứa nhóm methoxymethyl từ
2ꞌ-hydroxyacetophenone 216-223 .64
a. Tổng hợp 5ꞌ-methoxymethyl-2ꞌ-hydroxyacetophenone 212.64
b. Tổng hợp các 5ꞌ-methoxymethyl-2ꞌ-hydroxychalcone 216-223.64
3.3.3.2 Tổng hợp các ketone α,β-không no chứa nhóm methoxymethyl từ
4ꞌ-hydroxyacetophenone 224-230 .65
a. Tổng hợp 3ꞌ-chloromethyl-4ꞌ-hydroxyacetophenone 214.65
b. Tổng hợp 3ꞌ-methoxymethyl-4ꞌ-hydroxyacetophenone 215 .66
c. Qui trình chung tổng hợp các 3ꞌ-methoxymethyl-4ꞌ-hydroxychalcone
224-230.66
3.3.4 Tổng hợp một số các chalcone chứa nhóm 4-isopropyl khác 233-237 .67
3.3.4.1 Qui trình chung tổng hợp các chalcone 233-235.67
3.3.4.2 Tổng hợp chalcone 236 .68
3.3.4.3 Tổng hợp 4'-hydroxy-3'-(piperidinylmethyl)-4-isopropylchalcone(237).68
3.4 Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các ketone α,β-không no tổng hợp
được.69
3.5 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sự hình thành và phát triển khối u 3 chiều trên
thạch mềm của một số ketone α,β-không no tổng hợp được .69
3.6 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế IDO. .69
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN.70
4.1 Tổng hợp một số dẫn xuất ketone α,β-không no có cấu trúc tương tự trong
thiên nhiên .70
4.1.1 Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone.70v
4.1.1.1 Tổ hợp của các azazerumbone với AZT.74
4.1.1.2 Tổ hợp các aza của zerumbone với dihydroartemisinin.80
4.1.1.3 Tổ hợp của các azazerumbone và azazerumbone oxide với PBr .85
4.1.1.4 Tổ hợp của các aza của zerumbone với acetic acid.87
4.1.2 Tổng hợp một số chalcone chứa thymine, uracil và dẫn xuất 5-
fluorouracil.89
4.1.2.1 Tổng hợp các hợp chất trung gian ketone chứa nhóm thymine,
uracil và aldehyde chứa các dẫn xuất của piperazine.90
4.1.2.2 Tổng hợp một số chalcone chứa thymine.93
4.1.2.3 Tổng hợp một số chalcone chứa uracil.99
4.1.2.3 Tổng hợp một số chalcone chứa dẫn xuất 5-fluorouracil.106
4.2 Tổng hợp các dẫn xuất ketone α,β-không no khác .118
4.2.1 Tổng hợp các dẫn xuất ketone α,β-không no có chứa imidazole .119
4.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất ketone α,β-không no có chứa nhóm
phenylacetamide .124
4.2.3 Tổng hợp các dẫn xuất ketone α,β-không no có chứa nhóm
methoxymethyl .127
4.2.4 Tổng hợp một số các chalcone chứa nhóm 4-isopropyl khác.131
4.3 Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất ketone α,β-không
no đã tổng hợp.133
4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất zerumbone.133
4.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các chalcone chứa các nucleoside.135
4.3.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các chalcone chứa thymine
và uracil .135
4.3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các chalcone chứa 5-fluorouracil.136
4.3.3 Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các chalcone chứa
nhóm acetamide .138
4.3.4 Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các chalcone chứa
nhóm methoxymethyl trong vòng A.139
4.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của hợp phần ketone đến hoạt tính gây độc tế
bào của các chalcone.
178 trang |
Chia sẻ: lavie11 | Lượt xem: 607 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số ketone α,β-Không no có cấu trúc tương tự trong thiên nhiên, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
e: Hiệu suất 61% (tinh thể
màu vàng cam); Tnc: 107-109
o
C, HR-ESI-MS phát hiện [M+Na]+ 305,11538 (tính toán
C18H18O3Na
+
: 305,11482).
3.3.4.2 Tổng hợp chalcone 236
Hòa tan một hỗn hợp gồm 162,8 mg (1,1 mmol) isopropylbenzaldehyde (134)
và 136 mg (1 mmol) 4'-hydroxyacetophenone (213) trong 15 ml ethanol thuyệt đối,
vừa khuấy vừa thêm 168 mg KOH vào và hỗn hợp được khuấy 24 giờ ở nhiệt độ
phòng. Loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, phần còn lại được hòa tan bằng nước và
trung hòa bằng dung dịch HCl 10%, chiết dịch nước với EtOAc (3 × 50 ml), hóa hợp
dịch chiết lại và làm khô bằng Na2SO4 khan, loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm cho
chalcone 236 thô, sản phẩm này được tinh sạch bằng sắc ký cột/silica gel dùng hệ
dung môi rửa giải n-hexane:ethyl acetate 3:1.
3.3.4.3 Tổng hợp 4'-hydroxy-3'-(piperidinylmethyl)-4-isopropylchalcone (237)
Chuẩn bị tác nhân cho phản ứng Mannich của 4-isopropyl-4ꞌ-hydroxychalcone
236 như sau: hòa tan 3,38 mmol piperidine bằng 20 ml ethanol trong bình cầu đáy trò
dung tích 100 ml, thêm vào đó 3,88 mmol paraformaldehyde và đun hồi lưu dung dịch
thu được để có tác nhân Mannich sẵn sàng cho phản ứng. Thêm nhanh 4-isopropyl-4ꞌ-
hydroxychalcone vào dung dịch chứa tác nhân đang hồi lưu và duy trì phản ứng trong
điều kiện như vậy 28 giờ liên tục, dung môi được loại bỏ dưới áp suất giảm, phần còn
lại được pha loãng với nước và chiết bằng CH2Cl2 (3 × 50 ml). Gộp các dịch
dichloromethane lại, rửa với nước muối bão hòa, làm khô bằng Na2SO4 khan, loại bỏ
dung môi trên máy cất quay chân không để cho sản phẩm chalcone Mannich 237 thô,
sản phẩm này được tinh sạch bằng sắc ký cột nhồi/silica gel rửa giải với hệ dung môi
n-hexane:chloroform 1:1.
69
3.4 Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các ketone α,β-không no tổng
hợp được
Các mẫu chalcone được pha với nồng độ 1 mg/mL DMSO, tùy theo khoảng
giới hạn nồng độ nghiên cứu mà các mẫu này được pha loãng thành các dung dịch có
các nồng độ thử nghiệm ban đầu khác nhau, các nồng độ dùng để đánh giá khả năng
gây độc tế bào trên vi phiến bằng phương pháp pha loãng liên tục nhằm tìm ra nồng độ
ức chế 50% tế bào ung thư (IC50) như đã trình bày ở chương II. Các mẫu được coi là
không có hoạt tính khi giá trị IC50 lớn hơn nồng độ thử nghiệm ban đầu.
3.5 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sự hình thành và phát triển khối u 3 chiều
trên thạch mềm của một số ketone α,β-không no tổng hợp được
Các mẫu được pha với nồng độ 5 μg/mL và nồng độ này được sử dụng cho việc
đánh giá hoạt tính ức chế với hình thành và phát triển của các khối u Hep-G2 trên
thạch mềm như đã mô tả trong chương II.
3.6 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế IDO.
Hoạt tính ức chế IDO được xác định theo phương pháp của Takikawa và cộng
sự [186] với một số cải biến. Hỗn hợp phản ứng (1 ml) chứa potassium phosphate
buffer (50 mM, pH 6,5), ascobic acid (20 mM), xúc tác (200 U/ml), methylene blue
(10 mM), L-tryptophan, IDO tái tổ hợp và chất ức chế với các nồng độ khác nhau.
Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 30 phút, sau đó dừng lại và thêm vào 200 µl
dung dịch 30% (v/v) của trichloroacetic acid. Sau khi sấy nóng ở 60-65oC trong 10-15
phút, hỗn hợp phản ứng được ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong máy ly tâm.
Dịch lỏng phía trên được trộn với 1,2 ml dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyde
trong acetic acid nồng độ 2% (w/v) để chuyển hoá toàn bộ kynurenine thành
kynurenine,N-p-dimethylaminobenzyliden. Sản phẩm chuyển hoá này được định
lượng tại bước sóng 480 nm từ đó xác định được hoạt tính ức chế IDO.
70
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Tổng hợp một số dẫn xuất ketone α,β-không no có cấu trúc tương tự
trong thiên nhiên
4.1.1 Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone
Trong phân tử zerumbone, 3 trung tâm phản ứng có thể được sử dụng để tạo ra
các dẫn xuất của sesquiterpen này bao gồm nối đôi biệt lập ở vị trí số 6 hoạt động như
một alkene, nhóm ketone α,β-không no tham gia vào các phản ứng cộng Michael hoặc
chuyển vị Beckmann, nhóm C=O tham gia vào các phản ứng ngưng tụ với các hợp
chất amine hoặc các hợp chất chứa nhóm methylene linh động. Khai thác theo các
hướng phản ứng này, khá nhiều các dẫn xuất mới của zerumbone đã được tổng hợp và
nghiên cứu các hoạt tính sinh học khác nhau trong đó chỉ có một số dẫn xuất được tạo
thành nhờ sự can thiệp hóa học vào nối đôi biệt lập thể hiện hoạt tính sinh học tốt, còn
lại hầu hết các dẫn xuất tạo ra bằng phản ứng phá hệ liên hợp ketone α,β-không no dẫn
đến sự giảm đáng kể hoặc mất hẳn hoạt tính sinh học. Sau khi tham khảo kỹ lưỡng về
tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone đã được đăng tải, ý tưởng của chúng tôi là thiết
kế, tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào các tổ hợp của zerumbone với các
hoạt chất khác nhưng vẫn phải giữ được nhóm ketone α,β-không no quan trọng của
zerumbone. Tuy nhiên, khó khăn gặp phải là bản thân zerumbone không có khả năng
tổ hợp với các hợp chất khác bằng các phản ứng hóa học thông thường do cấu trúc bền
vững của nó, ngay cả hướng tác động đến nối đôi biệt lập ở vị trí số 6, thông qua nhóm
epoxy bằng phản ứng với m-CPBA trong CH2Cl2 tiếp theo là mở vòng với các tác
nhân nucleophile nhưng cũng không thành công mặc dù nhiều loại xúc tác mở vòng
khác nhau đã được sử dụng như montmorillonite K10, Zn(ClO4)2.6H2O.
Một cách tiếp cận khác đã được chúng tôi thiết lập và dự kiến thực hiện, theo
đó các dẫn xuất azazerumbone có chứa nhóm ketone α,β-không no và hợp phần lactam
với đôi điện tử tự do không bị chia sẻ sp3 của nhóm -NH- được hình thành từ
zerumbone bởi phản ứng chuyển vị Beckmann trong sự có mặt của axít Lewis ZnCl2
[158], các hợp chất này được xem là hợp chất lý tưởng cho việc tổ hợp zerumbone với
các hợp chất khác. Để thực hiện ý tưởng này, trước hết nhóm ketone không no được
chuyển hóa thành nhóm oxime và dẫn xuất oxime của zerumbone được sắp xếp lại
theo phản ứng chuyển vị Beckmann xúc tác bởi ZnCl2 trong acetonitrile để hình thành
azazerumbone 102 và azazerumbone 103 với các hiệu suất 13,3% và 40% (sơ đồ 4.1).
71
Hiệu suất và các dữ liệu phổ NMR (phụ lục 1.1-1.4) hoàn toàn phù hợp với hiệu suất
và các dữ liệu cấu trúc do S.C Santoh Kumar và các cộng sự [158] công bố.
Sơ đồ 4.1: Quá trình tổng hợp các azazerumbone 102 và 103
Trên cơ sở chuyển vị Beckmann của zerumbone oxime, chúng tôi cũng đã tiến
hành phản ứng chuyển vị Beckmann với dạng oxime của zerumbone oxide 104. Trước
đó zerumbone oxide 104 cũng đã được nhóm chúng tôi tổng hợp và xác định cấu trúc
theo qui trình của Kitayama [156]. Theo Kitayama cấu hình của zerumbone oxide ở C-
6 và C-7 là R,R với tín hiệu của H-6 ở dạng doublet doublet có J1 =1,4 Hz và J2 = 11,3
Hz, trong sản phẩm zerumbone oxide của chúng tôi tín hiệu của H-6 cũng có dạng
doublet doublet với J1 = 1,5 Hz và J2 = 11,0 Hz nên chúng tôi cho rằng cấu hình của C-
6 (61,0 ppm), C-7 (61,4 ppm) trong zerumbone oxide nhận được là R,R giống như
Kitayama đã công bố. Tiếp theo zerumbone oxide oxime 105, 106 được tổng hợp bằng
phản ứng ngưng tụ zerumbone oxide 104 với hydroxylamine hydrochloride trong
ethanol với sự có mặt của K2CO3 để tạo thành hỗn hợp 2 dạng E và Z của zerumbone
oxide oxime 105, 106 với hiệu suất tổng là 87% (sơ đồ 4.2).
Sơ đồ 4.2: Quá trình tổng hợp các azazerumbone oxime
Cấu trúc của zerumbone oxide oxime cũng dễ dàng được xác định bằng các phổ
NMR và HRMS (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR của 104 và 105/106
STT zerumbone oxide 104 zerumbone oxide oxime 105, 106
Vị trí H, J C H, J C
1 - 202,1 - 159,4
2 - 138,6 - 134,6
3 6,15 (1H; m) 147,8 5,60 (1H; d; J = 9,5 Hz) 137,7
4 2,28-2,33 (1H; m) và
2,34-2,41 (1H; m)
24,3
2,17-2,20 (1H; m) và 2,24-
2,33 (1H; m)
24,0
72
5 2,10-2,14 (1H; m) và
1,28-1,33 (1H; m)
37,4
2,05-2,08 (1H; m) và 1,17-
1,23 (1H; m)
37,9
6 - 61,0 - 61,0
7 2,81 (1H; dd; J1 = 11 Hz,
J2 = 1,5 Hz)
61,4 2,73 (1H; d; J = 10,5 Hz) 61,6
8 1,79 (1H; d; J = 14,0 Hz)
và 1,40 (1H; dd; J1 = 14
Hz, J2 = 11 Hz)
42,1
1,73 (1H; d; J = 13,5 Hz)
và 1,17- 1,23 (1H; m)
42,3
9 - 35,7 - 35,3
10 6,08 (1H; s) 159,2 5,62 (1H; d; J = 16,5 Hz) 150,8
11 6,08 (1H; s) 128,1 6,33 (1H; d; J = 16,5 Hz) 121,7
12 1,75 (3H; s) 11,9 1,83 (3H; s) 15,1
13 1,15 (3H; s) 15,4 1,11 (3H; s) 15,4
14 1,27 (3H; s) 23,6 1,25 (3H; s) 30,2
15 1,03 (3H; s) 29,4 1,01 (3H; s) 23,7
Phổ khối ESI+/TOF-MS của 105 và 106 cho mảnh ion [M+H]+ ở m/z 250,18053
tương ứng với công thức phân tử M là C15H23NO2 với sai số so với giá trị tính toán
theo lý thuyết là -1,49 ppm.
Hỗn hợp 2 dạng này được chuyển hóa thành 2 dạng azazerumbone oxide 107 và
108 bằng phản ứng chuyển vị Beckmann xúc tác bởi ZnCl2 trong acetonitrile với các
hiệu suất tương ứng là 9,9% và 39,1%. Cơ chế chuyển vị Beckmann của zerumbone
oxide oxime như sau (sơ đồ 4.3):
Sơ đồ 4.3: Quá trình tổng hợp các azazerumbone oxide 107 và 108
Ngoài ra, chúng tôi cũng đã thử nghiệm tổng hợp 107 và 108 bằng phản ứng
epoxy hóa nối đôi biệt lập của 102 và 103 theo sơ đồ 4.4 sau:
Sơ đồ 4.4: Quá trình epoxy hóa các azazerumbone
73
Phản ứng epoxy hóa các azazerumbone bằng m-CPBA được thực hiện trong cả
dichloromethane và ethylacetate, tuy vậy trong cả hai trường hợp sau 8 giờ ở 0oC, tiếp
theo là 48 giờ ở nhiệt độ phòng sản phẩm chính tạo thành rất ít, chất đầu còn nhiều
(TLC). Như vậy, hướng tổng hợp các azazerumbone oxide bằng cách epoxy hóa các
azazerumbone tương ứng bằng m-CPBA cho hiệu quả rất thấp.
Cấu trúc của các azazerumbone oxide 107 và 108 được minh chứng bằng các
phổ 1D và 2D-NMR (Bảng 4.2) và HRMS.
Trong phổ 1H-NMR của sản phẩm phụ azazerumbone oxide 107 (phụ lục 1.10-
1.14), một doublet ở 9,37 ppm (J = 9,5 Hz) không có tương tác với bất kỳ cacbon nào
trong phổ HSQC được gán cho proton của nhóm NH, tín hiệu này cũng cho phép
chúng ta xác định phản ứng chuyển vị Beckmann do dạng Z của zerumbone oxide
oxime tham gia để tạo ra nhóm NH bên phía trái nhóm C=O, các tín hiệu của cặp
proton olefin H-11 và H-12 ở dạng trans (J = 14,5 Hz) xuất hiện tại các vị trí có độ
chuyển dịch hóa học lần lượt là 4,87 ppm (d, J = 14,5 Hz) và 6,08 ppm (dd, J1 = 9,5
Hz, J2 = 14,5 Hz), proton olefin H-4 còn lại xuất hiện dưới dạng doublet (không tách
vạch) ở 5,58 ppm. Một doublet ở 2,62 ppm (J = 7 Hz) là của proton H-8, các proton
của các nhóm –CH2 ở vị trí 5 và 6 đều xuất hiện dưới dạng multiplet trong khi 2 proton
H-9a và H-9b được quan sát thấy dưới dạng doublet doublet ở 1,80 ppm (J1 = 7 Hz, J2
= 15,5 Hz) và doublet ở 1,36 ppm (J = 15,5 Hz). Tiếp theo, phân tích các tương tác
trong các phổ HSQC và HMBC cho phép chúng ta qui kết chính xác các proton còn lại
và toàn bộ các nguyên tử cacbon trong azazerumbone oxide 107.
Đối với sản phẩm chính azazerumbone oxide 108, phổ NMR 1D và 2D (phụ lục
1.15-1.19) chỉ ra một tín hiệu singlet ở 8,55 ppm là của nhóm –NH- không có tương
tác trong phổ HSQC và có tương tác C-3 (120,8 ppm) và C-11 (123,9 ppm) trong phổ
HMBC. Điều này cũng cho phép chúng ta khẳng định dạng E của zerumbone oxide
oxime đã tham gia phản ứng chuyển vị Beckmann và nhóm -NH- được chèn vào bên
phải của nhóm C=O. Ngoài ra, 2 tín hiệu doublet có J = 15,8 Hz ở 6,35 ppm và 5,89
ppm được qui cho H-4 (H-β) và H-3 (H-α) thuộc nhóm ketone α,β-không no của
azazerumbone oxide. Proton olefin còn lại (H-11) được quan sát thấy ở 4,79 ppm (d, J
= 11 Hz), một doublet ở 2,58 ppm (J = 7 Hz) là của proton H-7, tín hiệu doublet ở 1,46
ppm (J = 15 Hz) và doublet doublet ở 1,83 ppm (J1 = 8,5 Hz, J2 = 15,5 Hz) được qui
cho 2 proton H-6a và H-6b, sử dụng thêm các phổ HSQC, HMBC cho phép chúng ta
khẳng định chính xác cấu trúc của azazerumbone oxide.
74
Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 107 và 108
STT azazerumbone oxide 107 azazerumbone oxide 108
Vị trí H, J C H, J C
N 9,37 (1H; d; J = 9,5 Hz) 8,55 (1H; s)
2 - 171,7 - 166,2
3 - 129,5 5,89 (1H; d; J = 15,5 Hz) 120,8
4 5,48 (1H; d; J = 10,5 Hz) 135,8 6,35 (1H; d; J = 16,0 Hz) 148,5
5
2,12 (1H; m)
2,38 (1H; m)
24,0 - 36,2
6
1,26 (1H; m)
2,12 (1H, m)
37,4
1,46 (1H; d; J = 15,0 Hz)
1,83 (1H; dd; J1 = 8,5 Hz; J2 =
15,5 Hz)
37,5
7 - 60,0 2,58 (1H; d; J = 7 Hz br) 61,4
8 2,62 (1H; d; J = 7,0 Hz) 61,2 - 60,3
9
1,80 (1H; dd; J1 = 7,0 Hz; J2
= 15,5 Hz)
1,36 (1H; d; J = 15,5 Hz)
37,6
1,27 (1H; m)
2,06 (1H; m)
37,8
10 - 34,6
2,22 (1H; m)
2,14 (1H; m)
23,8
11 4,87 (1H; d; J = 14,5Hz) 117,9 4,79 (1H; d; J = 11,0Hz) 123,9
12
6,08 (1H; dd; J1 = 9,5 Hz; J2
= 14,5 Hz)
126,2 - 131,7
13 1,76 (3H; s) 13,3 1,73 (3H; s) 16,9
14 1,16 (3H; s) 15,9 1,18 (3H; s) 15,8
15 1,12 (3H; s) 26,9 1,00 (3H; s) 30,6
16 0,96 (3H; s) 32,5 1,19 (3H; s) 25,8
Tiếp theo, các azazerumbone 102, 103 và azazerumbone oxide 108 được sử
dụng để tổ hợp với các hoạt chất dùng làm thuốc hoặc các hợp chất như AZT dùng
trong điều trị HIV, thuốc chống sốt rét dihydroartemisinin và hợp chất [4-(4-
fluorophenyl)-6-isopropyl-2-(N-methyl-N-methylsunfonylamino) pyrimidin-5-yl]
methanol (PM) dùng trong tổng hợp thuốc hạ mỡ máu rosuvastatin, ngoài ra
azazerumbone cũng được gắn thêm nhóm –CH2COOH vào để làm tăng khả năng tan
trong nước và cuối cùng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất này.
4.1.1.1 Tổ hợp của các azazerumbone với AZT
Trước hết, các azazerumbone và azazerumbone oxide được tổ hợp với AZT, sở
dĩ các tổ hợp này được lựa chọn vì gần đây một số các chalcone, flavone hoặc các
triterpene được ghép nối với AZT thông qua cầu liên kết 4-methylen-1,2,3-triazole thể
hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với một số dòng tế bào ung thư MCF-7, P338,
Hep-G2 và KB [163, 164]. Để tổng hợp các dẫn xuất này, trước hết các azazerumbone
102, 103 và azazerumbone oxide 108 được chuyển hóa thành các dẫn xuất N-propargyl
azazerumbone và N-propargyl azazerumbone oxide (109, 110 và 111) tương ứng bằng
phản ứng N-alkyl hóa các azazerumbone này với propargyl bromide xúc tác bởi NaH
75
trong THF khan. Trong các phản ứng này lượng propargyl bromide được lấy dư để các
azazerumbone và azazerumbone oxide chuyển hóa hết, tiến trình phản ứng được kiểm
soát bằng sắc ký bản mỏng hệ dung môi n-hexane:EtOAc để xác định điểm kết thúc
của phản ứng. Sơ đồ chuyển hóa các azazerumbone và azazrumbone oxide như sau:
Sơ đồ 4.5: Tổng hợp các dẫn xuất propargyl của các azazerumbone
và azazerumbone oxide
Cấu trúc của các N-propargyl azazerumbone 109, 110 và N-propargyl
azazerumbone oxide 111 được khẳng định bằng các phương pháp phổ NMR và HRMS
(phụ lục 1.26-1.28, bảng 4.3). Dưới đây, hợp chất N-propargyl azazerumbone 110
được lấy làm ví dụ điển hình cho việc xác định cấu trúc của các N-propargyl-
azazerumbone và N-propargylazazerumbone oxide.
Trong phổ 1H-NMR của hợp chất trung gian N-propargyl azazerumbone 110,
ngoài các tín hiệu proton của các hợp phần azazerumbone phù hợp với các tín hiệu
proton của azazerumbone 103 còn xuất hiện thêm các tín hiệu singlet tù của 2 proton
thuộc nhóm methylene của propargyl ở 4,16 ppm, tiếp theo một triplet với J = 2,5 Hz
của proton còn lại trong nhóm methin của propargyl tại 3,02 ppm. Các nguyên tử
cacbon của nhóm propargyl (C-17, C-18 và C-19) trong N-propargyl azazerumbone
110 cũng dễ dàng quan sát thấy tại các vị trí có độ chuyển dịch hóa học tương ứng là
33,0; 80,1 và 73,3 ppm. Kết quả so sánh phổ 13C-NMR của 110 với 103 cho thấy, vị trí
tín hiệu của các nguyên tử cacbon còn lại thuộc khung azazerumbone của 110 hoàn
toàn phù hợp với các vị trí tín hiệu của các nguyên tử cacbon tương ứng trong phổ
76
13
C-NMR của azazerumbone 103. Kết quả đo phổ khối lượng ESI+/TOF-MS của N-
propargyl azazerumbone 110 cho mảnh [M+H]+ = 272,20053 hoàn toàn phù hợp với
công thức phân tử C15H25NO của N-propargylazazerumbone 110.
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 109, 110, 111
STT
N-propargyl
azazerumbone 109
N-propargyl
azazerumbone 110
N-propargyl
azazerumbone oxide 111
Vị trí H, J C H, J C H, J C
2 - 170,8 165,0 - 164,6
3 - 128,8
5,81 (1H; d; J = 16
Hz)
122,6
5,90 (1H; d; J =
15,5 Hz)
120,7
4
5,33 (1H; t; J =
7,25 Hz)
136,4
6,21 (1H; d; J = 16
Hz)
148,1
6,46 (1H; d; J =
15,5 Hz)
149,5
5 2,32 (2H; m) 24,5 38,1 - 36,2
6
2,23 (2H; t; J = 6,0
Hz)
38,4 2,11 (2H; m) 36,0
1,42 (1H; d; J =
15,5 Hz); 1,91 (1H;
m)
37,5
7 - 133,7 5,01 (1H; m) 124,5
2,53 (1H; d; J = 6,5
Hz)
61,2
8
5,13 (1H; t; J = 6,0
Hz)
124,7 133,6 - 60,0
9
2,09 (2H; d; J = 6,5
Hz)
38,0 2,19 (2H; m) 39,3
1,20 (1H; m)
2,07 (1H; m)
37,6
10 - 34,8 2,28 (2H; m) 24,9
2,35 (1H; m)
2,14 (1H; m)
24,2
11
4,93 (1H; d; J = 15
Hz)
119,1 4,99 (1H; m) 132,1
5,07 (dd; J = 2 Hz;
J = 11 Hz)
131,2
12
6,41 (1H; d; J = 15
Hz )
128,6 133,5 - 133,9
13 1,75 (3H; s) 13,5 1,82 (3H; s) 14,9 1,89 (3H; s) 16,3
14 1,53 (3H; s) 14,8 1,56 (3H; s) 14,8 1,22 (3H; s) 15,0
15 1,06 (3H; s) 30,1 1,06 (3H; s) - 1,00 (3H; s) 30,4
16 1,06 (3H; s) 30,1 1,06 (3H; s) - 1,19 (3H; s) 26,1
17
4,30 (2H; d; J = 2,5
Hz)
32,0 4,16 (2H; s br) 33,0
4,41 (1H; dd; J1 =
2,5 Hz; J2 = 17,5
Hz); 4,00 (1H; dd;
J1 = 2,5 Hz; J2 =
17,5 Hz)
32,9
18 - 79,4 80,1 - 80,0
19
3,08 (1H; t; J = 2,5
Hz)
73,4
3,02 (1H; t; J = 2,5
Hz)
73,3
3,06 (1H; t; J = 2,5
Hz)
73,5
Tiếp theo, các dẫn xuất 109, 110 và 111 được nối với AZT thông qua phản ứng
Click đóng vòng triazole (Click triazole cyclisation) giữa các nhóm propargyl của các
dẫn xuất trên và nhóm azido của AZT để tạo thành các sản phẩm đích 112, 113 và 114.
Phản ứng thực hiện với các lượng đẳng mol của các azazerumbone hoặc
azazerumbone oxide và AZT trong dung môi DMSO xúc tác bởi CuI với thời gian 12
giờ ở nhiệt độ phòng, cơ chế của phản ứng này sẽ được đề cập đến trong phần tổng
hợp các dẫn xuất của 5-fluorouracil.
77
Sơ đồ 4.6: Quá trình tổng hợp các tổ hợp của azazerumbone và
azazerumbone oxide với AZT
Cấu trúc của các phẩm đích được khẳng định bằng các phương pháp phổ (phụ
lục 1.29-1.39) gồm 1D và 2D-NMR và phổ HRMS. Quan sát phổ 1H-NMR và 13C-
NMR của các tổ hợp 112-114 cho thấy tín hiệu của các proton và các cacbon trong
hợp phần AZT và triazole là giống nhau với độ lệch về độ chuyển dịch hóa học so với
nhau < 1ppm. Tuy nhiên, do tín hiệu proton H-5ꞌ của vòng triazole và tín hiệu H-6ꞌꞌꞌ
của vòng thymine xuất hiện gần nhau và cùng độ bội singlet, thêm nữa tín hiệu của các
proton và cacbon trong vòng đường cũng xuất hiện rất gần nhau dẫn tới sự khó khăn
cho việc qui kết chính xác. Bởi vậy hợp chất 112 được lấy làm đại diện để qui kết
chính xác các proton và cacbon này nhờ sử dụng thêm các phổ 2 chiều HSQC và
HMBC, các chất 113 và 114 dễ dàng được qui kết phổ NMR theo 112.
Từ phổ HSQC của 112 (hình 4.1), tín hiệu cacbon ở 83,9 ppm được xác định
của C-1ꞌꞌ do tương tác với proton H-1ꞌꞌ ở 6,40 ppm (t, J = 6,5 Hz), một singlet tại 7,80
ppm do H-6ꞌꞌꞌ của hợp phần AZT sinh ra tương ứng với tín hiệu cacbon của nó ở 136,2
ppm, 2 tín hiệu ở trường thấp còn lại 8,04 ppm và 11,3 ppm lần lượt được qui cho H-5ꞌ
và proton của nhóm -NH- (H-3ꞌꞌꞌ) với C-5ꞌ ở 122,9 ppm.
Các tương tác giữa các proton và cacbon trong phổ HMBC (hình 4.2) bao gồm
(H-1ꞌꞌ với C-2ꞌꞌꞌ và C-6ꞌꞌꞌ), (H-2ꞌꞌ với C1ꞌꞌ và C3ꞌꞌ), (4ꞌ-CH2- với C-4ꞌ, C-5ꞌ, C-2 và C-12),
78
(H-4 với C-2 và C-13), (H-14 với C-6 và C-8) và (H-15, H-16 với C-9 và C-11) đã chỉ
ra toàn bộ các proton và các nguyên tử cacbon trong phân tử 112 và cấu trúc của 112
đúng như dự đoán.
Hình 4.1: Một phần phổ HSQC của 112
Hình 4.2: Một phần phổ HMBC của 112
79
Cuối cùng, phổ khối phân giải cao ESI+/TOF-MS của các hợp chất gồm 112,
113 và 114 cũng được đo để khẳng định công thức phân tử của các chất vừa được xác
định. Kết quả cho thấy các hợp chất 112, 113 và 114 cho mảnh ion proton hoá phân tử
[M+H]
+
lần lượt là m/z 539,29783; 539,29760 và 555,29243 tương ứng với công thức
phân tử C28H38N6O5, C28H38N6O5 và C28H38N6O6 với sai số lần lượt là -0,35 ppm, 0,08
ppm và 0,23 ppm hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của các chất tương ứng
vừa được xác định ở trên.
Chi tiết các dữ liệu cấu trúc của tất cả các tổ hợp của các azazerumbone,
azazerumbone oxide với AZT được đưa ra ở Bảng 4.4:
Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 112, 113, 114
STT 112 113 114
Vị trí H, J C H, J C H, J C
2 171,3 165,4 164,8
3
129,0 5,85 (1H; d; J =
15,5 Hz)
123,1 5,93 (1H; d; J = 16
Hz)
121,0
4
5,26 (1H; t; J = 5,0
Hz)
136,1 6,21 (1H; d; J =
15,5 Hz)
147,8 6,46 (1H; d; J = 16
Hz)
149,1
5 2,31 (2H; m) 24,5 36,1 36,2
6
2,23 (2H; m) 38,4 2,15 (2H; s br) 38,1 1,42 (1H; d; J =
15,5 Hz); 1,88 (1H;
d; J = 7 Hz)
37,5
7
133,6 4,97 (1H; t, J = 6
Hz)
124,5 2,50 (1H; m)
61,3
8
5,10 (1H; t; J =
5,75 Hz)
124,7 134,0 60,1
9
2,06 (2H; d; J = 6,0
Hz)
37,9 2,15 (2H; s br) 39,0 1,14 (1H; m)
2,06 (1H; m)
37,7
10
34,8 2,15 (2H; s br) 25,0 2,06 (1H; m)
2,29 (1H; m)
24,1
11
4,94 (1H; d; J = 15
Hz)
119,2 4,86 (1H; t; J = 7-
7,5 Hz)
131,9 4,95 (1H; d; J = 11
Hz)
130,9
12
6,44 (1H; d; J = 15
Hz)
129,1 - 133,7 - 134,4
13 1,78 (3H; s) 13,6 1,83 (3H; s) 14,9 1,91 (3H; s) 16,3
80
14 1,53 (3H; s) 14,9 1,57 (3H; s) 15,0 1,21 (3H; s) 15,2
15 0,99 (3H; s) 30,0 1,01 (3H; s) 30,5
16 0,99 (3H; s) 30,0 1,19 (3H; s) 26,2
17
4,77 (2H; s) 38,3 8,06 (2H; s) 38,9 4,17 (1H; m)
4,82 (1H; m)
40,4
4ꞌ 143,6 143,9 143,8
5ꞌ 8,04 (1H; s) 122,8 - 122,9 8,09 (1H, s) 123,2
1ꞌꞌ
6,40 (1H; t; J = 6,5
Hz)
83,9 6,40 (t; J = 6,5 Hz) 83,9 6,40 (1H; m) 83,8
2ꞌꞌ
2,62 (1H; m)
2,69 (1H; m)
37,1 2,60 (1H; m)
2,70 (1H; m)
37,1 2,60 (1H; m)
2,70 (1H; m)
37,1
3ꞌꞌ 5,34 (1H; m) 59,0 5,32 (1H; m) 59,0 5,32 (1H; m) 59,0
4ꞌꞌ 4,17 (1H; m) 84,4 4,16 (1H; m) 84,4 4,17 (1H; m) 84,4
5ꞌꞌ
3,59 (1H; m)
3,68 (1H; m)
60,7 3,58 (1H; m)
3,67 (1H; m)
60,7 3,58 (1H; m)
3,67 (1H; m)
60,7
2ꞌꞌꞌ 150,4 150,4 150,4
3ꞌꞌꞌN 11,3 (1H; s) 11,32 (1H; s) 11,33 (1H; s)
4ꞌꞌꞌ 163,7 163,7 163,7
5ꞌꞌꞌ 109,6 109,6 109,6
6ꞌꞌꞌ 7,80 (1H; s) 136,2 7,80 (1H; s) 136,2 7,80 (1H; s) 136,2
7ꞌꞌꞌ 1,80 (3H; s) 12,2 1,80 (1H; s) 12,2 1,80 (3H; s) 12,2
4.1.1.2 Tổ hợp các aza của zerumbone với dihydroartemisinin
Một cách tổ hợp khác cũng được chúng tôi thiết kế, tổng hợp, xác định cấu trúc
và thử hoạt tính gây độc tế bào là các hợp chất lai hóa giữa các azazerumbone và
azazerumbone oxide với dihydroartemisinin, các hợp chất mới tạo thành được mong
chờ thể hiện hoạt tính gây độc tế bào vốn có của cả hai sesquiterpene này. Theo các tài
liệu tham khảo, artemisinin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khá ấn tượng và cầu
peroxide được xác định là trung tâm hoạt tính của các dẫn xuất này nhờ tương tác với
các ion sắt có hàm lượng cao trong các tế bào ung thư. Tuy vậy, cầu peroxide của
artemisinin rất dễ bị phá vỡ bởi các tác nhân kiềm hoặc axít trong quá trình phản ứng.
Do đó, kế hoạch tổng hợp các tổ hợp này được chúng tôi đưa ra theo hai hướng nhằm
giữ lại được trung tâm hoạt tính quan trọng này.
Hướng thứ nhất: Con đường tổng hợp chất đích này được thiết kế thông qua
sự tạo thành các mạch ancol béo gắn với các azazerumbone (ví dụ hợp chất 115), tiếp
theo chất này được ether hóa với dihydroartemisinin để tạo thành sản phẩm đích 116.
Tuy nhiên ngay ở phản ứng alkyl hóa azazerumbone bằng 2-bromoethanol, hiệu
suất thu được rất thấp mặc dù đã khảo sát các điều kiện phản ứng và sử dụng các xúc
tác bazơ khác nhau, kể cả việc bảo vệ nhóm -OH bằng THP. Tiếp theo, phản ứng ether
hóa cũng không chọn lọc và khó phân lập sản phẩm chính, vì vậy hướng tiếp cận thứ
hai được thiết lập để khắc phục các khó khăn này.
81
Sơ đồ phản ứng như sau:
Sơ đồ 4.7: Quá trình tổ hợp giữa azazerumbone với artemisinin theo con đường 1
Hướng thứ hai: Trước hết, dẫn xuất 2-(10-dihydroartemisinoxy)ethyl
bromide 92 được tạo thành với hiệu suất 46% (M = 390,2 và Tnc: 155-157
o
C) bằng
phản ứng ngưng tụ giữa DHA và 2-bromoethanol ở 0oC theo tài liệu [159], tiếp theo
tác nhân alkylbromide của dihydroartemisinin này được dùng cho phản ứng N-alkyl
hóa azazerumbone dưới xúc tác chuyển pha (1-butyl)triethylammonium
bromide/K2CO3 với sự có mặt KI trong dung môi DMF để cho sản phẩm đích với hiệu
suất trung bình. Sơ đồ phản ứng như sau:
Sơ đồ 4.8: Quá trình tổ hợp giữa azazerumbone với artemisinin theo con đường 2
Trên cơ sở tổng hợp tổ hợp 116, tổ hợp 117 của azazerumbone 102 và tổ hợp
118 của azazerumbone oxide 108 với dihydroartemisinin cũng đã được chúng tôi tổng
hợp thành công với hiệu suất trung bình.
Cấu trúc của các sản phẩm được chứng minh bằng các phương pháp phổ NMR
và HRMS (phụ lục 1.40-1.48). Trong các phổ 1H và 13C-NMR của 3 chất trên (bảng
4.5), các proton và cacbon ở hợp phần dihydroartemisinin có độ chuyển dịch hóa học
giống nhau và đều có các tín hiệu đặc trưng của các nguyên tử cacbon bậc 4 gắn
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- tv_tong_hop_va_nghien_cuu_hoat_tinh_sinh_hoc_cua_mot_so_ketone_khong_no_co_cau_truc_tuong_tu_trong_t.pdf