Luận văn Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự nảy mầm và tăng trưởng sớm của cây mầm từ hạt ở cây lúa oryza sativa l. giống nàng hương

hu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml methanol 80 % lắc 20 phút, lọc hỗn hợp thu dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chung 3 dịch lọc I, II, III, đem cô cạn dịch lọc dưới quạt còn khoảng 1 ml. Thêm 5 ml nước cất vào phần dịch cô cạn, chỉnh pH 2,5 bằng dung dịch HCl 1 %. Dịch lọc được chuẩn trên giấy sắc kí. Sơ đồ ly trích và phân lập như sau: 28 Sơ đồ ly trích và phân lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Sắc ký Đặt bản silicagel 60 F254 (20 x 20 cm) được chấm dịch lọc và đặt vào thùng sắc ký chứa dung môi di chuyển chloroform : metanol : acid acetic (80 : 15 : 5 theo thể tích). Khi mức dung môi di chuyển còn cách mép trên của bản sắc ký khoảng 1 cm, quá trình chạy sắc ký kết thúc. Đèn UV 254 nm và 320 nm được sử dụng để xác định vị trí chất điều hòa tăng trưởng thực vật chuẩn (Yokota và cs., 1980). Từ đó xác định vị trí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã được ly trích. 29 Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm Sau sắc ký, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được xác định tương ứng với mỗi băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn. Các ô tương ứng với từng mẫu trên mỗi băng được cắt riêng, cạo, ngâm với nước cất sau 24 giờ, được dùng trong sinh trắc nghiệm. Dung dịch chứa mỗi loại hormone thực vật/ mẫu được chia làm ba phần. Mỗi phần là một lần lặp lại trên một Erlen hoặc đĩa Petri. - Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic Hoạt tính auxin và acid abcisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Hạt lúa được ngâm trong nước ấm 24 giờ và gieo trên gòn ẩm, trong tối. Sau 72 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cô lập được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu được cho vào mỗi đĩa Petri chứa 5 ml dung dịch ly trích ở điều kiện tối, nhiệt độ 30 ± 1 oC. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ. Hoạt tính tương đương của auxin và acid abcisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài của diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh các chỉ số tăng trưởng chiều dài của diệp tiêu giữa các dịch trích, nước cất, dung dịch IAA 1 mg/l. - Sinh trắc nghiệm cytokinin Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.). Hạt dưa leo được ngâm trong nước ấm hai giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2 mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử diệp dưa leo, đặt mặt úp xuống lam kính đã được bao bằng giấy lọc thấm 10 ml dung dịch ly trích /đĩa Petri. Các đĩa này được đậy lại và được đặt dưới ánh sáng 24/24 giờ với cường độ 3000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 1 oC, ẩm độ 65 ± 5 %. Sau 48 giờ, hoạt tính tương đương của cytokinin được xác định dựa vào sự sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp dưa chuột giữa các mẫu dịch trích, nước cất và dung dịch BA 1 mg/l . - Sinh trắc nghiệm gibberellin Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Hạt xà lách được ngâm trong nước ấm 2 giờ và cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 1 oC, ẩm độ 65 ± 5 %. Sau 24 giờ các hạt với rễ mầm nhú ra 1 mm, đặt 10 hạt xà lách này vào mỗi Erlen chứa 5 ml dung dịch ly trích chứa trong hai mảnh giấy lọc. Các Erlen được đặt dưới ánh sáng 24/24 giờ với cường độ 3000 ± 200 lux, nhiệt độ 28 ± 2 oC. 30 Sau 72 giờ, hoạt tính tương đương của gibberellin được xác định dựa vào sự sai biệt về chiều cao của trụ hạ diệp xà lách giữa các mẫu dịch trích, nước cất và với dung dịch GA3 10 mg/l. Sự ly trích, phân lập và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt và tính giá trị trung bình. 2.2.7. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự nảy mầm và tăng trưởng sớm in vitro của cây lúa 2.2.7.1. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự nảy mầm của hạt trong điều kiện in vitro • Hạt bóc vỏ, khử trùng, đem gieo trên một tờ giấy thấm quấn ba tấm lam ở giữa đặt trong đĩa Petri. Mẫu được ngâm trong nước cất có các chất điều hòa tăng trưởng thực vật riêng rẽ: IAA nồng độ từ 0,5 - 2,5 mg/l; GA3 nồng độ từ 1 - 20 mg/l; BA nồng độ từ 1 - 10 mg/l và ABA nồng độ từ 0,1 - 2 mg/l. Tỷ lệ nảy mầm của hạt được xác định sau 24 giờ (điều kiện 32 ± 2 oC), 28 giờ (27 ± 2 oC) (theo kết quả mục 2.2.2.3) so với đối chứng (nước cất). • Từ kết quả trên, sẽ thực hiện nghiệm thức với các chất điều hòa tăng trưởng thực vật kết hợp (bảng 2.1). Bảng 2.1. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật kết hợp lên sự nảy mầm của hạt trong điều kiện in vitro. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật GA3 (mg/l) BA (mg/l) IAA (mg/l) ABA (mg/l) Nước cất Nước cất Nước cất Nước cất 20 10 0,5 - 10 10 0,5 - 20 - 0,5 - 20 - - 0,1 - 10 - - 20 10 - - 20 5 - - 31 20 1 - - 10 10 - - 1 10 - - (-) biểu thị không có mặt các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Khảo sát tỉ lệ nảy mầm sau 24 giờ, 28 giờ ở hai điều kiện nhiệt độ so với đối chứng (nước cất). • Từ kết quả về ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật riêng rẽ, để khảo sát ảnh hưởng tác động tốt nhất của các chất này theo thời gian, GA3 20 mg/l và BA 10 mg/l được xử lý trước và sau 6 giờ (kết quả mục 2.2.2.2). Xác định tỉ lệ nảy mầm cao nhất của hạt lúa sau 24 giờ, 28 giờ ở hai điều kiện nhiệt độ so với đối chứng (nước cất). Thí nghiệm lặp lại ba lần, mỗi lần 15 hạt. 2.2.7.2. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự tăng trưởng sớm của cây mầm lúa trong điều kiện in vitro Hạt nảy mầm sau 48 giờ được xem là ngày 0 với rễ mầm kéo dài khoảng 2 mm và chồi mầm cao khoảng 1 mm được gieo trong môi trường MS 1/10 có chứa các chất điều hòa tăng trưởng thực vật riêng rẽ hay kết hợp (bảng 2.2). Bảng 2.2. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự tăng trưởng sớm của cây mầm lúa trong điều kiện in vitro. Chất điều hòa tăng trưởng thực vật IAA (mg/l) GA3 (mg/l) BA (mg/l) Nước cất Nước cất Nước cất - 20 - - - 10 0,5 - - - 20 10 0,5 20 10 0,5 - 10 0,5 20 - (-) biểu thị không có mặt các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. 32 Các chỉ tiêu tăng trưởng về số rễ, chiều dài rễ, chiều cao thân của cây mầm được đánh giá ở ngày 7 kể từ ngày 0. Thí nghiệm lặp lại ba lần, mỗi lần 15 cây mầm. 2.2.8. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự nảy mầm và tăng trưởng sớm của cây lúa trong vườn ươm 2.2.8.1. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự nảy mầm của hạt lúa trong vườn ươm Ngâm hạt còn nguyên vỏ trấu trong môi trường nước cất. Sau khi ngâm nước được 2 giờ, hạt được xử lý nhiệt độ liên tục 1 giờ. Sau 6 giờ ngâm nước, kể cả thời gian xử lý nhiệt độ, hạt được gieo trên giấy thấm có quấn ba tấm lam, đặt vào đĩa Petri có chứa nước và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật kết hợp IAA 0,5 mg/l, GA3 20mg/l và BA 10 mg/l. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức: không xử lý nhiệt độ (đối chứng); xử lý nhiệt độ 40 oC, 45 oC và 50 oC. Tỉ lệ nảy mầm của hạt lúa được tính sau 48 giờ (kết quả từ mục 2.2.2.4). Thí nghiệm lặp lại ba lần, mỗi lần 15 hạt. 2.2.8.2. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự tăng trưởng sớm của cây mầm lúa trong vườn ươm Từ kết quả mục 2.2.8.1, gieo hạt còn nguyên vỏ trấu có xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã nảy mầm sau 48 giờ vào trong chậu có chứa môi trường đất tự nhiên với 3 phần đất, 1 phần tro trấu chứa nước ngập 2 cm. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ môi trường tự nhiên. Cây mầm lúa được đánh giá sau 1, 2, 3 tuần phát triển kể từ khi trồng vào môi trường đất. Thí nghiệm lặp lại ba lần, mỗi lần 5 cây mầm. 2.2.9. Xử lý thống kê Số liệu trong các bảng kết quả được phân tích thống kê nhờ chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 16.0 cho windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất 0,05 của các giá trị được thể hiện bởi các chữ số khác nhau kèm theo. 33 Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 10/ 2012 đến tháng 9/2013 tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường Đại học Sư phạm Tp. HCM và trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Tp. HCM. 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Đánh giá tính sống của hạt Hạt lúa giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 10 ± 2 oC (như ở phòng kho Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam) hay bảo quản ở nhiệt độ phòng 32 ± 2 oC (nhiệt độ được đo bằng nhiệt kế lúc 9 giờ, 13 giờ và 16 giờ trong ngày) để trong bình hút ẩm thì đều có tỷ lệ bắt màu đỏ 100 % (hình 3.1). Hình 3.1. Phôi của hạt lúa Nàng Hương bắt màu sau 24 giờ trong dung dịch TTC 0.1%. 3.1.2. Khảo sát sự nảy mầm của hạt 3.1.2.1. Khử trùng hạt Khi sử dụng dung dịch sodium hypochloride (NaOCl) 8 % và calcium hypochloride (Ca(OCl)2) 10 % để khử trùng hạt theo thời gian, tỉ lệ hạt sống (hạt đã nảy mầm) và không nhiễm cao nhất sau ba ngày nuôi cấy là dùng dung dịch sodium hypochloride (NaOCl) 8% trong 30 phút (bảng 3.1). 7 mm 35 Bảng 3.1. Tỉ lệ hạt sống và không nhiễm sau khử trùng bằng dung dịch NaOCl 8 % hay Ca(OCl)2 10 % theo thời gian khác nhau. Phương pháp khử trùng Tỉ lệ hạt sống và không nhiễm (%) Chất khử trùng Thời gian (phút) NaOCl 8 % 10 37,78 ± 7,31 a NaOCl 8 % 20 46,67 ± 7,52 a NaOCl 8 % 30 97,78 ± 2,22 c Ca(OCl)2 10 % 10 31,11 ± 6,98 a Ca(OCl)2 10 % 20 44,44 ± 7,49 a Ca(OCl)2 10 % 30 68,89 ± 6,98 b Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. 3.1.2.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi của hạt trong giai đoạn nảy mầm Trong tối, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (32 ± 2 oC) hay ở phòng nuôi (27 ± 2 oC), trọng lượng tươi của hạt tăng nhanh hơn so với điều kiện chiếu sáng (2000 ± 500 lux) hay (2500 ± 200 lux) (bảng 3.2). Đường cong hấp thu nước thể hiện trọng lượng tươi của hạt tăng nhanh từ 0 giờ đến 4 giờ ở cả bốn điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ 32 ± 2 oC và 27 ± 2 oC, trong tối và ngoài sáng) (hình 3.2). Đến 6 giờ, trọng lượng tươi của hạt không đổi ở cả bốn điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ 32 ± 2 oC và 27 ± 2 oC, trong tối và ngoài sáng) (bảng 3.2). Hạt hấp thu nước nhanh, có sự tăng trọng lượng nhanh từ 0 đến 6 giờ. Trong khoảng từ 6 giờ đến 10 giờ, trọng lượng của hạt không có sự thay đổi ở cả bốn điều kiện của nghiệm thức (bảng 3.2). Ở điều kiện phòng nuôi (27 ± 2 oC), tối, trọng lượng tươi có sự khác biệt rõ rệt ở các giai đoạn 0, 6, 20, 28 và 48 giờ (bảng 3.2). Trong điều kiện phòng nuôi (27 ± 2 oC), trong tối, sau 6 giờ ngâm trong nước cất, hạt lúa gia tăng kích thước, căng mọng nước, sáng bóng (hình 3.3, hình 3.4). Phôi hạt lúa 6 giờ căng phồng so với phôi 0 giờ được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, nội nhũ tinh bột chuyển sang màu đục dần so với màu trắng trong của phôi 0 giờ (hình 3.5, hình 3.6). Sau 24 giờ ngâm nước, phôi lúa phồng to có đường kính khoảng 1 mm (hình 3.7). Đến 28 giờ thì rễ mầm kéo dài khoảng 1 mm ra khỏi phôi (hình 3.8). Hạt lúa ở 48 giờ có rễ mầm kéo dài 36 khoảng 2 mm và phát triển chồi mầm khoảng 1 mm (hình 3.9) so với hạt lúa chưa bóc vỏ trấu nảy mầm sau 72 giờ, có rễ mầm và chồi mầm kéo dài khoảng 1 mm (hình 3.10). Kết quả từ sự thay đổi trọng lượng tươi của hạt cho thấy, 6 giờ đầu hạt hấp thu nước và gia tăng trọng lượng rất nhanh. Đây là thời gian để xử lý các yếu tố ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt lúa ở các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi của hạt trong giai đoạn thu nước. Thời gian (giờ) Trọng lượng tươi của hạt (g) Nhiệt độ phòng thí nghiệm (32 ± 2 oC) Nhiệt độ phòng nuôi (27 ± 2 oC) 2000 ± 500 lux tối 2500 ± 200 lux tối 0 1,00 ± 0,00 1a 1,00 ± 0,00 1a 1,00 ± 0,00 1a 1,00 ± 0,00 1a 2 1,10 ± 0,01 1b 1,11 ± 0,00 1b 1,10 ± 0,00 1b 1,09 ± 0,01 1b 4 1,14 ± 0,00 1b 1,16 ± 0,00 2c 1,13 ± 0,00 1b 1,13 ± 0,00 1c 6 1,17 ± 0,02 1c 1,19 ± 0,00 2d 1,16 ± 0,00 1c 1,17 ± 0,00 1de 8 1,20 ± 0,00 2c 1,21 ± 0,00 3d 1,17 ± 0,00 1c 1,18 ± 0,00 1de 10 1,19 ± 0,02 1c 1,22 ± 0,00 2d 1,18 ± 0,01 1c 1,18 ± 0,00 1de 12 1,20 ± 0,01 1c 1,24 ± 0,00 2e 1,21 ± 0,00 1d 1,20 ± 0,00 1e 14 1,22 ± 0,01 1d 1,25 ± 0,00 2e 1,22 ± 0,00 1d 1,21 ± 0,00 1e 16 1,22 ± 0,00 1d 1,27 ± 0,00 2fg 1,22 ± 0,00 1d 1,23 ± 0,00 1ef 18 1,23 ± 0,00 1d 1,27 ± 0,00 2fg 1,23 ± 0,00 1e 1,23 ± 0,00 1ef 20 1,27 ± 0,01 2e 1,27 ± 0,01 2fg 1,23 ± 0,00 1e 1,26 ± 0,01 2g 22 1,26 ± 0,00 2e 1,28 ± 0,00 3g 1,23 ± 0,00 1e 1,27 ± 0,00 23g 24 1,27 ± 0,01 2e 1,31 ± 0,00 3h 1,25 ± 0,00 1f 1,29 ± 0,01 3h 26 1,28 ± 0,01 2f 1,31 ± 0,00 3h 1,26 ± 0,01 1fg 1,29 ± 0,01 23h 28 1,28 ± 0,01 1f 1,32 ± 0,00 2hi 1,27 ± 0,01 1fg 1,31 ± 0,01 2i 30 1,29 ± 0,01 2f 1,33 ± 0,00 3hi 1,28 ± 0,00 1g 1,32 ± 0,00 3i 32 1,32 ± 0,00 2g 1,34 ± 0,00 3hi 1,29 ± 0,00 1g 1,33 ± 0,01 23ij 34 1,33 ± 0,00 2g 1,35 ± 0,00 3i 1,31 ± 0,01 1h 1,34 ± 0,00 23ij 36 1,33 ± 0,01 2gh 1,36 ± 0,00 3j 1,32 ± 0,00 1i 1,35 ± 0,01 3k 38 1,34 ± 0,00 2h 1,37 ± 0,01 4i 1,32 ± 0,01 1i 1,35 ± 0,00 3k 40 1,35 ± 0,02 2hi 1,37 ± 0,00 3j 1,33 ± 0,01 1ij 1,37 ± 0,00 3l 42 1,36 ± 0,01 2i 1,38 ± 0,00 3k1 1,34 ± 0,00 1j 1,37 ± 0,01 3lm 44 1,37 ± 0,01 2ij 1,40 ± 0,01 4l 1,35 ± 0,01 1k 1,38 ± 0,01 3mn 37 46 1,38 ± 0,01 23j 1,41 ± 0,00 4m 1,36 ± 0,00 1kl 1,39 ± 0,00 3n 48 1,39 ± 0,00 12j 1,42 ± 0,00 3n 1,37 ± 0,01 1l 1,41 ± 0,01 3p Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Các số trung bình trong hàng với các số khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Hình 3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi của hạt trong sự nảy mầm. 38 Hình 3.3. Hạt còn vỏ trấu ngâm nước cắt dọc thấy phôi và nội nhũ quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, (thanh ngang dài 1 mm). Hình 3.4. Hạt bóc vỏ chưa ngâm nước (A) và sau 6 giờ ngâm nước (B) được quan sát bằng mắt thường, (thanh ngang dài 3 mm). A B 39 Hình 3.5. Hạt bóc vỏ chưa ngâm nước được cắt dọc để thấy phôi dưới kính hiển vi soi nổi, (thanh ngang dài 1 mm). Hình 3.6. Hạt có phôi bắt đầu trương nước sau 6 giờ được cắt dọc quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, (thanh ngang dài 1 mm). 40 Hình 3.7. Hạt sau 24 giờ trong nước có phôi phồng lên quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, (thanh ngang dài 1 mm). Hình 3.8. Sau 28 giờ hạt nảy mầm với rễ mầm dài khoảng 1 mm được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, (thanh ngang dài 1 mm). 41 Hình 3.9. Hạt bóc vỏ nảy mầm sau 48 giờ với rễ mầm kéo dài và chồi mầm bắt đầu tăng trưởng được quan sát bằng mắt thường, (thanh ngang dài 1 mm). Hình 3.10. Hạt còn vỏ nảy mầm sau 72 giờ với rễ mầm kéo dài và chồi mầm bắt đầu tăng trưởng được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, (thanh ngang dài 1 mm). 3.1.2.3. Khảo sát tỉ lệ nảy mầm của hạt • Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ nơi thí nghiệm 42 Trong tối, hạt nảy mầm tốt hơn. Tuy nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (32 ± 2 oC) cho hạt nảy mầm tốt hơn (17,33 %) chỉ sau 24 giờ và 100% sau 30 giờ so với 11,11 % sau 28 giờ và 100 % sau 36 giờ ở 27 ± 2 oC (bảng 3.3). Nhiệt độ phòng thí nghiệm (32 ± 2 oC) thường không ổn định trong thời gian khảo sát nên điều kiện nhiệt độ 27 ± 2 oC, trong tối được sử dụng để khảo sát sự nảy mầm của hạt lúa Nàng Hương cho các thí nghiệm về sau. Mốc thời gian là 24 giờ đối với điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm (32 ± 2 oC) và 28 giờ đối với điều kiện nhiệt độ phòng nuôi (27 ± 2 oC) (hình 3.11). Bảng 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của hạt ở các điều kiện nhiệt độ và ánh sáng khác nhau. Thời gian (giờ) Tỉ lệ nảy mầm (%) Nhiệt độ phòng thí nghiệm (32 ± 2 oC) Nhiệt độ phòng nuôi (27 ± 2 oC) 2000 ± 500 lux tối 2500 ± 200 lux tối 22 0,00 ± 0,00 1a 0,00 ± 0,00 1a 0,00 ± 0,00 1a 0,00 ± 0,00 1a 24 0,00 ± 0,00 1a 17,33 ± 5,12 2b 0,00 ± 0,00 1a 0,00 ± 0,00 1a 26 0,00 ± 0,00 1a 26,67 ± 6,67 3c 0,00 ± 0,00 1a 0,00 ± 0,00 1a 28 20,00 ± 6,03 3b 75,56 ± 6,48 4d 0,00 ± 0,00 1a 11,11 ± 5,82 2b 30 71,11 ± 6,83 3c 100,00 ± 0,00 4e 0,00 ± 0,00 1a 17,78 ± 5,11 2c 32 82,22 ± 5,76 2d 100,00 ± 0,00 4e 0,00 ± 0,00 1a 22,22 ± 7,23 2d 34 100,00 ± 0,00 3e 100,00 ± 0,00 3e 15,56 ± 5,46 1b 91,11 ± 5,46 2e 36 100,00 ± 0,00 2e 100,00 ± 0,00 2e 26,67 ± 6,67 1c 100,00 ± 0,00 2f 38 100,00 ± 0,00 2e 100,00 ± 0,00 2e 71,12 ± 6,83 1d 100,00 ± 0,00 2f 40 100,00 ± 0,00 1e 100,00 ± 0,00 1e 100,00 ± 0,00 1e 100,00 ± 0,00 1f Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Các số trung bình trong hàng với các số khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. 43 Hình 3.11. Tỉ lệ nảy mầm của hạt trong các điều kiện nhiệt độ và ánh sáng khác nhau. • Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ trong tủ ấm Ở điều kiện 32 ± 2 oC, hạt được xử lý nhiệt độ 40 oC ở thời điểm 2 giờ, thì sau 24 giờ hạt có tỉ lệ nảy mầm 91,11 % (bảng 3.4) cao hơn so với 82,22 % của hạt lúa được xử lý nhiệt độ 40 oC ở thời điểm 2 giờ trong điều kiện 27 ± 2 oC (bảng 3.5). T ỉ l ệ nả y m ầm c ủa h ạt ( % ) Thời gian (giờ) 32 ± 2 độ C, 2000 ± 500 lux 32 ± 2 độ C, tối 27 ± 2 độ C, 2500 ± 200 lux 44 Bảng 3.4. Tỉ lệ nảy mầm của hạt lúa ở 24 giờ dưới ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau trong tủ ấm ở các thời điểm xử lý khác nhau (điều kiện chuẩn 32 ± 2 oC, trong tối). Thời điểm xử lý (giờ) Tỉ lệ nảy mầm của hạt (%) ở các nhiệt độ (oC) 30oC 35oC 40oC 45oC 0 51,11 ± 7,54 2c 46,67 ± 7,52 12a 42,22 ± 7,45 1b 42,22 ± 7,45 1a 2 22,22 ± 6,27 1a 77,78 ± 6,27 3c 91,11 ± 4,29 4d 64,44 ± 7,22 2b 4 31,11 ± 6,98 1ab 51,11 ± 7,54 2ab 64,44 ± 7,22 3c 62,22 ± 7,31 3b 6 48,89 ± 7,54 2b 57,78 ± 7,45 3b 22,22 ± 6,27 1a 48,89 ± 7,54 2a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Các số trung bình trong hàng với các số khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Bảng 3.5. Tỉ lệ nảy mầm của hạt lúa ở 28 giờ dưới ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau trong tủ ấm ở các thời điểm xử lý khác nhau (điều kiện chuẩn 27 ± 2 oC, trong tối). Thời điểm xử lý (giờ) Tỉ lệ nảy mầm của hạt (%) ở các nhiệt độ (oC) 30 oC 35 oC 40 oC 45 oC 0 20,00 ± 6,03 1a 31,11 ± 6,89 2a 53,33 ± 7,52 3bc 11,11 ± 4,74 1a 1 31,11 ± 6,89 12ab 35,56 ± 7,12 2a 31,11 ± 6,89 12a 28,89 ± 6,83 1ab 2 35,56 ± 7,22 1ab 44,44 ± 7,49 2a 82,22 ± 5,76 3d 33,33 ± 7,11 1b 3 28,89 ± 6,83 1ab 40,00 ± 7,39 2a 66,67 ± 7,11 4cd 51,11 ± 7,54 3c 4 35,56 ± 7,22 2ab 28,89 ± 6,83 1a 64,44 ± 7,22 3cd 24,44 ± 6,48 1ab 5 48,89 ± 7,54 3b 37,78 ± 7,31 2a 55,56 ± 7,49 4bc 20,00 ± 6,03 1ab 6 42,22 ± 7,45 3ab 33,33 ± 7,11 2a 35,56 ± 7,22 2ab 11,11 ± 4,74 1a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Các số trung bình trong hàng với các số khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. • Ảnh hưởng của nhiệt độ 45 oC trong tủ ấm và trong nước ấm So sánh hai phương pháp xử lý nhiệt độ trong tủ ấm và xử lý nhiêt độ ẩm ngâm hạt trong nước ấm thì kết quả tỉ lệ nảy mầm của hạt lúa trong các thời điểm 0, 2, 4 và 6 giờ có 45 sự khác biệt không đáng kể (bảng 3.6). Các thí nghiệm về sau có xử lý nhiệt độ sẽ dùng phương pháp xử lý nhiệt độ trong tủ ấm. Bảng 3.6. Tỉ lệ nảy mầm sau 28 giờ của hạt dưới ảnh hưởng của xử lý nhiệt độ 45oC liên tục 1 giờ ở các thời điểm khác nhau, bằng cách xử lý khác nhau. Thời điểm xử lý (giờ) Tỉ lệ nảy mầm của hạt (%) Tủ ấm Nước ấm 0 42,22 ± 7,45 1a 40,00 ± 6,22 1a 2 64,44 ± 7,22 2b 60,00 ± 5,43 1d 4 62,22 ± 7,31 2b 57,78 ± 7,15 1cd 6 48,89 ± 7,54 1a 46,67 ± 6,28 1b Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Các số trung bình trong hàng với các số khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. 3.1.2.4. Ảnh hưởng của vỏ trấu lên sự nảy mầm của hạt Hạt có vỏ trấu ở 48 giờ có tỉ lệ nảy mầm là 44,42 %, chậm hơn rất nhiều so với hạt lúa bóc vỏ trấu đạt tỉ lệ nảy mầm là 100 % ở 36 giờ. Sau 72 giờ tỉ lệ nảy mầm của hạt có vỏ trấu đạt 93,43 % (bảng 3.7). Bảng 3.7. Tỉ lệ nảy mầm của hạt lúa theo thời gian (điều kiện chuẩn 27 ± 2 oC, trong tối). Thời gian (giờ) Tỉ lệ nảy mầm của hạt (%) Hạt bóc vỏ trấu Hạt có vỏ trấu 12 0,00 ± 0,00 1a 0,00 ± 0,00 1a 24 0,00 ± 0,00 1a 0,00 ± 0,00 1a 36 100,00 ± 0,00 2b 0,00 ± 0,00 1a 48 100,00 ± 0,00 2b 44,42 ± 6,52 1b 60 100,00 ± 0,00 2b 75,56 ± 4,63 1c 72 100,00 ± 0,00 2b 93,43 ± 3,76 1d Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Các số trung bình trong hàng với các số khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. 46 3.1.3. Giai đoạn tăng trưởng sớm 3.1.3.1. Khảo sát môi trường in vitro thích hợp để nuôi cấy lúa Cây mầm in vitro ở ngày 7 trong môi trường nuôi cấy MS 1/10 có chiều cao thân, chiều dài lá và số rễ cao nhất so với các môi trường MS còn lại và đối chứng và có hai lá thật ở cây mầm ngày 7 (bảng 3.8, hình 3.12, hình 3.13). Bảng 3.8. Chỉ tiêu sinh trưởng của cây mầm lúa trong giai đoạn tăng trưởng sớm sau 7 ngày nuôi cấy trong các môi trường khác nhau. Môi trường Chỉ tiêu sinh trưởng Số lá Số rễ Chiều dài lá (cm) Chiều dài rễ (cm) Chiều cao thân (cm) Nước 2,00 ± 0,00 a 3,30 ± 0,37 a 3,06 ± 0,20 a 4,69 ± 0,20 c 4,31 ± 0,34 a MS 1/10 2,00 ± 0,00 a 7,10 ± 0,24 d 9,63 ± 0,31 c 3,54 ± 0,66 b 13,74 ± 0,33 c MS 1/5 2,00 ± 0,00 a 6,30 ± 0,28 c 8,79 ± 0,56 c 2,69 ± 0,10 ab 12,98 ± 0,80 bc MS ½ 2,00 ± 0,00 a 5,20 ± 0,20 b 7,24 ± 0,45 b 1,99 ± 0,11 a 13,88 ± 0,48 c MS 1 2,00 ± 0,00 a 5,40 ± 0,31 b 6,20 ± 0,46 b 2,40 ± 0,08 a 11,88 ± 0,57 b Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Hình 3.12. Số lá và số rễ cây mầm lúa trong giai đoạn tăng trưởng sớm sau 7 ngày nuôi cấy trong các môi trường khác nhau. Số lá v à số r ễ củ a câ y m ầm Môi trường Số lá Số rễ 47 Hình 3.13. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây mầm lúa trong giai đoạn tăng trưởng sớm sau 7 ngày nuôi cấy trong các môi trường khác nhau. 3.1.3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm trong giai đoạn tăng trưởng sớm Trong giai đoạn tăng trưởng sớm, cây mầm lúa có sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô. Sự gia tăng trọng lượng tươi đáng kể từ ngày 1 dến ngày 2 và ngày 5 đến ngày 7 (bảng 3.9). Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của hạt đều có sự khác biệt rõ rệt tại các thời điểm ngày 0, ngày 2, ngày 5 và ngày 7 (hình 3.14). Đây là các mốc thời gian để theo dõi các thay đổi về hình thái, sinh lý của cây mầm. Bảng 3.9. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây mầm trong giai đoạn tăng trưởng sớm ở môi trường MS 1/10. Thời gian (ngày) Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) 0 0,19 ± 0,00 a 0,13 ± 0,00 a 1 0,23 ± 0,01 b 0,13 ± 0,00 a 2 0,34 ± 0,01 c 0,14 ± 0,00 b 3 0,35 ± 0,00 c 0,14 ± 0,00 b K íc h th ư ớc ( cm ) Môi trường Chiều dài lá Chiều dài rễ Chiều cao thân 48 4 0,36 ± 0,00 cd 0,15 ± 0,00 bc 5 0,37 ± 0,00 d 0,16 ± 0,00 c 6 0,41 ± 0,01 e 0,18 ± 0,00 d 7 0,42 ± 0,01 e 0,19 ± 0,00 d Các số trung bình trong cột với mẫu kí tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Hình 3.14. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây mầm trong giai đoạn tăng trưởng sớm ở môi trường MS 1/10. 3.1.3.3. Theo dõi tăng trưởng của cây mầm lúa trong giai đoạn tăng trưởng sớm ở môi trường MS 1/10 Cây mầm có sự tăng trưởng rõ rệt trong giai đoạn tăng trưởng sớm ở các ngày 2, 5, 7. Sự gia tăng về số lá, số rễ, chiều dài rễ và chiều cao thân tăng nhanh (bảng 3.10). Cây mầm ngày 2 có lá đầu tiên kéo dài khỏi bao diệp tiêu, rễ mầm tăng trưởng mạnh. Đến ngày 5, cây mầm xuất hiện lá thật, tăng kích thước thân và gia tăng số rễ bên. Sang ngày 7, với 2 lá thật kéo dài, chiều cao thân và số rễ bên tiếp tục tăng (hình 3.15). T rọ ng lư ợn g củ a câ y m ầm ( g) Thời gian (ngày) Trọng lượng tươi Trọng lượng khô 49 Bảng 3.10. Chỉ tiêu sinh trưởng của cây mầm lúa trong giai đoạn tăng trưởng sớm ở môi trường MS 1/10. Thời gian (ngày) Chỉ tiêu sinh trưởng Số lá Số rễ Chiều dài lá (cm) Chiều dài rễ (cm) Chiều cao thân (cm) 0 0,00 ± 0,00 a 1,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,28 ± 0,02 a 1,05 ± 0,06 a 2 0,00 ± 0,00 a 1,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 2,01 ± 0,17 b 1,79 ± 0,18 b 5 1,24 ± 0,08 b 4,30 ± 0,30 b 4,19 ± 0,19 b 3,08 ± 0,14 c 12,00 ± 0,45 c 7 2,00 ± 0,00 c 7,50 ± 0,27 c 8,80 ± 0,29 c 3,28 ± 0,12 c 14,31 ± 0,57 d Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05. Hình 3.15. Cây mầm trong môi trường MS 1/10 ở các ngày 2 (A); ngày 5 (B) và ngày 7 (C), (thanh ngang dài 1 cm). 3.1.4. Quan sát hình thái giải phẫu Phôi ở 0 giờ chưa ngâm nước, lát cắt dọc cho thấy vùng sơ khởi chồi và sơ khởi rễ, lớp thuẫn gồm các tế bào xếp sát nhau (hình 3.16). Phôi đến 6 giờ sau khi hấp thu nước, lát cắt dọc cho thấy lớp thuẫn thay đổi kích thước, tăng diện tích rõ rệt, tế bào