Luận án Tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số ketone α,β-Không no có cấu trúc tương tự trong thiên nhiên

e: Hiệu suất 61% (tinh thể màu vàng cam); Tnc: 107-109 o C, HR-ESI-MS phát hiện [M+Na]+ 305,11538 (tính toán C18H18O3Na + : 305,11482). 3.3.4.2 Tổng hợp chalcone 236 Hòa tan một hỗn hợp gồm 162,8 mg (1,1 mmol) isopropylbenzaldehyde (134) và 136 mg (1 mmol) 4'-hydroxyacetophenone (213) trong 15 ml ethanol thuyệt đối, vừa khuấy vừa thêm 168 mg KOH vào và hỗn hợp được khuấy 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, phần còn lại được hòa tan bằng nước và trung hòa bằng dung dịch HCl 10%, chiết dịch nước với EtOAc (3 × 50 ml), hóa hợp dịch chiết lại và làm khô bằng Na2SO4 khan, loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm cho chalcone 236 thô, sản phẩm này được tinh sạch bằng sắc ký cột/silica gel dùng hệ dung môi rửa giải n-hexane:ethyl acetate 3:1. 3.3.4.3 Tổng hợp 4'-hydroxy-3'-(piperidinylmethyl)-4-isopropylchalcone (237) Chuẩn bị tác nhân cho phản ứng Mannich của 4-isopropyl-4ꞌ-hydroxychalcone 236 như sau: hòa tan 3,38 mmol piperidine bằng 20 ml ethanol trong bình cầu đáy trò dung tích 100 ml, thêm vào đó 3,88 mmol paraformaldehyde và đun hồi lưu dung dịch thu được để có tác nhân Mannich sẵn sàng cho phản ứng. Thêm nhanh 4-isopropyl-4ꞌ- hydroxychalcone vào dung dịch chứa tác nhân đang hồi lưu và duy trì phản ứng trong điều kiện như vậy 28 giờ liên tục, dung môi được loại bỏ dưới áp suất giảm, phần còn lại được pha loãng với nước và chiết bằng CH2Cl2 (3 × 50 ml). Gộp các dịch dichloromethane lại, rửa với nước muối bão hòa, làm khô bằng Na2SO4 khan, loại bỏ dung môi trên máy cất quay chân không để cho sản phẩm chalcone Mannich 237 thô, sản phẩm này được tinh sạch bằng sắc ký cột nhồi/silica gel rửa giải với hệ dung môi n-hexane:chloroform 1:1. 69 3.4 Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các ketone α,β-không no tổng hợp được Các mẫu chalcone được pha với nồng độ 1 mg/mL DMSO, tùy theo khoảng giới hạn nồng độ nghiên cứu mà các mẫu này được pha loãng thành các dung dịch có các nồng độ thử nghiệm ban đầu khác nhau, các nồng độ dùng để đánh giá khả năng gây độc tế bào trên vi phiến bằng phương pháp pha loãng liên tục nhằm tìm ra nồng độ ức chế 50% tế bào ung thư (IC50) như đã trình bày ở chương II. Các mẫu được coi là không có hoạt tính khi giá trị IC50 lớn hơn nồng độ thử nghiệm ban đầu. 3.5 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sự hình thành và phát triển khối u 3 chiều trên thạch mềm của một số ketone α,β-không no tổng hợp được Các mẫu được pha với nồng độ 5 μg/mL và nồng độ này được sử dụng cho việc đánh giá hoạt tính ức chế với hình thành và phát triển của các khối u Hep-G2 trên thạch mềm như đã mô tả trong chương II. 3.6 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế IDO. Hoạt tính ức chế IDO được xác định theo phương pháp của Takikawa và cộng sự [186] với một số cải biến. Hỗn hợp phản ứng (1 ml) chứa potassium phosphate buffer (50 mM, pH 6,5), ascobic acid (20 mM), xúc tác (200 U/ml), methylene blue (10 mM), L-tryptophan, IDO tái tổ hợp và chất ức chế với các nồng độ khác nhau. Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 30 phút, sau đó dừng lại và thêm vào 200 µl dung dịch 30% (v/v) của trichloroacetic acid. Sau khi sấy nóng ở 60-65oC trong 10-15 phút, hỗn hợp phản ứng được ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong máy ly tâm. Dịch lỏng phía trên được trộn với 1,2 ml dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyde trong acetic acid nồng độ 2% (w/v) để chuyển hoá toàn bộ kynurenine thành kynurenine,N-p-dimethylaminobenzyliden. Sản phẩm chuyển hoá này được định lượng tại bước sóng 480 nm từ đó xác định được hoạt tính ức chế IDO. 70 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Tổng hợp một số dẫn xuất ketone α,β-không no có cấu trúc tương tự trong thiên nhiên 4.1.1 Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone Trong phân tử zerumbone, 3 trung tâm phản ứng có thể được sử dụng để tạo ra các dẫn xuất của sesquiterpen này bao gồm nối đôi biệt lập ở vị trí số 6 hoạt động như một alkene, nhóm ketone α,β-không no tham gia vào các phản ứng cộng Michael hoặc chuyển vị Beckmann, nhóm C=O tham gia vào các phản ứng ngưng tụ với các hợp chất amine hoặc các hợp chất chứa nhóm methylene linh động. Khai thác theo các hướng phản ứng này, khá nhiều các dẫn xuất mới của zerumbone đã được tổng hợp và nghiên cứu các hoạt tính sinh học khác nhau trong đó chỉ có một số dẫn xuất được tạo thành nhờ sự can thiệp hóa học vào nối đôi biệt lập thể hiện hoạt tính sinh học tốt, còn lại hầu hết các dẫn xuất tạo ra bằng phản ứng phá hệ liên hợp ketone α,β-không no dẫn đến sự giảm đáng kể hoặc mất hẳn hoạt tính sinh học. Sau khi tham khảo kỹ lưỡng về tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone đã được đăng tải, ý tưởng của chúng tôi là thiết kế, tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào các tổ hợp của zerumbone với các hoạt chất khác nhưng vẫn phải giữ được nhóm ketone α,β-không no quan trọng của zerumbone. Tuy nhiên, khó khăn gặp phải là bản thân zerumbone không có khả năng tổ hợp với các hợp chất khác bằng các phản ứng hóa học thông thường do cấu trúc bền vững của nó, ngay cả hướng tác động đến nối đôi biệt lập ở vị trí số 6, thông qua nhóm epoxy bằng phản ứng với m-CPBA trong CH2Cl2 tiếp theo là mở vòng với các tác nhân nucleophile nhưng cũng không thành công mặc dù nhiều loại xúc tác mở vòng khác nhau đã được sử dụng như montmorillonite K10, Zn(ClO4)2.6H2O. Một cách tiếp cận khác đã được chúng tôi thiết lập và dự kiến thực hiện, theo đó các dẫn xuất azazerumbone có chứa nhóm ketone α,β-không no và hợp phần lactam với đôi điện tử tự do không bị chia sẻ sp3 của nhóm -NH- được hình thành từ zerumbone bởi phản ứng chuyển vị Beckmann trong sự có mặt của axít Lewis ZnCl2 [158], các hợp chất này được xem là hợp chất lý tưởng cho việc tổ hợp zerumbone với các hợp chất khác. Để thực hiện ý tưởng này, trước hết nhóm ketone không no được chuyển hóa thành nhóm oxime và dẫn xuất oxime của zerumbone được sắp xếp lại theo phản ứng chuyển vị Beckmann xúc tác bởi ZnCl2 trong acetonitrile để hình thành azazerumbone 102 và azazerumbone 103 với các hiệu suất 13,3% và 40% (sơ đồ 4.1). 71 Hiệu suất và các dữ liệu phổ NMR (phụ lục 1.1-1.4) hoàn toàn phù hợp với hiệu suất và các dữ liệu cấu trúc do S.C Santoh Kumar và các cộng sự [158] công bố. Sơ đồ 4.1: Quá trình tổng hợp các azazerumbone 102 và 103 Trên cơ sở chuyển vị Beckmann của zerumbone oxime, chúng tôi cũng đã tiến hành phản ứng chuyển vị Beckmann với dạng oxime của zerumbone oxide 104. Trước đó zerumbone oxide 104 cũng đã được nhóm chúng tôi tổng hợp và xác định cấu trúc theo qui trình của Kitayama [156]. Theo Kitayama cấu hình của zerumbone oxide ở C- 6 và C-7 là R,R với tín hiệu của H-6 ở dạng doublet doublet có J1 =1,4 Hz và J2 = 11,3 Hz, trong sản phẩm zerumbone oxide của chúng tôi tín hiệu của H-6 cũng có dạng doublet doublet với J1 = 1,5 Hz và J2 = 11,0 Hz nên chúng tôi cho rằng cấu hình của C- 6 (61,0 ppm), C-7 (61,4 ppm) trong zerumbone oxide nhận được là R,R giống như Kitayama đã công bố. Tiếp theo zerumbone oxide oxime 105, 106 được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ zerumbone oxide 104 với hydroxylamine hydrochloride trong ethanol với sự có mặt của K2CO3 để tạo thành hỗn hợp 2 dạng E và Z của zerumbone oxide oxime 105, 106 với hiệu suất tổng là 87% (sơ đồ 4.2). Sơ đồ 4.2: Quá trình tổng hợp các azazerumbone oxime Cấu trúc của zerumbone oxide oxime cũng dễ dàng được xác định bằng các phổ NMR và HRMS (Bảng 4.1). Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR của 104 và 105/106 STT zerumbone oxide 104 zerumbone oxide oxime 105, 106 Vị trí H, J C H, J C 1 - 202,1 - 159,4 2 - 138,6 - 134,6 3 6,15 (1H; m) 147,8 5,60 (1H; d; J = 9,5 Hz) 137,7 4 2,28-2,33 (1H; m) và 2,34-2,41 (1H; m) 24,3 2,17-2,20 (1H; m) và 2,24- 2,33 (1H; m) 24,0 72 5 2,10-2,14 (1H; m) và 1,28-1,33 (1H; m) 37,4 2,05-2,08 (1H; m) và 1,17- 1,23 (1H; m) 37,9 6 - 61,0 - 61,0 7 2,81 (1H; dd; J1 = 11 Hz, J2 = 1,5 Hz) 61,4 2,73 (1H; d; J = 10,5 Hz) 61,6 8 1,79 (1H; d; J = 14,0 Hz) và 1,40 (1H; dd; J1 = 14 Hz, J2 = 11 Hz) 42,1 1,73 (1H; d; J = 13,5 Hz) và 1,17- 1,23 (1H; m) 42,3 9 - 35,7 - 35,3 10 6,08 (1H; s) 159,2 5,62 (1H; d; J = 16,5 Hz) 150,8 11 6,08 (1H; s) 128,1 6,33 (1H; d; J = 16,5 Hz) 121,7 12 1,75 (3H; s) 11,9 1,83 (3H; s) 15,1 13 1,15 (3H; s) 15,4 1,11 (3H; s) 15,4 14 1,27 (3H; s) 23,6 1,25 (3H; s) 30,2 15 1,03 (3H; s) 29,4 1,01 (3H; s) 23,7 Phổ khối ESI+/TOF-MS của 105 và 106 cho mảnh ion [M+H]+ ở m/z 250,18053 tương ứng với công thức phân tử M là C15H23NO2 với sai số so với giá trị tính toán theo lý thuyết là -1,49 ppm. Hỗn hợp 2 dạng này được chuyển hóa thành 2 dạng azazerumbone oxide 107 và 108 bằng phản ứng chuyển vị Beckmann xúc tác bởi ZnCl2 trong acetonitrile với các hiệu suất tương ứng là 9,9% và 39,1%. Cơ chế chuyển vị Beckmann của zerumbone oxide oxime như sau (sơ đồ 4.3): Sơ đồ 4.3: Quá trình tổng hợp các azazerumbone oxide 107 và 108 Ngoài ra, chúng tôi cũng đã thử nghiệm tổng hợp 107 và 108 bằng phản ứng epoxy hóa nối đôi biệt lập của 102 và 103 theo sơ đồ 4.4 sau: Sơ đồ 4.4: Quá trình epoxy hóa các azazerumbone 73 Phản ứng epoxy hóa các azazerumbone bằng m-CPBA được thực hiện trong cả dichloromethane và ethylacetate, tuy vậy trong cả hai trường hợp sau 8 giờ ở 0oC, tiếp theo là 48 giờ ở nhiệt độ phòng sản phẩm chính tạo thành rất ít, chất đầu còn nhiều (TLC). Như vậy, hướng tổng hợp các azazerumbone oxide bằng cách epoxy hóa các azazerumbone tương ứng bằng m-CPBA cho hiệu quả rất thấp. Cấu trúc của các azazerumbone oxide 107 và 108 được minh chứng bằng các phổ 1D và 2D-NMR (Bảng 4.2) và HRMS. Trong phổ 1H-NMR của sản phẩm phụ azazerumbone oxide 107 (phụ lục 1.10- 1.14), một doublet ở 9,37 ppm (J = 9,5 Hz) không có tương tác với bất kỳ cacbon nào trong phổ HSQC được gán cho proton của nhóm NH, tín hiệu này cũng cho phép chúng ta xác định phản ứng chuyển vị Beckmann do dạng Z của zerumbone oxide oxime tham gia để tạo ra nhóm NH bên phía trái nhóm C=O, các tín hiệu của cặp proton olefin H-11 và H-12 ở dạng trans (J = 14,5 Hz) xuất hiện tại các vị trí có độ chuyển dịch hóa học lần lượt là 4,87 ppm (d, J = 14,5 Hz) và 6,08 ppm (dd, J1 = 9,5 Hz, J2 = 14,5 Hz), proton olefin H-4 còn lại xuất hiện dưới dạng doublet (không tách vạch) ở 5,58 ppm. Một doublet ở 2,62 ppm (J = 7 Hz) là của proton H-8, các proton của các nhóm –CH2 ở vị trí 5 và 6 đều xuất hiện dưới dạng multiplet trong khi 2 proton H-9a và H-9b được quan sát thấy dưới dạng doublet doublet ở 1,80 ppm (J1 = 7 Hz, J2 = 15,5 Hz) và doublet ở 1,36 ppm (J = 15,5 Hz). Tiếp theo, phân tích các tương tác trong các phổ HSQC và HMBC cho phép chúng ta qui kết chính xác các proton còn lại và toàn bộ các nguyên tử cacbon trong azazerumbone oxide 107. Đối với sản phẩm chính azazerumbone oxide 108, phổ NMR 1D và 2D (phụ lục 1.15-1.19) chỉ ra một tín hiệu singlet ở 8,55 ppm là của nhóm –NH- không có tương tác trong phổ HSQC và có tương tác C-3 (120,8 ppm) và C-11 (123,9 ppm) trong phổ HMBC. Điều này cũng cho phép chúng ta khẳng định dạng E của zerumbone oxide oxime đã tham gia phản ứng chuyển vị Beckmann và nhóm -NH- được chèn vào bên phải của nhóm C=O. Ngoài ra, 2 tín hiệu doublet có J = 15,8 Hz ở 6,35 ppm và 5,89 ppm được qui cho H-4 (H-β) và H-3 (H-α) thuộc nhóm ketone α,β-không no của azazerumbone oxide. Proton olefin còn lại (H-11) được quan sát thấy ở 4,79 ppm (d, J = 11 Hz), một doublet ở 2,58 ppm (J = 7 Hz) là của proton H-7, tín hiệu doublet ở 1,46 ppm (J = 15 Hz) và doublet doublet ở 1,83 ppm (J1 = 8,5 Hz, J2 = 15,5 Hz) được qui cho 2 proton H-6a và H-6b, sử dụng thêm các phổ HSQC, HMBC cho phép chúng ta khẳng định chính xác cấu trúc của azazerumbone oxide. 74 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 107 và 108 STT azazerumbone oxide 107 azazerumbone oxide 108 Vị trí H, J C H, J C N 9,37 (1H; d; J = 9,5 Hz) 8,55 (1H; s) 2 - 171,7 - 166,2 3 - 129,5 5,89 (1H; d; J = 15,5 Hz) 120,8 4 5,48 (1H; d; J = 10,5 Hz) 135,8 6,35 (1H; d; J = 16,0 Hz) 148,5 5 2,12 (1H; m) 2,38 (1H; m) 24,0 - 36,2 6 1,26 (1H; m) 2,12 (1H, m) 37,4 1,46 (1H; d; J = 15,0 Hz) 1,83 (1H; dd; J1 = 8,5 Hz; J2 = 15,5 Hz) 37,5 7 - 60,0 2,58 (1H; d; J = 7 Hz br) 61,4 8 2,62 (1H; d; J = 7,0 Hz) 61,2 - 60,3 9 1,80 (1H; dd; J1 = 7,0 Hz; J2 = 15,5 Hz) 1,36 (1H; d; J = 15,5 Hz) 37,6 1,27 (1H; m) 2,06 (1H; m) 37,8 10 - 34,6 2,22 (1H; m) 2,14 (1H; m) 23,8 11 4,87 (1H; d; J = 14,5Hz) 117,9 4,79 (1H; d; J = 11,0Hz) 123,9 12 6,08 (1H; dd; J1 = 9,5 Hz; J2 = 14,5 Hz) 126,2 - 131,7 13 1,76 (3H; s) 13,3 1,73 (3H; s) 16,9 14 1,16 (3H; s) 15,9 1,18 (3H; s) 15,8 15 1,12 (3H; s) 26,9 1,00 (3H; s) 30,6 16 0,96 (3H; s) 32,5 1,19 (3H; s) 25,8 Tiếp theo, các azazerumbone 102, 103 và azazerumbone oxide 108 được sử dụng để tổ hợp với các hoạt chất dùng làm thuốc hoặc các hợp chất như AZT dùng trong điều trị HIV, thuốc chống sốt rét dihydroartemisinin và hợp chất [4-(4- fluorophenyl)-6-isopropyl-2-(N-methyl-N-methylsunfonylamino) pyrimidin-5-yl] methanol (PM) dùng trong tổng hợp thuốc hạ mỡ máu rosuvastatin, ngoài ra azazerumbone cũng được gắn thêm nhóm –CH2COOH vào để làm tăng khả năng tan trong nước và cuối cùng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất này. 4.1.1.1 Tổ hợp của các azazerumbone với AZT Trước hết, các azazerumbone và azazerumbone oxide được tổ hợp với AZT, sở dĩ các tổ hợp này được lựa chọn vì gần đây một số các chalcone, flavone hoặc các triterpene được ghép nối với AZT thông qua cầu liên kết 4-methylen-1,2,3-triazole thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với một số dòng tế bào ung thư MCF-7, P338, Hep-G2 và KB [163, 164]. Để tổng hợp các dẫn xuất này, trước hết các azazerumbone 102, 103 và azazerumbone oxide 108 được chuyển hóa thành các dẫn xuất N-propargyl azazerumbone và N-propargyl azazerumbone oxide (109, 110 và 111) tương ứng bằng phản ứng N-alkyl hóa các azazerumbone này với propargyl bromide xúc tác bởi NaH 75 trong THF khan. Trong các phản ứng này lượng propargyl bromide được lấy dư để các azazerumbone và azazerumbone oxide chuyển hóa hết, tiến trình phản ứng được kiểm soát bằng sắc ký bản mỏng hệ dung môi n-hexane:EtOAc để xác định điểm kết thúc của phản ứng. Sơ đồ chuyển hóa các azazerumbone và azazrumbone oxide như sau: Sơ đồ 4.5: Tổng hợp các dẫn xuất propargyl của các azazerumbone và azazerumbone oxide Cấu trúc của các N-propargyl azazerumbone 109, 110 và N-propargyl azazerumbone oxide 111 được khẳng định bằng các phương pháp phổ NMR và HRMS (phụ lục 1.26-1.28, bảng 4.3). Dưới đây, hợp chất N-propargyl azazerumbone 110 được lấy làm ví dụ điển hình cho việc xác định cấu trúc của các N-propargyl- azazerumbone và N-propargylazazerumbone oxide. Trong phổ 1H-NMR của hợp chất trung gian N-propargyl azazerumbone 110, ngoài các tín hiệu proton của các hợp phần azazerumbone phù hợp với các tín hiệu proton của azazerumbone 103 còn xuất hiện thêm các tín hiệu singlet tù của 2 proton thuộc nhóm methylene của propargyl ở 4,16 ppm, tiếp theo một triplet với J = 2,5 Hz của proton còn lại trong nhóm methin của propargyl tại 3,02 ppm. Các nguyên tử cacbon của nhóm propargyl (C-17, C-18 và C-19) trong N-propargyl azazerumbone 110 cũng dễ dàng quan sát thấy tại các vị trí có độ chuyển dịch hóa học tương ứng là 33,0; 80,1 và 73,3 ppm. Kết quả so sánh phổ 13C-NMR của 110 với 103 cho thấy, vị trí tín hiệu của các nguyên tử cacbon còn lại thuộc khung azazerumbone của 110 hoàn toàn phù hợp với các vị trí tín hiệu của các nguyên tử cacbon tương ứng trong phổ 76 13 C-NMR của azazerumbone 103. Kết quả đo phổ khối lượng ESI+/TOF-MS của N- propargyl azazerumbone 110 cho mảnh [M+H]+ = 272,20053 hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C15H25NO của N-propargylazazerumbone 110. Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 109, 110, 111 STT N-propargyl azazerumbone 109 N-propargyl azazerumbone 110 N-propargyl azazerumbone oxide 111 Vị trí H, J C H, J C H, J C 2 - 170,8 165,0 - 164,6 3 - 128,8 5,81 (1H; d; J = 16 Hz) 122,6 5,90 (1H; d; J = 15,5 Hz) 120,7 4 5,33 (1H; t; J = 7,25 Hz) 136,4 6,21 (1H; d; J = 16 Hz) 148,1 6,46 (1H; d; J = 15,5 Hz) 149,5 5 2,32 (2H; m) 24,5 38,1 - 36,2 6 2,23 (2H; t; J = 6,0 Hz) 38,4 2,11 (2H; m) 36,0 1,42 (1H; d; J = 15,5 Hz); 1,91 (1H; m) 37,5 7 - 133,7 5,01 (1H; m) 124,5 2,53 (1H; d; J = 6,5 Hz) 61,2 8 5,13 (1H; t; J = 6,0 Hz) 124,7 133,6 - 60,0 9 2,09 (2H; d; J = 6,5 Hz) 38,0 2,19 (2H; m) 39,3 1,20 (1H; m) 2,07 (1H; m) 37,6 10 - 34,8 2,28 (2H; m) 24,9 2,35 (1H; m) 2,14 (1H; m) 24,2 11 4,93 (1H; d; J = 15 Hz) 119,1 4,99 (1H; m) 132,1 5,07 (dd; J = 2 Hz; J = 11 Hz) 131,2 12 6,41 (1H; d; J = 15 Hz ) 128,6 133,5 - 133,9 13 1,75 (3H; s) 13,5 1,82 (3H; s) 14,9 1,89 (3H; s) 16,3 14 1,53 (3H; s) 14,8 1,56 (3H; s) 14,8 1,22 (3H; s) 15,0 15 1,06 (3H; s) 30,1 1,06 (3H; s) - 1,00 (3H; s) 30,4 16 1,06 (3H; s) 30,1 1,06 (3H; s) - 1,19 (3H; s) 26,1 17 4,30 (2H; d; J = 2,5 Hz) 32,0 4,16 (2H; s br) 33,0 4,41 (1H; dd; J1 = 2,5 Hz; J2 = 17,5 Hz); 4,00 (1H; dd; J1 = 2,5 Hz; J2 = 17,5 Hz) 32,9 18 - 79,4 80,1 - 80,0 19 3,08 (1H; t; J = 2,5 Hz) 73,4 3,02 (1H; t; J = 2,5 Hz) 73,3 3,06 (1H; t; J = 2,5 Hz) 73,5 Tiếp theo, các dẫn xuất 109, 110 và 111 được nối với AZT thông qua phản ứng Click đóng vòng triazole (Click triazole cyclisation) giữa các nhóm propargyl của các dẫn xuất trên và nhóm azido của AZT để tạo thành các sản phẩm đích 112, 113 và 114. Phản ứng thực hiện với các lượng đẳng mol của các azazerumbone hoặc azazerumbone oxide và AZT trong dung môi DMSO xúc tác bởi CuI với thời gian 12 giờ ở nhiệt độ phòng, cơ chế của phản ứng này sẽ được đề cập đến trong phần tổng hợp các dẫn xuất của 5-fluorouracil. 77 Sơ đồ 4.6: Quá trình tổng hợp các tổ hợp của azazerumbone và azazerumbone oxide với AZT Cấu trúc của các phẩm đích được khẳng định bằng các phương pháp phổ (phụ lục 1.29-1.39) gồm 1D và 2D-NMR và phổ HRMS. Quan sát phổ 1H-NMR và 13C- NMR của các tổ hợp 112-114 cho thấy tín hiệu của các proton và các cacbon trong hợp phần AZT và triazole là giống nhau với độ lệch về độ chuyển dịch hóa học so với nhau < 1ppm. Tuy nhiên, do tín hiệu proton H-5ꞌ của vòng triazole và tín hiệu H-6ꞌꞌꞌ của vòng thymine xuất hiện gần nhau và cùng độ bội singlet, thêm nữa tín hiệu của các proton và cacbon trong vòng đường cũng xuất hiện rất gần nhau dẫn tới sự khó khăn cho việc qui kết chính xác. Bởi vậy hợp chất 112 được lấy làm đại diện để qui kết chính xác các proton và cacbon này nhờ sử dụng thêm các phổ 2 chiều HSQC và HMBC, các chất 113 và 114 dễ dàng được qui kết phổ NMR theo 112. Từ phổ HSQC của 112 (hình 4.1), tín hiệu cacbon ở 83,9 ppm được xác định của C-1ꞌꞌ do tương tác với proton H-1ꞌꞌ ở 6,40 ppm (t, J = 6,5 Hz), một singlet tại 7,80 ppm do H-6ꞌꞌꞌ của hợp phần AZT sinh ra tương ứng với tín hiệu cacbon của nó ở 136,2 ppm, 2 tín hiệu ở trường thấp còn lại 8,04 ppm và 11,3 ppm lần lượt được qui cho H-5ꞌ và proton của nhóm -NH- (H-3ꞌꞌꞌ) với C-5ꞌ ở 122,9 ppm. Các tương tác giữa các proton và cacbon trong phổ HMBC (hình 4.2) bao gồm (H-1ꞌꞌ với C-2ꞌꞌꞌ và C-6ꞌꞌꞌ), (H-2ꞌꞌ với C1ꞌꞌ và C3ꞌꞌ), (4ꞌ-CH2- với C-4ꞌ, C-5ꞌ, C-2 và C-12), 78 (H-4 với C-2 và C-13), (H-14 với C-6 và C-8) và (H-15, H-16 với C-9 và C-11) đã chỉ ra toàn bộ các proton và các nguyên tử cacbon trong phân tử 112 và cấu trúc của 112 đúng như dự đoán. Hình 4.1: Một phần phổ HSQC của 112 Hình 4.2: Một phần phổ HMBC của 112 79 Cuối cùng, phổ khối phân giải cao ESI+/TOF-MS của các hợp chất gồm 112, 113 và 114 cũng được đo để khẳng định công thức phân tử của các chất vừa được xác định. Kết quả cho thấy các hợp chất 112, 113 và 114 cho mảnh ion proton hoá phân tử [M+H] + lần lượt là m/z 539,29783; 539,29760 và 555,29243 tương ứng với công thức phân tử C28H38N6O5, C28H38N6O5 và C28H38N6O6 với sai số lần lượt là -0,35 ppm, 0,08 ppm và 0,23 ppm hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của các chất tương ứng vừa được xác định ở trên. Chi tiết các dữ liệu cấu trúc của tất cả các tổ hợp của các azazerumbone, azazerumbone oxide với AZT được đưa ra ở Bảng 4.4: Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 112, 113, 114 STT 112 113 114 Vị trí H, J C H, J C H, J C 2 171,3 165,4 164,8 3 129,0 5,85 (1H; d; J = 15,5 Hz) 123,1 5,93 (1H; d; J = 16 Hz) 121,0 4 5,26 (1H; t; J = 5,0 Hz) 136,1 6,21 (1H; d; J = 15,5 Hz) 147,8 6,46 (1H; d; J = 16 Hz) 149,1 5 2,31 (2H; m) 24,5 36,1 36,2 6 2,23 (2H; m) 38,4 2,15 (2H; s br) 38,1 1,42 (1H; d; J = 15,5 Hz); 1,88 (1H; d; J = 7 Hz) 37,5 7 133,6 4,97 (1H; t, J = 6 Hz) 124,5 2,50 (1H; m) 61,3 8 5,10 (1H; t; J = 5,75 Hz) 124,7 134,0 60,1 9 2,06 (2H; d; J = 6,0 Hz) 37,9 2,15 (2H; s br) 39,0 1,14 (1H; m) 2,06 (1H; m) 37,7 10 34,8 2,15 (2H; s br) 25,0 2,06 (1H; m) 2,29 (1H; m) 24,1 11 4,94 (1H; d; J = 15 Hz) 119,2 4,86 (1H; t; J = 7- 7,5 Hz) 131,9 4,95 (1H; d; J = 11 Hz) 130,9 12 6,44 (1H; d; J = 15 Hz) 129,1 - 133,7 - 134,4 13 1,78 (3H; s) 13,6 1,83 (3H; s) 14,9 1,91 (3H; s) 16,3 80 14 1,53 (3H; s) 14,9 1,57 (3H; s) 15,0 1,21 (3H; s) 15,2 15 0,99 (3H; s) 30,0 1,01 (3H; s) 30,5 16 0,99 (3H; s) 30,0 1,19 (3H; s) 26,2 17 4,77 (2H; s) 38,3 8,06 (2H; s) 38,9 4,17 (1H; m) 4,82 (1H; m) 40,4 4ꞌ 143,6 143,9 143,8 5ꞌ 8,04 (1H; s) 122,8 - 122,9 8,09 (1H, s) 123,2 1ꞌꞌ 6,40 (1H; t; J = 6,5 Hz) 83,9 6,40 (t; J = 6,5 Hz) 83,9 6,40 (1H; m) 83,8 2ꞌꞌ 2,62 (1H; m) 2,69 (1H; m) 37,1 2,60 (1H; m) 2,70 (1H; m) 37,1 2,60 (1H; m) 2,70 (1H; m) 37,1 3ꞌꞌ 5,34 (1H; m) 59,0 5,32 (1H; m) 59,0 5,32 (1H; m) 59,0 4ꞌꞌ 4,17 (1H; m) 84,4 4,16 (1H; m) 84,4 4,17 (1H; m) 84,4 5ꞌꞌ 3,59 (1H; m) 3,68 (1H; m) 60,7 3,58 (1H; m) 3,67 (1H; m) 60,7 3,58 (1H; m) 3,67 (1H; m) 60,7 2ꞌꞌꞌ 150,4 150,4 150,4 3ꞌꞌꞌN 11,3 (1H; s) 11,32 (1H; s) 11,33 (1H; s) 4ꞌꞌꞌ 163,7 163,7 163,7 5ꞌꞌꞌ 109,6 109,6 109,6 6ꞌꞌꞌ 7,80 (1H; s) 136,2 7,80 (1H; s) 136,2 7,80 (1H; s) 136,2 7ꞌꞌꞌ 1,80 (3H; s) 12,2 1,80 (1H; s) 12,2 1,80 (3H; s) 12,2 4.1.1.2 Tổ hợp các aza của zerumbone với dihydroartemisinin Một cách tổ hợp khác cũng được chúng tôi thiết kế, tổng hợp, xác định cấu trúc và thử hoạt tính gây độc tế bào là các hợp chất lai hóa giữa các azazerumbone và azazerumbone oxide với dihydroartemisinin, các hợp chất mới tạo thành được mong chờ thể hiện hoạt tính gây độc tế bào vốn có của cả hai sesquiterpene này. Theo các tài liệu tham khảo, artemisinin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khá ấn tượng và cầu peroxide được xác định là trung tâm hoạt tính của các dẫn xuất này nhờ tương tác với các ion sắt có hàm lượng cao trong các tế bào ung thư. Tuy vậy, cầu peroxide của artemisinin rất dễ bị phá vỡ bởi các tác nhân kiềm hoặc axít trong quá trình phản ứng. Do đó, kế hoạch tổng hợp các tổ hợp này được chúng tôi đưa ra theo hai hướng nhằm giữ lại được trung tâm hoạt tính quan trọng này. Hướng thứ nhất: Con đường tổng hợp chất đích này được thiết kế thông qua sự tạo thành các mạch ancol béo gắn với các azazerumbone (ví dụ hợp chất 115), tiếp theo chất này được ether hóa với dihydroartemisinin để tạo thành sản phẩm đích 116. Tuy nhiên ngay ở phản ứng alkyl hóa azazerumbone bằng 2-bromoethanol, hiệu suất thu được rất thấp mặc dù đã khảo sát các điều kiện phản ứng và sử dụng các xúc tác bazơ khác nhau, kể cả việc bảo vệ nhóm -OH bằng THP. Tiếp theo, phản ứng ether hóa cũng không chọn lọc và khó phân lập sản phẩm chính, vì vậy hướng tiếp cận thứ hai được thiết lập để khắc phục các khó khăn này. 81 Sơ đồ phản ứng như sau: Sơ đồ 4.7: Quá trình tổ hợp giữa azazerumbone với artemisinin theo con đường 1 Hướng thứ hai: Trước hết, dẫn xuất 2-(10-dihydroartemisinoxy)ethyl bromide 92 được tạo thành với hiệu suất 46% (M = 390,2 và Tnc: 155-157 o C) bằng phản ứng ngưng tụ giữa DHA và 2-bromoethanol ở 0oC theo tài liệu [159], tiếp theo tác nhân alkylbromide của dihydroartemisinin này được dùng cho phản ứng N-alkyl hóa azazerumbone dưới xúc tác chuyển pha (1-butyl)triethylammonium bromide/K2CO3 với sự có mặt KI trong dung môi DMF để cho sản phẩm đích với hiệu suất trung bình. Sơ đồ phản ứng như sau: Sơ đồ 4.8: Quá trình tổ hợp giữa azazerumbone với artemisinin theo con đường 2 Trên cơ sở tổng hợp tổ hợp 116, tổ hợp 117 của azazerumbone 102 và tổ hợp 118 của azazerumbone oxide 108 với dihydroartemisinin cũng đã được chúng tôi tổng hợp thành công với hiệu suất trung bình. Cấu trúc của các sản phẩm được chứng minh bằng các phương pháp phổ NMR và HRMS (phụ lục 1.40-1.48). Trong các phổ 1H và 13C-NMR của 3 chất trên (bảng 4.5), các proton và cacbon ở hợp phần dihydroartemisinin có độ chuyển dịch hóa học giống nhau và đều có các tín hiệu đặc trưng của các nguyên tử cacbon bậc 4 gắn