Luận văn Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5

i như Bacillus megaterium lại không cần đến các yếu tố sinh trưởng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại cần có vitamin B hoặc các axit amin. Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30 - 45 o C một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65oC. Một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 0 o C. pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 -11. Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 như Bacillus alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius [32]. Trừ Bacillus anthracis gây bệnh than cho người, tất cả các Bacillus khác được coi là không độc hại cho người. Bacillus làm sạch môi trường nước nhờ khả năng sinh enzym phân hủy chất hữu cơ nguồn gốc từ thức ăn thừa, chất thải từ tôm cá: proteaza phân hủy protein, amylaza phân hủy tinh bột, xenlulaza phân hủy xenlulozơ, kitinaza phân giải kitin. Ngoài chức năng phân giải các hợp chất hữu cơ làm sạch môi trường thì chúng còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển quá mức vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học. Đặc điểm quan trọng nhất của chi Bacillus là có khả năng tạo nội bào tử, nhất là trong những điều kiện bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh 28 dưỡng hay điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ hóa chất Bào tử Bacillus có thể tồn tại rất lâu thậm chí trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng. Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Một trong những đặc tính đó là sinh enzym phân hủy hữu cơ như proteaza, amylaza, xenlulaza. Proteaza là enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các chất tương tự. Sản phẩm thủy phân là các axit amin, sản phẩm trung gian là các peptit có mạch dài ngắn khác nhau. Enzym amylaza có tác dụng thủy phân tinh bột. Quá trình trải qua giai đoạn dextrin hóa, khi đó chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng dextrin và giai đoạn đường hóa. Trong giai đoạn này các dextrin vừa được tạo thành bị phân hủy tiếp thành các phân tử thấp hơn như maltozơ, isomaltozơ, glucozơ. Enzym xenlulaza xúc tác sự thủy phân xenlulozơ thành sản phẩm trung gian xenlubiozơ và sản phẩm cuối cùng là glucozơ. Các sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy chất hữu cơ nhờ hệ enzym proteaza, amylaza, xenlulaza là các axit amin và glucozơ. Đó là nguồn dinh dưỡng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước [32].  Nhóm vi khuẩn lactic Một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm nuôi tôm cá là nhóm vi khuẩn lactic. Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Nhưng nhìn chung chúng được chia thành hai loại hình cầu và hình que. Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào. Streptococcus có tế bào hình cầu hoặc hình ovan, đường kính khoảng 0,5 -1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài. Tuy nhiên, một số chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài lớn hơn chiều rộng, chẳng hạn như Streptococus lactic [9]. Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 - 0,8µm và chiều dài khoảng 1,6µm. Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám [9 ]. Lactobacillus có hình que. Đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất. Hình dạng của chúng thay đổi từ hình cầu cho đến hình que dài. Chẳng hạn L. plantatum có 29 dạng hình que kích thước từ 0,7-1,1µm đến 3-8µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, trong khi L. casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình que mảnh, đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay chuỗi [9]. Về hình thái, vi khuẩn lactic có hình dạnh không đồng nhất. Nhưng về mặt sinh lý chúng lại có những điểm tương đối đồng nhất. Chúng đều là những vi khuẩn Gram (+), không có khả năng tạo bào tử, không di động, sinh axit lactic trong quá trình phát triển, catalase, oxydase và khử nitrat âm tính, không chứa các xitocrom, hô hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí [10]. Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng cũng khác nhau. Chúng không những cần cung cấp đủ các chất dinh dưỡng: cacbon, nitơ, muối khoáng mà còn cần các chất kích thích sinh trưởng. Nhóm vi khuẩn lactic có khả năng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nhờ sinh chất đối kháng như axit lactic, bacteriocin. Ngoài vai trò kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường thì chúng cũng có tác dụng làm giảm mùi hôi của đầm nuôi. Quan trọng hơn cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này còn có tác dụng hạn chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩm thủy sản. Khi sử dụng nhóm vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoài mục đích làm cân bằng khu hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật có hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng còn có tác dụng tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [5].  Nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dƣỡng Trước đây, theo phân loại truyền thống đã xếp các chủng vi khuẩn nitrat hóa chung vào cùng một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae sau đó, dựa vào khả năng oxy hóa các cơ chất vô cơ của vi khuẩn nitrat hóa mà người ta đã chia chúng thành 2 nhóm, đó là nhóm vi khuẩn oxy hóa amôni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit [53].  Vi khuẩn oxy hóa amôni hay còn gọi là vi khuẩn nitroso là nhóm vi khuẩn Gram âm, hóa tự dưỡng và hiếu khí bắt buộc. Vi khuẩn này lấy năng lượng từ quá trình oxy hóa amôni thành nitrit. Quá trình oxy hóa amôni xảy ra theo phương trình sau: 30 Vi khuẩn oxy hóa amôni tự dưỡng lấy năng lượng và lực khử từ quá trình oxy hóa amôni để sinh trưởng. Nguồn cacbon chính mà các tế bào vi khuẩn sử dụng là CO2 trong khí quyển thông qua chu trình Calvin-Benson. Các tế bào vi khuẩn sinh trưởng rất chậm, thời gian nhân đôi tế bào của vi khuẩn ít nhất là 7 - 8 giờ, thậm chí cũng có thể kéo dài thêm vài ngày [42]. Trong hệ thống phân loại hiện nay, người ta chia nhóm vi khuẩn amôni hóa thành 3 chi, dựa vào sự khác biệt về hình dạng tế bào, kiểu hình và tổ chức nội bào. Đó là các chi Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira . Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas có hình que thẳng, chi này là phổ biến nhất trong nhóm vi khuẩn amôni hóa, có vùng phân bố rộng, chúng sống trong đất, nước ngọt, bùn, nước lợ, biển. Chi Nitrosococcus tế bào có hình cầu đặc trưng, tế bào có roi nên có khả năng di chuyển. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosospira có hình xoắn ốc[62].  Nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit tự dưỡng được biết đến như là vi khuẩn tự dưỡng hóa năng (chemoautotroph), Gram âm và hiếu khí. Giống như vi khuẩn oxy hóa amôni, vi khuẩn oxy hóa nitrit sử dụng nguồn cacbon là CO2 thông qua chu trình Calvin-Benson [41]. Quá trình oxy hóa nitrit xảy ra như sau: Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn oxy hóa nitrit phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan. Các chủng vi khuẩn nitrit hóa tự dưỡng sinh trưởng tốt ở nồng độ nitrit từ 2 - 30 mM, nồng độ nitrit quá cao có thể gây ức chế sinh trưởng của tế bào. Vi khuẩn oxy hóa nitrit có thể sinh trưởng bình thường trong môi trường tự nhiên ở dải pH = 6 - 8. Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng là pH = 7 - 8. Nhiệt độ lý tưởng cho sinh trưởng của chúng là 25 - 30 o C trong môi trường không khí [62]. Tốc độ của giai đoạn (1) xảy ra nhanh gấp 3 lần so với giai đoạn (2). Bằng thực nghiệm người ta đã chứng minh rằng lượng oxy tiêu hao để oxy hóa 1mg nitơ của muối amôni ở giai đoạn tạo nitrit là 343 mg O2, còn ở giai đoạn tạo nitrat là 4,5 mg O2. Sự có mặt của nitrat trong nước thải phản ánh mức độ khoáng hóa hoàn thành các chất bẩn hữu cơ. Năng lượng sinh ra từ phản ứng nitrat hóa được vi khuẩn sử dụng trong quá trình tổng hợp tế bào [5]. 31 Ngày nay, vi khuẩn oxy hóa nitrit được phân loại thành 4 chi: Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina và Nitrospira. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter có hình que ngắn, màng trong tế bào chứa mũ phân cực. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ống. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrospina có hình que, màng trong tế bào dạng túi. Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrospira có hình xoắn và không xuất hiện màng trong tế bào [62]. Các vi khuẩn oxy hóa nitrit có khả năng thích nghi cao với các điều kiện môi trường khác nhau và chúng thường tồn tại cùng với vi khuẩn oxy hóa amôni do các vi khuẩn này đã cung cấp nitrit cho chúng trong môi trường hiếu khí [41]. Trong các chế phẩm dùng cho ao, đầm nuôi tôm cá hiện nay người ta thường bổ sung nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dưỡng cụ thể là chi Nitrosomonas và chi Nitrobacter. Vi khuẩn thuộc hai chi này đóng vai trò quan trọng trong việc giảm các độc tố trong môi trường nước, chuyển hóa các chất độc như amôni và hợp chất nitơ, do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá nuôi phát triển tốt [7] . 1.5.3. Ƣu điểm và nhƣơc̣ điểm của biêṇ phấp sƣ̉ duṇg vi sinh vâṭ trong xƣ̉ lý nƣớc nuôi trồng thủy sản - Ưu điểm: các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản và đem lại nhiều lợi ích cho con người và môi trường sống mà các phương pháp khác không có đươc̣ như : an toàn đối với người và động vật , đăc̣ hiêụ đối với vâṭ chủ , thích hợp với các phương pháp phòng trừ khác , thời gian bán hủy ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả năng tự nhân lên (tư ̣sinh sản ), có khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học . - Nhươc̣ điểm : thời gian phát huy tác duṇg châṃ , tác động không triêṭ để , hiêụ quả phương pháp chiụ ảnh hưởng lớn vào điều kiêṇ ngoaị cảnh , kết quả thu đươc̣ thường không ổn điṇh . Để haṇ chế các nhươc̣ điểm này , chúng ta cần phải tuyển chọn các chủng vi sinh vâṭ có tính đối kh áng tốt nhất , nghiên cứu sử duṇg kết hơp̣ nhiều chủng . 32 Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng 2.1.1. Chủng giống - Các chủng VSV dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất, nước tại địa bàn Hà Nội. - Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ bảo tàng giống chuẩn VSV, Viện VSV và Công Nghệ Sinh học- ĐH Quốc gia Hà Nội, bao gồm các chủng E. coli ATCC 25922; Salmonella typhi ATCC 14028; Proteus mirabilis; Staphylococcus aureus ATCC 25923; Vibrio parahaemolyticus; Shigella flexneri ATCC 29903D; Fusarium oxysporum. 2.1.2. Hóa chất – thiết bi ̣ Hóa chất: Các hóa chất làm môi trường: peptone, nước nắm, cao nấm men, cao thịt, CMC, tinh bột tan, kitin, cazein, glucoza, và nhiều hóa chất thông thường khác. Dụng cụ: - Buồng cấy vô trùng (Pháp) - Máy lắc Inforsagch – 4103 (Pháp). - Tủ sấy , tủ ấm (Trung Quốc ) - Cân phân tích (Nhâṭ ) - Nồi khử trùng Tomy SS 325 (Nhâṭ ) - Máy đo DO meter Hanna HI 8043 (Hàn Quốc ). - Máy đo pH Hanna 8733 (Hàn Quốc ). - Tủ cấy (Trung Quốc ) - Tủ ổn nhiệt (Nhâṭ ) - Tủ lạnh (Nhâṭ ) - Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản) - Máy li tâm 2.1.3. Môi trường 2.1.3.1. Môi trường phân lâp̣ và nuôi cấy vi sinh vâṭ - Môi trường thac̣h thường cải t iến (g/l): 33 Peptone: 10g Thạch : 14 -15 g Nước mắm : 10ml Nước cất: 1 lít - Môi trường MRS (g/l) Glucose Peptone Cao thiṭ Cao nấm men Aminoxitrat Tween 80 Nước cất 20g 10g 5g 5g 2g 1ml 1 lít K2HPO4 CH3COONa.2H2O MgSO4 MnSO4.4H2O CaCO3 Thạch 2g 5g 0,58g 0,28g 5g 14-15g - Môi trường ISP 4 (g/l) pH = 7 MgSO4.7H2O NaCl KH2PO4 Dịch vi lượng (g/ml) Nước 1g 1g 1g 1ml 1 lít CaCO3 (NH4)SO4 Tinh bôṭ tan Thạch 2g 2g 10g 14 - 15 g Dịch vi lượng : 0,1g FeSO4.7H2O + 0,1g MnCl + 0,1g ZnSO4 Môi trường giữ giống thêm 5g peptone. - Môi trường NA (g/l): pH = 6,8-7,0 Cao thiṭ 3g (thay bằng 20ml nước mắm ) Peptone 5g NaCl 50g Thạch 14-15g Nước cất 1 lít Đun sôi môi trường sau đó đổ vào bình tam giác và ống nghiêṃ đã khử trùng. Khử trùng môi trường ở 1210C/ 30 phút , làm nghiêng mặt thạch . Để 370C trong 48h trước khi duṇg hoăc̣ giữ ở 4 0 C. - Môi trường nuôi Nitrosomonas: 34 K2HPO4 1g MgSO4 0,2g CaCl2.2H2O 20mg FeSO4.7H2O 50mg MnCl2.4H2O 2,0mg Na2MoO4.2H2O 1mg Nước cất 1 lít pH 8,5 - Môi trường nuôi Nitrobacter: K2HPO4 1g MgSO4 0,2g CaCl2. 2H2O 20mg FeSO4.7H2O 50mg MnCl2.4H2O 2,0 mg Na2MoO4.2H2O 1mg Nước cất 1 lít 2.1.3.2. Môi trường lên men dic̣h thể (g/l): - Môi trường 1: Bắp cải 300g Nước mắm 15ml Nước cất 1 lít - Môi trường 2: Cà chua 300g Nước mắm 15ml Nước cất 1 lít - Môi trường 3: Giá đỗ 300g Nước mắm 15ml Nước cất 1 lít - Môi trường 4: Khoai tây 300g Nước mắm 15ml Nước cất 1 lít Đun sôi môi trường sau đó đổ 40ml vào bình tam giác 100ml đã đươc̣ khử trùng, đem khử trùng ở 121oC trong 30 phút , để nguội môi trường trong 24h giữ ở 4 o C. 35 2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u 2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩ n - Lấy 1ml mẫu đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã được khử trùng để được độ pha loãng 10-1. Vontex đều sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-6. - Lấy 50µl dung dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp trải đều lên đĩa peptri chứa môi trường nuôi cấy. - Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đó giữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng. 2.2.2. Phân loại vi sinh vật Phân loại theo phương pháp truyền thống Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn dựa vào các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa. Dựa vào đó, người ta phân loại chúng vào các chi. Phân lọai theo phương pháp sinh học phân tử  Phương pháp tách ADN vi khuẩn - Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 l TE trong ống Eppendoff. - Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37oC trong 30 phút. - Thêm 100 l SDS 10%, ủ ở 37oC trong 30 phút. - Thêm 300 l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên. - (Bước này được lặp lại 2 lần) - Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN. - Rửa tủa bằng etanol 70%. - Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không. - Thêm 30-50 l nước, bảo quản để dùng dần.  Điện di trên gel agaroza 36 - Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước. - Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn đều 2l dung dịch loading buffer 6x với 5l mẫu, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát vạch ADN trên máy soi gel. Thành phần Thể tích (%) 10 X buffer 10 dNTP 1,25 mM 16 Mồi xuôi 1 (10 pmol/l) Mồi ngược 1 (10 pmol/l) Taq polymeraza 1,2 Mẫu 2 Nước đủ 100 Mồi cho phản ứng PCR Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí nucleotit 27 đến 47 Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí nucleotit 1525 đến 1507 - Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc tiến hành Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian 1 94 1 phút 37 2 lặp lại 30 lần chu kỳ sau 94 30 giây 55 45 giây 72 2 phút 30 giây 3 72 7 phút 4 4 - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như đối với điện di genome.  Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự Terminator Ready Reaction Mix 8 l Mồi 1 l Mẫu 1l Nước cất đủ đến 20l Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau : - Chu trình nhiệt Bước tiến hành Nhiệt độ (oC) Thời gian 1 96 1 phút 2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau 96 10 giây 50 5 giây 60 4 phút 3 4 -  Xác định hàm lượng axit nucleic Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường là micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng. Không thể xác định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ kế. Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50g/ml của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40g/ml của ADN hoặc ARN mạch 38 đơn. Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein. Tỷ số A260/A280 là 1,8 đối với mẫu ADN sạch.  Đọc trình tự ADN Trình tự của rADN 16S của các chủng vi khuẩn được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài. 2.2.3. Phương pháp bảo quản giống Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch thường, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau khoảng 10 - 14 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-6 o C. Sau 1 - 2 tháng cấy truyền lại một lần. Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong ống cát, trong paraffin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2 năm. 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn Xác định hoạt tính enzym Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza, amylaza) trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch chứa 1% cơ chất tương ứng (cazein, kitin, CMC, tinh bột tan). Môi trường gồm cơ chất và thạch được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, sau đó được đổ vào các đĩa peptri đã được vô trùng, với độ dày thạch khoảng 3mm, đợi nguội, dùng khoan nút chai để đục các lỗ thạch trên môi trường. Nhỏ 200µl dịch nuôi cấy vi sinh vật vào các lỗ thạch, rồi để vào tủ lạnh 4 - 5 giờ cho enzym khuyếch tán vào thạch, sau đó chuyển vào tủ ấm 30 - 32 o C. Sau 24 giờ đem ra hiện vòng phân giải bằng cách nhuộm màu các đĩa bằng dung dịch Lugol (với cơ chất là CMC, kitin, tinh bột) và bằng axit triclo axetic với cơ chất là cazein. Hoạt tính enzym được xác định qua kích thước vòng phân giải theo công thức: Hoạt tính enzym = D - d (mm). Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ khoan Xác định hoạt tính kháng khuẩn * Phương pháp đục lỗ thạch 39 Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong đĩa peptri. Dịch nuôi vi khuẩn 2 ngày ở nhiệt độ thích hợp được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 15 phút sau đó được nhỏ với lượng 0,1 ml vào mỗi lỗ thạch. Đọc kết quả sau 3 ngày hoạt tính kháng sinh xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm). Trong đó, D là kích thước vòng vô khuẩn, d là kích thước thỏi thạch. * Phương pháp đặt thỏi thạch Vi sinh vật được nuôi trong môi trường ở nhiệt độ thích hợp trong các đĩa petri. Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSV kiểm định. Để trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường, rồi đặt vào tủ ấm (30oC). Đọc kết quả sau một ngày đối với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn. Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức: HTE/HTKS = D – d (mm). D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính thỏi thạch. 2.2.5. Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học Số lượng tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo mật độ quang học OD. Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng 660nm. 2.2.6. Phương pháp định lượng axit lactic Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng. Lấy 10ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 20ml nước cất, thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein 1%. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1% cho đến khi xuất hiện màu hồng không đổi trong 1 phút. Lấy số ml NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ nhân với 10 ta được số độ Therner ( o T). 10 o tương đương với 9mg axit lactic. 2.2.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế bào Định lượng NO2 - theo phương pháp Griss [49] Hàm lượng NO2 - được xác định dựa trên phản ứng tạo màu hồng của NO2 - với thuốc thử Griss. Thuốc thử: + Griss 1: Hòa tan 0,5g axit sunfaninic vào 150ml axit acetic 5N. 40 + Griss 2: Hòa tan 0,5g α- Naphtylamin vào 50ml nước cất, bổ xung 150 axit acetic 5N. Bảo quản trong tủ lạnh. Tiến hành: Thêm 0,05ml Griss 1 và 0,05ml Griss 2 vào 5ml dung dịch mẫu nghiên cứu, sau 10 phút phản ứng kết thúc đo độ hấp thụ ở bước sóng A520 mm. Cường độ mầu tỷ lệ thuận với nồng độ nitrit. Lượng nitrit có trong mẫu nghiên cứu được dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng dung dịch N-NO2 - 5mg/l. Lập đường chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm cho lần lượt dung dịch nitrit chuẩn nồng độ từ 0,1 đến 5 mg/l và một mẫu trắng. Làm tuần tự các thao tác đã trình bày ở trên. Sau đó mang đi đo mật độ quang học, vẽ đường chuẩn và xác định phương trình hồi quy của đường chuẩn trên. Kết quả thu được trình bày ở bảng và biểu diễn trên đồ thị. Nồng độ NO2 - (mg/l) 0 0,1 0,5 1 2 3 5 Độ hấp thụ màu 0 0,0058 0,346 0,395 0,098 0,171 0,247 Đường chuẩn y = 0.0506x + 0.0013 R2 = 0.9882 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 1 2 3 4 5 6 Hàm lượng NO2- (mg/l) Độ hấp thụ màu Linear (Độ hấp thụ màu) Định lượng NO3 - theo phương pháp Brucine [49] Phương pháp dựa trên nguyên tắc giữa phản ứng của nitrat và hợp chất brucine tạo thành phức hợp màu nâu vàng có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 410 mm. Hóa chất: Dung dịch nitrat chứa 100mg N/l; Natri asenit: Hòa tan 0,5g NaAsO2 trong 100 ml nước cất; thuốc thử brucine: hòa tan 1g brucine-sulfate và 0,1g axit sulfanilic trong 70ml nước cất nóng, thêm 3ml axit HCl , làm lạnh và bổ sung nước cất đến thể tích cuối cùng là 100ml; dung dịch axit sunfuric: bổ sung cẩn 41 thận 500ml axit H2SO4 trong 125ml nước cất, làm lạnh ở nhiệt độ phòng; dung dịch NaCl: hòa tan 300g NaCl trong 1000ml nước cất Tiến hành: Thêm lần lượt 2ml dung dịch NaCl, 10ml dung dịch H2SO4 vào cốc chịu nhiệt chứa 10 ml mẫu nghiên cứu, cốc được đặt trong giá ngâm trong bể nước lạnh, bổ sung 0,5 ml thuốc thử brucine, chuyển giá đựng cốc thí nghiệm lên bể nước nóng ở 95oC trong 20 phút, để nguội và đo độ hấp thụ màu ở A410. Lượng nitrat trong mẫu nghiên cứu tính được khi đối chiếu với đồ thị chuẩn sử dụng dung dịch N-NO3 - 1 mg/l. Lập đường chuẩn: Cách lập đường chuẩn dung dịch NO3 - cũng tương tự như phương pháp định lượng NO2 - Nồng độ NO3 - (mg/l) 0 0.1 0.5 1 2 3 5 Độ hấp thụ màu 0 0.054 0.262 0.316 0.786 0.91 1.648 Đường chuẩn y = 0.3197x + 0.0382 R2 = 0.987 0 0