Luận văn Ảnh hưởng của loại Enzyme, nồng độ Enzyme, nhiệt độ, pH đến quá trình thủy phân nếp than ứng dụng cho quá trình lên men

à 45 – 50 kDa. α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH: 4,2 – 5,7(Bernfeld, 1951). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 11 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-amylase từ vi sinh vật. Là một metaloenzyme. Mỗi phân tử đều có chứa 1 – 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 – 6 nguyên tử gam/mol. Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme (Molodova, 1965). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử enzyme bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của nấm sợi bền vững đối với acid tốt hơn α-amylase của malt và vi khuẩn. Ở pH 3,6 và 00C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 – 20 phút; α-amylase vi khuẩn bị vô hoạt 50 %, trong khi đó hoạt lực của α-amylase nấm sợi hầu như không giảm bao nhiêu. α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn trị nếu chúng có nguồn gốc động vật và vi sinh vật. Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II. Hoạt hóa bởi ion hóa trị I như sau: Cl- > Br- > I-. Chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+ α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt (bền nhất trong hệ enzyme amylase). Bảng 2: Khả năng chịu nhiệt của enzyme amylase Nguồn gốc Nhiệt độ tối thích pH tối thích Malt 72-75 5.5-5.7 Nấm mốc 50-60 5.0-6.0 Vi khuẩn 60-70 6.0-7.0 Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004 Bảng 3: Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau Nhiệt độ (0C) Hoạt tính của α-amylase, % so hoạt tính với ban đầu Nấm sợi Malt Vi khuẩn 65 100 100 100 70 52 100 100 75 3 58 100 80 - 25 92 85 - 1 58 90 - - 52 95 - - 8 Nguyễn Đức Lượng, 2004 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 12 ii. Cơ chế tác dụng lên mạch Amylose và Amylopectin α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 Glucoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme). α-amylase không chỉ có khả năng phân huỷ hồ tinh bột mà còn có khả năng phân huỷ cả hạt tinh bột nguyên vẹn. Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn: Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục để tạo thành maltose và glucose. Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh tạo thành oligoshaccaride gồm 6-7 gốc glucose, sau này các mạch này bị phân cắt dần và bị phân giải chậm đến maltose. Sau thời gian thủy phân amylose sản phẩm bao gồm: 87% maltose, 13% glucose. Dưới tác dụng của enzyme α-amylase amylopectin bị phân giải khá nhanh nhưng vì α- amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glucoside nên dù có kéo dài thời gian thủy phân nhưng sau cùng sản phẩm có khoảng: 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và izomaltose là 8%. Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của α-amylase: - Giai đoạn dextrin hoá: α-amylase Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp - Giai đoạn đường hóa: α-amylase Dextrin tetra và trimaltose di và monosaccharides α-amylase Amylose Oligosaccharide Polyglucose Maltose maltotriose Maltotetrose Khả năng dextrin hóa của α-amylase rất cao do đó người ta còn gọi α-amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa 2.5.2 β-amylase (EC.3.2.1.2) i. Đặc tính β-amylase là một loại albumin. Tâm xúc tác của nó chứa gốc-SH, - COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 13 trong các hạt nẫy mầm. Trong vi khuẩn không có β-amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc cho đến nay vẫn chưa được xác định. β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, urê, ido, acetanic, iod, ozon. β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn. pH tối thích trong dung dịch bột thuần khiết là 4-6, trong dung dịch nấu là 5-5.6. Nhiệt độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40-500C. Trong dung dịch nấu là: 60-650C β-amylase bị vô hoạt ở nhiệt độ 700C. ii. Cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại. Phân cắt tuần tự từng gốc maltose một ở đầu không khử. Maltose có cấu hình β được tạo thành. β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exo- enzyme). β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có từ 20-25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo 10-12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α-1,4 glucoside gắn với α-1,6 glucoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn. Có chứa nhiều liên kết α-1,6 glucoside gọi là dextrin có màu tím đỏ với iod. Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α và β-amylase thì tinh bột sẽ bị thủy phân đến 95%. Tác dụng của β-amylase lên tinh bột như sau β-amylase Tinh bột maltose (54 – 58%) + β-dextrin (42 – 46%) Hình 6: Cơ chế tác dụng của β-amylase lên tinh bột Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 14 2.5.3 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4- glucan-glucohydrolase) (EC.3.2.1.3) i. Đặc tính γ-amylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, Glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột mà không cần có sự tham gia của các amylase khác. Glucoamylase thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ. So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone, không bền với ion kim loại nặng: Cu2+, Hg2+có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn. Hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH 3.5-5.5. ii. Cơ chế tác dụng lên amylase và amylopectin Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4; 1,6 glucozid trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose. Là enzyme ngoại phân exo-enzyme. Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một. Chúng không thủy phân được các dextrin vòng. Khi thủy phân tinh bột, cùng với việc tạo thành glucose còn có thể tạo thành oligosaccharide. Ngoài ra, γ-amylase còn có thể phân cắt cả liên kết α-1,2; 1,3-glucoside nữa. Chú ý khi sử dụng hệ enzyme amylase trong sản xuất rượu: - Nguồn gốc của hệ enzyme amylase để biết được khoảng nhiệt độ, pH thích hợp. Nắm được chất hoạt hóa, chất ức chế đối với từng enzyme để làm tăng khả năng hoạt động của nó, tăng nhanh hiệu suất đường hóa. - Tùy nguyên liệu cụ thể có thành phần amylase, amylosepectin khác nhau mà sử dụng loại enzyme thích hợp, cân đối. - Tùy từng loại men, từng loại sản phẩm lên men mà có thành phần nguyên liệu khác nhau, hàm lượng đường lên men khác nhau, dẫn đến chủng loại enzyme khác nhau. Nói cách khác, chúng ta phải biết được các tính chất của nguồn enzyme đang sử dụng như tỉ lệ các loại enzyme, nhiệt độ, pH thích hợp cho enzyme đó. (Công nghệ enzyme, 2005) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 15 2.5.4 Oligo-1,6-glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.10) Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6-glucosid trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm (malt, thóc mầm). Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase (R-enzyme) và dextrin-1,6- glucosidase (còn gọi là amylo-1,6-glucosidase hay dextrin-6- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.33). Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase nên trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1. 2.5.5 Pullulanase (EC3.2.1.41) Enzyme pullulanase thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside trong tinh bột và glycogen. Phân tử lượng của nó là 145000. pH hoạt động tối thích là 5,0 và nhiệt độ hoạt động tối thích là 47,50C. Enzyme này có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucoside. 2.5.6 Transglucosidase Transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase. Nó có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltotriose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác bằng liên kết α-1,6-glucosid để tạo thành panose hoặc izomaltose. 2.7 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ thực phẩm 2.7.1 Trong sản xuất rượu Người ta dùng enzyme amylase làm tác nhân đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu cho phép tiết kiệm được hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt, rút ngắn quá trình sản xuất, tiết kiệm được sản xuất, bởi enzyme amylase thủy phân sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong thời gian ngắn. Amylase không những quan trọng ở giai đoạn đường hóa mà còn ở cả giai đoạn xử lý nước nhiệt nguyên liệu nữa. Việc sử dụng amylase để dịch hóa tinh bột khi nấu ở nhiệt độ 85-900C cho phép có thể chỉ hoàn toàn dùng hơi thứ cấp cho đun sơ bộ và làm dịu chế độ nấu. Điều này làm giảm chi phí hơi trong gia nhiệt và giảm bớt tổn thất tinh bột. Vì vậy làm cho hiệu quả sản xuất tăng. 2.7.2 Trong sản xuất bia Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzyme amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có trong mầm đại mạch. Nguyên liệu chính là đại mạch nẩy mầm loại tốt. Khác với rượu ở đây mức độ đường hóa chứa trong nguyên liệu Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 16 thấp hơn. Cần có các dextrin chưa đường hóa làm cho bia có hương vị. Việc chuyển hóa tinh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do các enzyme amylase đảm nhiệm nên trong quá trình dịch hóa và đường hóa thì enzyme amylase có ý nghĩa quan trọng và vai trò quan trọng bậc nhất. Ta có thể bổ sung enzyme amylase từ các nguồn khác như vi sinh vật vào trong quá trình sản xuất bia để làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn. Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: - Giảm tổn thất tinh bột và các chất hòa tan khi cho hạt nẩy mầm, làm tăng hiệu suất chất hòa tan lên 0,6 % (tức là tiết kiệm được 0,9% đại mạch ). - Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như gạo, bắp ... những nguyên liệu không nẩy mầm. - Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt do đó tăng hiệu suất lao động. 2.7.3 Trong công nghệ sản xuất bánh mì Trong bánh mì, enzyme dược xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì. Enzyme được đưa vào nhằm giải quyết các vấn đề sau: - Làm tăng nhanh thể tích bánh - Làm màu sắc của bánh đẹp hơn - Làm tăng mùi thơm cho bánh Các enzyme này tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành đường. Nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisase sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích bánh tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh . Việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt. 2.7.4 Trong sản xuất bánh kẹo Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa từ tinh bột sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột xấu để sản xuất bánh. Do đó người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và acid amin. Đường khử và acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 17 2.7.5 Trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển rất mạnh. Theo phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan vào nước. Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α-amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét. Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa, các enzyme này giúp cho quá trình đường hóa rất dễ dàng. Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 18 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp & SHƯD- Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.2 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài được tiến hành từ ngày 26/02/07 đến ngày 18/05/07. 3.1.3 Nguyên liệu - Nếp than - Chế phẩm enzyme amylase thương mại (α-amylase từ Bacillus, glucoamylase từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus, glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus niger) - Các nguyên liệu khác 3.1.4 Hoá chất - Iod - NaOH - HCl - Fehling A và B - Một số hoá chất khác - Acid citric - Pb(CH3COO)2 - Na2SO4 3.1.5 Trang thiết bị - Chiết quang kế - Tủ lạnh - Máy đo độ màu - Nhiệt kế - Ống nghiệm - Máy xay nhỏ - Máy điều nhiệt - Ống đong - Erlen, Becker - Pipet các loại - Phểu thủy tinh - Cân phân tích Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 1 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt lực của chế phẩm enzyme amylase thương mại đến quá trình thuỷ phân tinh bột. i. Mục đích Nhằm rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao hiệu suất sản xuất. ii. Chuẩn bị mẫu - Mẫu tinh bột 5%. - Mẫu enzyme mỗi loại. - Mẫu dung dịch đệm (pH = 5) iii. Bố trí thí nghiệm - Sơ đồ thí nghiệm Chế phẩm enzyme A1 A2 A3 Tinh bột Đường hóa Dịch đường - Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với ba loại enzyme: A1: α-amylase từ Bacillus A2 : glucoamylase từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus A3 : glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus niger Số lần lặp lại: 2 iv. Tiến hành - Hút 0,1ml enzyme mỗi loại pha với 200ml nước cất, và lấy: + 2ml tinh bột 5% + 2ml dung dịch đệm (pH 5) + 0,5ml dịch enzyme mỗi loại + 1,5ml nước cất Ta có tổng số ml cho mỗi ống nghiệm là 6ml. Ủ 2 ống nghiệm ở nhiệt độ 500C trong thời gian 5 phút. Lấy 0,5ml dung dịch trong mỗi ống nghiệm thêm vào 5ml HCl 0,1N để phản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 2 ứng dừng lại. Tiếp tục lấy 0,5ml trong mỗi ống nghiệm và 5ml dung dịch iod cho vào 2 ống nghiệm, lắc kỹ. Đo độ hấp thụ ở bước sống 620nm. - Tính vận tốc phản ứng: gọi Ao – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu ban đầu (mẫu đối chứng); A1 – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu thủy phân trong 5 phút. Ao a mg tinh bột Ao – A1 o o A AA 1− * a (số mg tinh bột bị thủy phân trong khoảng thời gian t) Định nghĩa vận tốc phản ứng là số mg tinh bột bị thủy phân trong thời gian 1 phút. Công thức tính: t a A AA o o ∗ − 1 - Hoạt tính của enzyme Định nghĩa: Hoạt tính của enzyme là số ml dịch enzyme có thể thủy phân 1 mg tinh bột trong 1 phút ở 500C. Công thức tính: X = aAA Atb o o ∗− ∗∗ )( 1 v. Chỉ tiêu theo dõi - Lượng tinh bột còn lại. Kết quả theo dõi sẽ được xử lý bằng chương trình Statgraphics Plus 4.0. 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme amylase, nồng độ enzyme, pH và nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân nếp than. i. Mục đích Nhằm xác định loại enzyme, nồng độ và nhiệt độ thuỷ phân thích hợp để quá trình thuỷ phân đạt hiệu quả cao. ii. Chuẩn bị mẫu - Nếp than được làm sạch, nghiền nhỏ. - Chế phẩm enzyme thương mại được chuẩn bị với 3 nồng độ khác nhau cho mỗi loại. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 3 Hình 7: Nếp sau khi nghiền nhỏ iii. Bố trí thí nghiệm - Sơ đồ thí nghiệm Nếp than Xử lý Trộn Chế phẩm enzyme 1 Chế phẩm enzyme 2 Chế phẩm enzyme 3 (B1,B2,B3) (B1,B2,B3) (B1,B2,B3) A2 A3 A4 A1 A2 A3 A1 A2 A3 C4,C5,C6 C4,C5,C5 C4,C5,C6 C1,C2,C3 C1,C2,C3 C1,C2,C3 C2,C3,C4 C2,C3,C4 C2,C3,C4 Đường hóa Dịch đường - Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với ba nhân tố Nhân tố A: giá trị nhiệt độ thay đổi theo các mức độ A1: 600C A2: 650C A3: 700C A4: 750C Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 22 Nhân tố B: nồng độ enzyme sử dụng thay đổi theo các mức độ B1: 0,5 ml/50 g B2: 1,5ml/50 g B3: 2,5 ml/50 g Nhân tố C: giá trị pH thay đổi ở các mức độ C1: pH 3,5 C2: pH 4 C3: pH 4,5 C4: pH 5 C5: pH 5,5 C6: pH 6 Số lần lặp lại: 2 Tổng số nghiệm thức là: 102 iv. Tiến hành thí nghiệm Với mỗi loại enzyme ta tiến hành như sau: Cho 0,2ml enzyme vào 50g nếp than đã được nghiền sẵn với 200ml nước, sau đó chỉnh về pH C1 rồi đem đun ở nhiệt độ 70 0C trong 10 phút. Sau đó tiến hành nâng nhiệt độ lên nhiệt độ hồ hóa khoảng 10 phút rồi cho lượng enzyme còn lại ứng với nồng độ B1 (kể cả lượng enzyme lúc đầu), sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ A1 khoảng 40 phút. Trong suốt quá trình làm cứ 5 phút ta lấy mẫu ra làm lạnh để xác định Bx. Tổng thời gian nấu là 60 phút. Lặp lại với các nhiệt độ, pH và nồng độ còn lại cho cả ba nguồn chế phẩm enzyme khác nhau. v. Chỉ tiêu theo dõi - Độ Brix. - Hàm lượng đường tổng số của bã. Xử lý kết quả thống kê bằng chương trình Statgraphics Plus 4.0 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 23 A B A B B A CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định hoạt tính của enzyme thương mại Bảng 4: Hoạt độ của enzyme amylase Loại enzyme Hoạt độ (số ml enzyme/1mg tinh bột/1phút) α-amylase từ Bacillus 0,051 Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 0,052 Glucoamylase từ Aspergillus niger 0,054 Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Giá trị trong bảng càng nhỏ thì hoạt độ của enzyme càng mạnh. Từ bảng trên cho thấy enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn có hoạt tính mạnh hơn enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc. (a) α-amylase từ Bacillus (b) Glucoamylase từ Aspergillus niger Chú thích: A: mẫu có chứa enzyme B: mẫu đối chứng (c) Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus Hình 8: Mẫu xác định hoạt lực của 3 loại enzyme 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme 4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Tiến hành khảo sát ở 3 mức độ của enzyme, pH, nhiệt độ khác nhau kết quả thể hiện ở các đồ thị và bảng thống kê sau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 24 Hình 9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân, ở nồng độ 0,5ml/50g Ở các nồng độ 1,5ml/50g và 2,5ml/50g cũng tuân theo qui luật như ở nồng độ 0,5m/50g. Giai đoạn đầu tốc độ tăng độ brix cao do nồng độ cơ chất cao, khi nồng độ cơ chất cao cơ hội enzyme tiếp xúc được với cơ chất lớn vì vậy enzyme thủy phân mạnh. Sau đó nồng độ cơ chất giảm, enzyme không còn đủ cơ chất để thủy phân như lúc đầu nên tốc độ tăng độ brix cũng chậm dần. Điều này cũng phù hợp với qui luật ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của enzyme (Giáo trình sinh hóa - Bùi Hữu Thuận). Qua đồ thị cũng thấy rõ khi nhiệt độ tăng thì khả năng thuỷ phân của enzyme cũng tăng vì nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng sẽ tăng. Kết quả cho thấy ở bảng 5 Bảng 5: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Nhiệt độ Độ Brix 650C 17,87b 700C 18,06a 750C 18,19a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% Kết quả thống kê cho thấy nhiệt độ 700C và 750C khả năng thủy phân của enzyme là tốt nhất và không có sự khác biệt ở hai nhiệt độ. Đây là nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme vì enzyme được trích ly từ vi khuẩn nên khả năng chịu nhiệt của enzyme này cũng cao hơn so với những nguồn khác như nấm mốc, hay trích ly từ thực vật. Điều này 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65oC 70oC 75oC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65o C 70o C 75o C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65o C 70o C 75o C pH 5,5 pH 6 pH 5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 25 đã được chứng minh rằng nhiệt độ tối thích cho enzyme trích ly từ vi khuẩn từ 700C - 750C (Công Nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng). Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ 650C Ở các nhiệt độ 700C và 750C cũng tuân theo qui luật như ở nhiệt độ 650C Từ đồ thị thấy rõ sự khác biệt của nồng độ ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme. Khi nồng độ tăng thì độ brix đạt được cũng tăng vì nồng độ enzyme tăng thì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất sẽ tăng nên tốc độ thủy phân cũng tăng. Bảng 6: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Nồng độ Độ Brix 0,5ml/50g 17,78c 1,5ml/50g 18,09b 2,5ml/50g 18,24a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Theo kết quả bảng 6, 2,5ml/50g cho độ brix cao nhất và khác biệt có ý nghĩa. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5m l 1,5ml 2,5m l 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml pH 5 pH 5,5 pH 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 26 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 2,5ml/50g Ở các nồng độ 0,5ml/50g và 1,5ml/50g cũng tuân theo qui luật như ở nồng độ 0,5m/50g. Từ đồ thị cho thấy pH ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng thủy phân của enzyme. Ở thời gian đầu, pH ảnh hưởng rõ do nồng độ cơ chất nhiều enzyme có điều kiện hoạt động tốt nên chúng thể hiện hoạt tính rõ hơn, càng về sau nồng độ cơ chất càng ít nên hoạt động của enzyme bị hạn chế vì khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất giảm. Bảng 7: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus pH Độ Brix 5 18,03ab 5,5 18,16a 6 17,92b Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý