Luận văn Áp dụng phương pháp VNTR – MIRU định kiểu gene các chủng mycobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục bảng

Danh mục hình

Danh mục chữviết tắt

Lời mở đầu . 1

Mục tiêu đềtài 2

Tính cấp thiết, ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đềtài . 3

1. Tổng quan tài liệu 4

1.1. Bệnh lao 4

1.1.1. Bệnh lao xét ởmức độtoàn cầu và ởViệt Nam 4

1.1.1.1. Gánh nặng bệnh lao trên thếgiới 4

1.1.1.2. Gánh nặng bệnh lao ởViệt Nam 4

1.1.2. Phân loại bệnh lao 5

1.1.2.1. Lao phổi AFB(+) 5

1.1.2.2. Lao phổi AFB (-) 5

1.1.2.3. Lao ngoài phổi 6

1.1.3. Phân loại và đặc điểm vi khuẩn lao . 6

1.1.3.1. Phân loại . 6

1.1.3.2. Các đặc điểm sinh học cơbản của mycobacteria 10

1.1.4. Bộgene vi khuẩn lao . 15

1.1.4.1. Cấu trúc bộgene vi khuẩn lao 15

1.1.4.2. Cơchếtiến hoá chung của vi khuẩn lao và chiến lược xuất hiện đa

dạng di truyền của vi khuẩn lao 16

1.2. Các kĩthuật sinh học phân tửxác định kiểu gene vi khuẩn lao 17

1.2.1. Các kĩthuật sinh học phân tửphổbiến hiện nay trong tình hình nghiên

cứu tại Việt Nam . 17

1.2.2. Kĩthuật dựa trên Variable Number of Tandem Repeats – Mycobacterial

Interspersed Repetitive Unit 21

1.2.3. Các thông sốchung để đánh giá và kiểm định phương pháp định kiểu

gene . 23

1.2.3.1. Khảnăng thực hiện . 23

1.2.3.2. Sựtiện lợi 23

1.3. Nghiên cứu dịch tễphân tửtrên M.tuberculosis (đặc biệt kiểu gene Beijing) . 24

1.3.1. Những đặc điểm di truyền xác định M.tuberculosis họBeijing 25

1.3.2. Dịch tễhọc họBeijing . 26

1.3.3. Những kết quảban đầu trong nghiên cứu lâm sàng họBeijing . 28

2. Vật liệu và phương pháp . 29

2.1. Đối tượng nghiên cứu . 29

2.2. Kỹthuật sinh học phân tửxác định kiểu gene dựa trên VNTR – MIRU . 29

2.2.1. Khuếch đại trình tự đích 30

2.2.1.1. Nguyên tắc . 30

2.2.1.2. Tiến hành 30

2.2.2. Điện di mao quản . 31

2.2.3. Xửlí thông tin thu nhận được 33

3. Kết quả . 35

3.1. Tối ưu hóa một số điều kiện phản ứng trong phương pháp VNTR –

MIRU định kiểu gene các chủng Mycobacterium tuberculosis phân lập tại

Việt Nam . 35

3.2. Đánh giá mức độáp dụng của kỹthuật định kiểu gene dựa trên VNTRMIRU 38

3.2.1. Khảnăng định kiểu gene (Typability) . 44

3.2.2. Độlặp lại của kỹthuật (Reproducibility) . 44

3.2.3. Allelic diversity: Chỉsốphân biệt đểtính độ đa dạng kiểu gene dựa trên

từng vịtrí VNTR . 45

3.2.4. Độphân giải của kỹthuật (Discriminatory power) . 46

4. Thảo luận . 51

4.1. Áp dụng phương pháp VNTR – MIRU 51

4.2. Tính ổn định của phương pháp . 52

4.3. Giá trịcủa phương pháp trong bối cảnh dịch tễ, lâm sàng . 53

5. Kết luận và Đềnghị . 55

Danh mục công trình tác giả 57

Tài liệu tham khảo

Phụlục

pdf25 trang | Chia sẻ: maiphuongdc | Lượt xem: 1816 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Áp dụng phương pháp VNTR – MIRU định kiểu gene các chủng mycobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
iển hình Mycobacterium tuberculosis và vi khuẩn lao không điển hình (non-tuberculous mycobacteria), có thể có tên khác bao gồm MOTT (mycobacteria other than tubercle) và mycobacteria trong môi trường. Nếu xét về hình thái học, đặc điểm lâm sàng, dấu hiệu X-quang, dấu hiệu mô học thì 2 nhóm này không có gì khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên, hai nhóm vi khuẩn lao này lại khác nhau đáng kể khi đề cập về tình trạng nhiễm trùng, sinh hoá, sinh học phân tử, sự nhạy cảm với thuốc điều trị lao, khả năng gây bệnh, đáp ứng điều trị hiệu quả của điều trị dự phòng. ~ 10 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hiện nay, chủng vi khuẩn lao được các nhà di truyền học phân loại như sau: [the Comprehensive Microbial Resource webpage - scripts/CMR/CmrHomePage.cgi ] Giới Vi khuẩn Ngành Actinobacteria Lớp Actinobacteridae Bộ Actinomycetales Họ Corynebacterineae Chi Mycobacteriaceae Loài Mycobacterium tuberculosis 1.1.3.2. Các đặc điểm sinh học cơ bản của mycobacteria (20) Mycobacteria thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, mặc dù chúng nhuộm màu yếu vì cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Chúng hiếu khí, không sinh bào tử và không di động. Mycobacteria không có plasmid, nhiều mycobacteriophage đã được phân lập. M.tb là trực khuẩn dài 3-5 μm, ngang 0,3-0,5 μm, không có lông mao, hai đầu tròn, có tính chất kháng cồn kháng toan. Trên tiêu bản nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen, các AFB bắt màu đỏ fuchsin, phân bố thành cụm hoặc đứng riêng rẽ (hình 1.2 A,B,C). Không chỉ như các vi khuẩn khác có peptidoglycan ở vách tế bào, vách vi khuẩn kháng cồn kháng toan Mycobacterium chứa nhiều glycolipid, đặc biệt là các mycolic acid. Phía ngoài màng sinh chất, vách M.tb gồm lớp peptidoglycan gắn với arabinogalactan (D-arabinose và D-galactose) và kết hợp với các mycolic acid. Lớp arabinogalactan/mycolic acid nằm dưới lớp polypeptide và các mycolic acid gồm lipid tự do, các glycolipid, và các peptidoglycolipid. Các glycolipid gồm lipoarabinomannan (LAM) và phosphatidyinositol mannoside (PIM) (hình 1.2 D). Các peptidoglycan, mycolic acid và glycolipid ngăn cản hoá chất thấm qua vách, vì vậy làm cho vi sinh vật sinh sản chậm và dễ kháng thuốc, khó bị thực bào tiêu diệt hơn các vi khuẩn khác. ~ 11 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hình 1.2: A. nhuộm Ziehl-Neelse,trực khuẩn M.tb đỏ B. nhuộm auramine,trực khuẩn M.tb vàng-cam C. M.tb qua kính hiển vi điện tử D. Lớp vỏ của vi khuẩn kháng cồn kháng toan Phân tử mycolic acid và phân đoạn peptidoglycan gắn với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt đại thực bào vật chủ, làm cho đại thực bào tiết ra các cytokine như tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gây phản ứng viêm tiêu diệt M.tb. Điều kiện sống của vi khuẩn lao (20) Ở điều kiện bình thường vi khuẩn lao sinh sản chậm (trung bình 20-24 giờ/chu kì). Vi khuẩn nằm ở vùng tổn thương có khi hàng tháng không bị chết, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng lại phát triển. Cách sinh sản của vi khuẩn thông thường là phân đôi tế bào, nhưng M.tb có thể sinh sản theo kiểu bào tử giống như nấm. Trong không khí, khi không có các yếu tố bất lợi, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng. Trong phòng thí nghiệm vi khuẩn có thể được bảo quản trong nhiều năm ở -70oC. Dưới ánh nắng mặt trời vi khuẩn chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím chúng chỉ tồn tại được 2-3 phút. Ở 42oC, vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở 80oC. Đàm của bệnh nhân lao sau 3 tháng trong phòng tối, ẩm vẫn còn vi ~ 12 ~ …………………………………………………………………………………………………. khuẩn tồn tại và giữ được độc lực, đun sôi đàm trong 5 phút M.tb chết, với cồn 90oC vi khuẩn tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chết ngay sau 1 phút. Để vi khuẩn lao có thể phát triển thuận lợi, trong điều kiện phòng thí nghiệm, môi trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng như môi trường Lowenstein-Jensen. Bên cạnh đó, M.tb phát triển tốt nhất ở môi trường có pH 6,2-7,2, chúng cũng có thể phát triển được trong môi trường pH acid 5,5, kiềm 8,0. Vi khuẩn lao có thể phát triển ở 29-42oC (thuận lợi nhất là 37-38oC). Sau khi nuôi cấy 4-6 tuần trong môi trường LJ có thể quan sát được khuẩn lạc. Cơ chế M.tb xâm nhập và gây bệnh (18) Vi khuẩn lao tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí. Khi được hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong vòng 2-10 tuần, các đại thực bào được hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo nên lớp vỏ cứng giúp kềm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm). Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không thể kiểm soát được vi khuẩn, vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có thể theo đường máu và đường bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhau như phổi, thận, não, xương (giai đoạn lao bệnh). Trong lao màng não, trực khuẩn lao theo đường máu đến màng não. Sau giai đoạn tiềm tàng, yên lặng trong nhiều tuần, nhiều tháng hoặc nhiều năm, trực khuẩn lao phát triển thành các hạt lao, củ lao. Khi có kích thích như kích thích do chấn thương, tình trạng miễn dịch thay đổi, trực khuẩn lao và các kháng nguyên chứa trong các củ lao được giải phóng vào các khoang màng não gây bệnh. Các yếu tố của M.tb độc tính đối với vật chủ (18) Mycobacterium tuberculosis không có các độc tố thường thấy như ở các vi khuẩn khác như chất độc, vỏ ngoài (capsules fimbriae). Tuy nhiên, nhiều đặc điểm về cấu trúc, sinh lý của loại vi khuẩn này biểu hiện độc tính vi khuẩn và khả ~ 13 ~ …………………………………………………………………………………………………. năng sinh bệnh lao. M.tb có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. Trực khuẩn lao có thể gắn trực tiếp vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã được mannose hoá trên vách (cell wall-associated mannosylated glycolipid), LAM (lipoarabinomannan), hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc. Thông thường khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian chất oxy hoá tiêu diệt. M.tb biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp phagosome với lysosome. Vách Mycobacterium có loại mycolic acid là lipid chuyên biệt nhánh alpha, những phân tử kị nước mạnh, hình thành lớp vỏ lipid bao quanh vi sinh vật , ảnh hưởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế bào. Cho đến nay người ta cho rằng mycolic acid là nhân tố chính quyết định độc tính của M.tb, có thể nhờ đó mycobacteria tránh được các protein tích điện dương, lysozyme và các gốc tự do trong các hốc thực bào, giúp mycobacteria ngoại bào thoát khỏi sự tấn công của các bổ thể trong huyết thanh. Một trong những sản phẩm liên kết mycolic acid với các chất lipid phức tạp là cord factor - yếu tố gây độc đối với tế bào động vật hữu nhũ. Chủng M.tb độc tính sinh ra rất nhiều nhân tố thừng này (Cord factor). Yếu tố quyết định khả năng M.tb lây truyền (18) Về mặt dịch tễ học, những bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây bệnh cho người khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào - số lượng vi sinh vật thoát ra ngoài môi trường - mật độ vi sinh vật trong không khí - thời gian vật chủ phơi nhiễm không khí đã bị ô nhiễm - tình trạng miễn dịch của từng cá thể như ở bệnh nhân nhiễm HIV và những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng trầm trọng khi bị nhiễm M.tb. Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những bệnh nhân này không cao. Những lợi điểm giúp M.tb gây bệnh rất phức tạp và chưa được hiểu đầy đủ. Các bằng chứng thực nghiệm cho thấy các chủng vi khuẩn có độc tính khác ~ 14 ~ …………………………………………………………………………………………………. nhau, đột biến trên những gen nhất định đã ảnh hưởng đến độc tính của vi khuẩn. Người ta vẫn chưa biết liệu có những chủng nào dễ gây bệnh đối với hệ thống thần kinh trung ương hay không. Arvanitakis và cộng sự (6) nghiên cứu kết quả RFLP của một nhóm bệnh nhân lao ở hệ thống thần kinh trung ương, trong đó lao màng não chiếm đa số do một chủng gây bệnh chiếm ưu thế, tuy nhiên cơ chế vi khuẩn lao gây bệnh ở hệ thần kinh vẫn chưa được hiểu rõ. Đồng nhiễm lao và HIV (Human Immunodeficiency Virus) Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HIV đang ngày càng gia tăng, đến năm 1996 đã có khoảng 1,5 triệu người chết mỗi năm vì HIV trên toàn cầu, đến năm 1999 đã có khoảng 30 triệu người nhiễm. Bên cạnh đó, theo UNAIDS, tại TPHCM, những người nhiễm lao ngày càng có khuynh hướng nhiễm HIV, trong năm 1997 số bệnh nhân lao nhiễm HIV là 0,9%, nhưng đến năm 2002, tỷ lệ này tăng đến 9,4%. Tỷ lệ chữa trị khỏi cho những trường hợp này khoảng 50%, tỷ lệ tử vong cao hơn 30%. HIV và lao, hai tác nhân truyền nhiễm này tương tác với nhau dẫn đến những kết quả đáng quan tâm về mặt sinh bệnh học, lâm sàng và dịch tễ. Cơ thể vật chủ đáp ứng với M.tuberculosis hữu hiệu nhờ miễn dịch qua trung gian tế bào, nhưng cũng chính loại đáp ứng miễn dịch này bị HIV làm biến đổi nhiều nhất vì tế bào chủ của HIV là tế bào CD4 và đại thực bào. Khả năng cơ thể phản ứng kháng sự tiến triển lao trong giai đoạn sơ nhiễm hay sự tái hoạt động của vi khuẩn nhiễm tiềm tàng tương xứng với mức độ ức chế miễn dịch liên quan đến nhiễm HIV. Khi bệnh nhân đồng nhiễm HIV-1 tiến trình M.tb xâm nhiễm cũng bị biến đổi. Bệnh nhân nhiễm HIV-1 tăng nguy cơ nhiễm M.tb từ bên ngoài gấp 20 lần, khả năng M.tb tiềm tàng trỗi dậy tăng cao, dễ mắc lao ngoài phổi (24). Vi khuẩn lao và virus HIV có tác dụng tăng cường khả năng xâm nhiễm lẫn nhau. HIV thúc đẩy sự phân chia và phát triển của M.tuberculosis trong cơ thể vật chủ và ngược lại, có những bằng chứng cho thấy M.tuberculosis giúp HIV nhân bản nhanh in vivo và in vitro (11). ~ 15 ~ …………………………………………………………………………………………………. 1.1.4. Bộ gene vi khuẩn lao (10) Hình 1.3: Chromosome của M.tuberculosis H37Rv. Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho M.tb, 0 – nơi bắt đầu sao chép. Vòng tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene RNA ổn định, trình tự DR đại diện bằng hình khối hồng. Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo chiều kim đồng hồ - xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt). Vòng tròn thứ 3 minh họa trình tự DNA lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP – hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngoại trừ PGRS), và vòng tròn thứ 6 chỉ vị trí trình tự PGRS (đỏ sậm). Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện lượng GC, màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65%. 1.1.4.1. Cấu trúc bộ gene vi khuẩn lao Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự (10), toàn bộ trình tự của Mycobacterium tuberculosis chủng H37Rv đã được giải mã và phân tích, cung cấp những kiến thức sinh học về loài vi khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm mới trong can thiệp phòng và điều trị bệnh. Toàn bộ bộ gene gồm 4 411 529 bp chứa khoảng 4000 gen, với tỷ lệ GC cao khoảng 65%. Điểm khác cơ bản trong bộ gene ~ 16 ~ …………………………………………………………………………………………………. giữa M.tuberculosis với những vi sinh vật khác là phần lớn các gene mã hoá những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và phân giải lipid, có 2 họ protein mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại. M.tuberculosis thường kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việc điều trị lao trở nên khó khăn. Sự kháng thuốc này chủ yếu là do vách tế bào kỵ nước tác dụng như là rào cản thấm, tuy vậy nhiều yếu tố quyết định sự kháng thuốc được mã hóa trong bộ gene vi khuẩn như là enzyme thủy phân, enzyme biến đổi tác dụng của thuốc như β- lactamases, aminoglycoside acetyl transferases, và nhiều hệ thống vận chuyển thuốc ra khác. Các nghiên cứu cho thấy phức hợp M.tuberculosis có bộ gene bảo tồn cao. Các thành viên trong họ M.tuberculosis có tính đa dạng cao khi xét về kiểu hình hoặc kiểu kí chủ, đây là ví dụ điển hình cho tính ổn định di truyền giữa các chủng (interspecies), với tốc độ đột biến vô nghĩa làm nên điểm đa hình uớc tính khoảng 0,01% - 0,03%, nhất là không có bằng chứng nào cho thấy có sự chuyển ngang vật chất di truyền trong cùng thế hệ giữa các vi khuẩn lao như các vi khuẩn khác. 1.1.4.2. Cơ chế tiến hoá chung của vi khuẩn lao và chiến lược xuất hiện đa dạng di truyền của vi khuẩn lao Bộ gene vi khuẩn càng nhỏ càng chịu nhiều sức ép tiến hoá, khi nhiễm sắc thể càng nhỏ, bộ gene sao chép càng nhanh, vi khuẩn có khả năng sinh trưởng nhanh hơn và chiếm ưu thế về số lượng trong quần thể. Nếu một quần thể chuyển đến một môi trường trong đó một loại amino acid thiết yếu có rất nhiều, một số chủng trong quần thể vi khuẩn sau vài thế hệ sẽ mất khả năng tổng hợp amino acid đó. Dần dà cuối cùng, mọi thành viên trong quần thể sẽ mất khả năng đó do mất đoạn trình tự DNA mã hoá cho con đường chuyển hoá amino acid kể trên. Quá trình này diễn ra rất chậm, áp lực tiến hoá đồng thời khiến cho kích thước bộ gene giảm, và bảo vệ vi sinh vật khỏi bị tiệt chủng do sự thoái hoá của bộ gene. Khi chủng vi khuẩn biến đổi theo đáp ứng với môi trường, chúng tuân theo cơ chế cơ chế phân tử: (i) đột biến trong giai đoạn tăng trưởng, (ii) đột biến trong giai đoạn ổn định. Khi tế bào đang tăng trưởng gặp sự thay đổi từ môi trường, chúng ~ 17 ~ …………………………………………………………………………………………………. vẫn đủ khả năng biến dưỡng để tạo đáp ứng bù (nghĩa là tăng cường độ dịch mã và đột biến). Tuy nhiên, sau 4-5 ngay nếu không có nguồn năng lượng hỗ trợ từ bên ngoài, các đột biến không chuyên biệt trong tế bào cũng sẽ tăng, sản sinh ra một chủng vi khuẩn mới để tồn tại. Tốc độ đột biến có thể bị ảnh hưởng bởi một số các yếu tố khác như nhân tố oxy hoá, tia UV, hoạt động của các enzyme sửa sai trong sao chép DNA, các biếtn số bị ảnh hưởng do môi trường thiếu thốn (chẳng hạn nguồn nucleotide). Một nghiên cứu khảo sát 26 gene cấu trúc của 842 mẫu M.tuberculosis, cho thấy hơn 95% sự thay thế nucleotide do sự thay thế amino acid trong các gene liên hệ tính kháng thuốc. Phân tích khác biệt kiểu di truyền, hay chính là định kiểu gene, được sử dụng để theo dõi các chủng vi khuẩn lao khác nhau, để thu thập thông tin liên quan đến hình thái phát tán, nhiễm và sinh bệnh. Tốc độ thay đổi ở mức phân tử rất khác nhau giữa các nhân tố như những dấu ấn sinh học này, tuỳ thuộc vào sự quan sát trong thời gian ngắn hay dài. Một dấu ấn sinh học với tốc độ thay đổi nhanh có thể để định xem một trường hợp nhiễm lao có phải là do sự hoạt hoá trở lại của vi khuẩn lao tồn tại trong người từ lâu. Mặt khác, một dấu ấn sinh học thay đổi với tốc độ chậm có thể dùng để tìm hiểu sự tiến hoá trải qua thời kì hàng chục ngàn năm. Tốc độ tiến hoá dựa trên khoảng cách tương đồng di truyền thường xét trên sự thay đổi trình tự nội bộ trong một gene chuyên biệt, những thay đổi này ảnh hưởng khác nhau lên các vùng DNA khác nhau,nên rất khó để định chính xác tốc độ tiến hoá. 1.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gene vi khuẩn lao 1.2.1. Các kĩ thuật sinh học phân tử phổ biến hiện nay trong tình hình nghiên cứu tại Việt Nam (12) Các phương pháp định kiểu gene được phát triển để nghiên cứu sự lan truyền và động học quần thể vi khuẩn (5) trong các điều kiện lâm sàng và sinh thái, không chỉ xét trên phương diện tồn tại trong một vật chủ mà còn xét đến toàn bộ hệ sinh thái toàn cầu nói chung. ~ 18 ~ …………………………………………………………………………………………………. Mặc dù bộ gene của phức hợp M.tuberculosis có tính bảo tồn tuơng đối cao so với các tác nhân vi khuẩn khác, chủng đơn hình này vẫn có những vùng đa hình trong bộ gene, đó có thể là những đơn vị lặp. Có 2 dạng đơn vị lặp, các đoạn lặp phân bố rải rác (interspersed repeats: direct repeats, insertion sequence – like repeats) và các đoạn lặp liên tục (tandem repeats , head-to-tail direct uninterrupted repeats). Spoligotyping (27) Vị trí lặp lại (The direct-repeat, DR, locus) là một vị trí trên chromosome chứa 10-50 đoạn sao chép của vùng lặp lại 36bp, các đoạn sao chép phân cách nhau bởi các đoạn giữa có trình tự thay đổi, kích thước trong khỏang 37-41bp. Các chủng Mycobacterium tuberculosis có thứ tự sắp xếp các đoạn giữa giống nhau, nhưng khác nhau trên sự tồn tại hoặc biến mất của một số đoạn giữa nhất định. Kỹ thuật định trình tự đoạn giữa (spacer oligonucleotide typing - spoligotyping) liên quan đến PCR tại vị trí DR,sau đó thực hiện phản ứng lai giữa sản phẩm PCR có đánh dấu và 43 oligonucleotide gắn trên màng và có trình tự tương hợp với từng đoạn giữa.Từng chủng riêng biệt cho tín hiệu âm hoặc dương đối với sự biến mất hoặc tồn tại của các đoạn giữa nhất định. Hình 1.4: Spoligotyping. Hình vẽ minh hoạ 43 đoạn lặp lại (hình chữ nhật xanh) và đoạn ~ 19 ~ …………………………………………………………………………………………………. giữa như các dấu ấn sinh học làm cơ sở cho phương pháp spoligotyping. Tiếp theo hình vẽ minh hoạ sự tồn tại khác biệt các đoạn giữa nhất định trong 3 chủng M. bovis Calmette– Guérin (BCG), M. tuberculosis H37Rv, và chủng giả định M. tuberculosis X. Phần cuối minh họa spoligotypes của 3 chủng IS6110 – RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Trình tự chèn là một thành phần di truyền linh động, thường nhỏ hơn 2,5 kb,thường được phân bố rộng rãi trong bộ gene hầu hết các vi khuẩn. Trình tự chèn thường mang thông tin di truyền liên quan sự chuyển vị, điều hoà. Sự chuyển vị của các nhân tố chèn thường gây ra các đứt gãy trình tự gene, làm hoạt hoá hoặc thay đổi sự biểu hiện của các gene tiếp theo do sự liên hệ với các trình tự điều hoà như promoter, trình tự đích của các protein. M.tuberculosis sở hữu một trình tự chèn đặc trưng IS6110, dài khoảng 1355 bp. Số lần lặp lại IS6110 trên bộ gene các chủng khác nhau có thể dao động từ , 0 – 26 bản sao. Năm 1993, van Embden và cộng sự đã chuẩn hoá phương pháp lai phân tích Southern blot dựa trên IS6110. Hình 1.5: IS6110-RFLP Hình vẽ minh họa chromosome của chủng giả định Mycobacterium tuberculosis X. Kiểu gene M. bovis Bacille Calmette–Guérin (BCG), chủng phòng thí nghiệm M. tuberculosis H37Rv, và chủng X với cách xác định dựa trên dấu ấn sinh học gồm trình tự chèn IS6110 và Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs). Mycobacterial DNA bị phân giải bởi enzyme cắt giới hạn PvuII. Probe IS6110 lai vào trình tự IS6110 tại vị trí bên phải vị trí cắt PvuII. Kích thước các đoạn lai tùy thuộc vào khoảng cách giữa các đoạn cắt PvuII. ~ 20 ~ …………………………………………………………………………………………………. Bảng 1.3: So sánh ưu và khuyết của 2 phương pháp định kiểu gene vi khuẩn lao thông dụng Ưu điểm Khuyết điểm IS611 0 – RFLP ‐ Phương pháp chuẩn cho dịch tễ học phân tử các chủng trong phức hợp M.tuberculosis; thường được áp dụng trong các nghiên cứu về tiến hoá, phân tích phả hệ, phát hiện các lỗi trong phòng thí nghiệm, nhiễm chéo ‐ Do đã được sử dụng rộng rãi nên có phần mềm vi tính để xử lí, có nhiều dữ liệu để so sánh ‐ Đồng hồ sinh học (mức độ ổn định của dấu ấn sinh học) đã được chứng minh đủ dài để làm nền tảng cho các nghiên cứu di truyền ‐ Các dạng RFLP với hơn 6 đoạn chèn IS có độ đa dạng nhất định ‐ Màng có thể dùng lại để lai các loại probe khác nhau ‐ Nhiễm hỗn hợp có thể được phát hiện nhờ thay đổi cường độ tín hiệu lai ‐ Cần phải cấy chuyền nhiều lần và tách chiết DNA ‐ Quy trình phức tạp ‐ Thời gian trả kết quả từ 30 – 40 ngày ‐ Không thể tin tưởng vào độ đa dạng của các dạng RLFP với ít hơn 6 đoạn chèn. ‐ Có những chủng không có đoạn chèn IS6110 (dù rất hiếm) ‐ Việc so sánh các dạng RLFP giữa các phòng thí nghiệm có thể thực hiện được nhưng phức tạp Spolig otypin g ‐ Kỹ thuật đơn giản nhất để định kiểu gene các chủng M.tuberculosis ‐ Số liệu được trình bày ở dạng nhị phân, cho phép so sánh dễ dàng dữ liệu trong phòng thí nghiệm và giữa các phòng thí nghiệm. Cơ sở dữ liệu SpolDB4 chứa dữ liệu của 40 000 chủng vi khuẩn lao từ hơn 120 nước. ‐ Màng lai đã được phổ biến rộng rãi để phân tích đồng thời 45 mẫu ‐ Có thể tiến hành trực tiếp trên trên dịch đồng nhất mẫu,không cần tinh sạch DNA, hoặc trên vi khuẩn chết. ‐ Độ phân giải không tốt bằng các phương pháp khác như IS6110 – RFLP ‐ Không thể phân biệt đồng nhiễm Không mang nhiều thông tin khi được áp dụng ở các vùng có chủng thống trị như W-Beijing ở Trung Quốc, Đông Nam Á, Nga. ~ 21 ~ …………………………………………………………………………………………………. 1.2.2. Kĩ thuật dựa trên Variable Number of Tandem Repeats – Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit (30) 9 Định nghĩa Các trình tự lặp lại (tandemly repeated sequence) phân bố rải rác trong bộ gene, chúng có thể tồn tại ở bộ gene nhiều sinh vật, ngay cả ở sinh vật bậc cao eukaryote . Các loại trình tự lặp: ƒ Microsatellite: Đoạn lặp các trình tự ngắn từ 1-13bp ƒ Minisatellite: Đoạn lặp các trình tự từ 10-100bp ƒ Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs): những đoạn DNA từ 40- 100bp, thường tồn tại ở dạng lặp và phân bố ở các vùng không mã hoá (intergenic regions) trên bộ gene M.tuberculosis Các dạng MIRUs: o Dạng 1: trình tự khoảng 77bp o Dạng 2: đặc trưng bằng đoạn chèn 24bp vào vị trí 3' và vị trí 5' của trình tự dạng 1 o Dạng 3: đặc trưng bằng đoạn chèn 15bp vào vị trí 3' và vị trí 5' của trình tự dạng 1 o Dạng hỗn hợp giữa dạng 2 và dạng 3 cũng có tồn tại, chứa cả 2 dạng đoạn chèn, như trong locus 8, 20 Hình 1.6: Vị trí của một số loci trên nhiễm sắc thể M.tuberculosis H37Rv. Những vị trí trong bộ gene biểu hiện sự siêu biến số lượng các trình tự lặp được gọi là vị trí đa ~ 22 ~ …………………………………………………………………………………………………. hình số lượng các trình tự lặp (Variable Number Tandem Repeat VNTR) 9 Giá trị của những dấu ấn sinh học này trong nghiên cứu tính đa hình và tiến hoá Kỹ thuật xác định dấu vân tay prokaryotes sử dụng dấu ấn sinh học VNTR ngày càng trở nên phổ biến. Mặc dù có nhiều nghiên cứu tìm hiểu cơ chế phân tử đa hình minisatellite ỏ người, quá trình điều hoà tính đa hình minisatellite ở vi khuẩn vẫn chưa được hiểu rõ. Đột biến ở minisatellite xuất hiện nhờ sự trượt của DNA polymerase (DNA slippage) trong quá trình sao chép DNA, thay đổi số lần lặp lặi các đoạn trình tự. Thành phần minisatellite của M.tuberculosis đã được hiểu khá rõ do chúng là một số vị trí đa hình trong bộ gene tương đối ổn định của M.tuberculosis. Từ những nghiên cứu trên các vị trí VNTR đã được hiểu rõ các đoạn lặp này cho thấy chúng tiến hoá bằng cách lần lượt giảm hoặc tăng số lần lặp lại các đoạn trình tự. Tác giả Grant (15) đề ra mô hình toán học để ước lượng khuynh hướng tăng giảm số lần lặp lại và tốc độ thay đổi. Đa số các vị trí cho thấy chúng có khuynh hướng giảm số lần lặp lại. Đột biến xảy ra tại các vị trí rất chậm chạp, vận tốc trụng bình khoảng 2,3 × 10−8, chậm hơn 350 lần so với tốc độ thay đổi ở vị trí VNTR với độ đa dạng tương tự quan sát được ở E.coli. Điều này cho thấy tập hợp thông số đa hình các vị trí VNTR của một chủng M.tuberculosis sẽ là thông tin chỉ thị cho nguồn gốc di truyền và sẽ không sai khác giữa các chủng có liên hệ dịch tễ. Tác giả Evgueni Savine (26) đánh khả năng ổn định tạm thời của các dấu ấn sinh học này bằng cách quan sát độ đa dạng của chúng qua 123 mẫu cấy chuyền nhiều lần trong thời gian 6 năm. Kết quả cho thấy 55 nhóm trong tổng số 56 nhóm có độ ổn định tốt, kết quả định kiểu gene không thay đổi. Nhờ đặc tính ổn định trong một khung thời gian nhất định, đa hình trên một số lượng cá thể, những dấu ấn sinh học này là những công cụ đắc lực để (i) theo dõi bệnh nhân nhiễm M.tb trong suốt thời gian dài, (ii) phối hợp cùng với phương pháp chuẩn lâu đời là IS6110 – RFLP để theo dõi các nhóm M.tb đang truyền dịch bệnh,(iii) nghiên cứu tiến hoá, từ phả hệ học (pedigree) đến các mối liên hệ tiến hoá lâu đời. ~ 23 ~ …………………………………………………………………………………………………. 1.2.3. Các thông số chung để đánh giá và kiểm định phương pháp định kiểu gene (32) Mỗi phương pháp định kiểu gene cần phải được đánh giá và kiểm định dựa trên một số chỉ tiêu thuộc 2 nhóm: khả năng thực hiện (performance), sự tiện lợi (convenience) 1.2.3.1. Khả năng thực hiện Một phương pháp định kiểu gene tốt cần dựa trên một dấu ấn sinh học ổn định trong suốt thời gian nghiên cứu, và không thay đổi ở một mức độ nào đó để có thể làm ảnh hưởng đến toàn bộ phối cảnh dịch tễ học. Các đặc tính của dấu ấn sinh học này cần được thể hiện trên từng mẫu, nghĩa là cho kết quả định kiểu gene trên tất cả các mẫu. Phương pháp định kiểu gene cần phải có hiệu quả phân biệt giữa các mẫu, sự phân biệt này cần phù hợp với các thông số dịch tễ học. Cuối cùng, kết quả của một phương pháp định kiểu gene tốt cần phải có tính lặp lại, độc lập với người tiến hành, không gian và thời gian. Các nhân tố có thể ảnh hưởng đến độ lặp lại gồm (i) sự chuẩn bị vật liệu cho phản ứng (các thay đổi trong điều kiện nuôi cấy, phương pháp tách chiết DNA), (ii) hóa chất, (iii) các loại dụng cụ thí nghiệm khác nhau, và (iv) sai lệch trong quá trình đọc và ghi nhận kết quả. Tính lặp lại cao giúp cho kết quả của phương pháp định kiểu gene dễ dàng được số hóa và lưu trữ vào kho dữ liệu nhờ vào các phầ

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf5_2.pdf
  • pdf0_2.pdf
  • pdf1_2.pdf
  • pdf2_2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf6_4.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf
  • pdf9.pdf
  • pdf10_3.pdf
  • pdf11.pdf