Luận văn Bước đầu nghiên cứu loài Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) tại Đà Lạt và khảo sát khả năng tác dụng của nó trên đối tượng vi sinh vật

ồng và phát triển rất mạnh tại châu Âu. Năm 1753, Linnaeus đã đặt tên cho chi của cây là Chrysanthemum. Chrysanthemum morifolium ngày nay thật ra là loài được pha trộn gen ít nhất là từ 6 loài Cúc khác nhau. Các nghiên cứu dược học về Cúc trắng: Hoạt tính trên huyết áp: Các nghiên cứu tại Nhật và Trung Hoa trong thập niên 70 ghi nhận: Nước sắc, đun sôi trong 15 phút với 24-30g hoa Cúc và 24-30g hoa Kim ngân (Lonicera japonica), chia thành 4 liều và dùng uống thay trà. Nghiên cứu này được thử nghiệm trên 46 người bệnh, uống trong 3-7 ngày liên tục. Kết quả huyết áp hạ về mức bình thường ở 35% bệnh nhân, số còn lại có kết quả tốt sau 1-12 ngày dùng thuốc. Các bệnh nhân huyết áp cao và có thêm triệu chứng choáng váng được cho dùng thêm 12g lá dâu tằm (tang diệp) sắc chung. Bệnh nhân bị sơ động mạch và mỡ cao trong máu được cho uống thêm 12-24g sơn trà (Crataegus pinnatifida). Các triệu chứng như chóng mặt, choáng váng đều thuyên giảm[13]. Tác dụng trị đau tức ngực (angina pectoris): Một nghiên cứu khác tại Trung Hoa ghi nhận: Nước sắc hoa Cúc dùng với 61 trường hợp đau tức ngực cho kết quả hữu hiệu trên 80% bệnh nhân. Kết quả rất tốt với 43.3% bệnh nhân và làm thuyên giảm triệu chứng bệnh cho 36.7% các bệnh nhân bị tức ngực, hồi hộp. 45 % bệnh nhân có những thay đổi về điện tâm đồ. Một số bệnh nhân giảm được huyết áp, và tất cả bệnh nhân đều không gặp các phản ứng phụ[13]. Hoạt tính kháng sinh: Các dung dịch chiết từ lá Cúc trắng có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn như vi khuẩn Staphylococcus aureus, Beta-hemolytic Streptococcus và Shigella sonnei. Có thể dùng lá tươi, nghiền nát và đắp trực tiếp vào mụn nhọt hay vắt lấy nước thoa vào vết thương. Nghiên cứu tại Đại học Nihon (Nhật) ghi nhận các triterpinoids, trích từ hoa có hoạt tính ức chế vi khuẩn Lao Mycobacterium tuberculosis, chủng H(37) Rv ở những nồng độ tối thiểu MIC từ 4-64 microg/ml. Nghiên cứu tại Viện Khoa Học và Kỹ Thuật Quốc Gia Đại Hàn Seoul ghi nhận flavonoid glucuronide apigenin-O-beta-D-(4’’-caffeoyl) glucuronide có hoạt tính ức chế men HIV-1 integrase ở IC(50)=7.2+/- 3.4 microg /ml) và chống hoạt động của HIV trong môi trường cấy tế bào EC(50)= 41.86 +/- 1.43 microg/ml, khi cấy vác tế bào MT-4 bị nhiễm HIV-1 (IIIB) (Planta Nedica Số 69-2003)[13]. Hoạt tính trên các tế bào ung thư: Nghiên cứu tại Đại học Nihon, Tokyo (Nhật) ghi nhận 15 chất diol và triol loại pentacyclic triterpene gồm 6 loại taraxastane (faradiol, heliantriol B0, helantriol C, 22 alpha-methoxyfaradiol, arnidiol và faradiol alpha-epoxide) và 5 loại oleananes (maniladiol, erythrodiol, longispinogenin, coflodiol và heliantriol A), 2 loại ursanes (brein và uvaol), 2 loại lupanes (calenduladiol và heli antriol B2), trích từ hoa Cúc trắng, khi được thử nghiệm về tác dụng ức chế sự kích khởi sinh kháng thể siêu vi Epstein-Barr (EB-EA) gây ra bởi chất tạo u-bướu 12-O-tetradecanoylphorboil-1-acetate (nơi tế bào Raji) cho thấy các chất này có hoạt tính ức chế mạnh hơn glycyrrhetic acid (đã được xem là một chất chống u bướu). Trong số này arnidiol có hoạt tính diệt tế bào ung thư mạnh nhất , liều GI50 (liều gây ức chế 50% tăng trưởng) là < 6 microM. (Cancer letter Số 8 (March)-2002)[13]. Hoạt tính kháng viêm: Dịch chiết hoa Cúc trắng, từ phần tan trong hexane và phần tan trong chất béo, sau khi tinh khiết hóa, đã cho nhiều loại esters acid béo (gần 30 chất khác nhau) và nhiều diol, triol loại triterpene (24 hợp chất). Các hợp chất này được thử nghiệm về hoạt tính chống sưng trên loại sưng viêm ở chuột gây ra bằng 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Kết quả ghi nhận tính chất kháng viêm rất rõ với liều ID50 là 0.03-1.0mg mạnh hơn cả tác dụng của quercetin. (Journal of Agricultural and Food Chemistry Số 49-2001)[13]. Các đặc chế chứa Cúc trắng của Trung Hoa: Tại Trung Hoa, hiện có một số đặc chế được Bộ Y-Tế Cộng Hòa Nhân Dân Trung Hoa chính thức cho phép sử dụng để điều trị một số bệnh. Đặc chế Jiantangkang được dùng để trị các chứng tiểu đường không tùy thuộc vào insulin (Chung kuo Chung His I Chieh Tsa Chih Số 17-1977). Bạch cúc là một trong 7 dược thảo được dùng trong đặc chế PC-SPES để trị ung thư, cho kết quả là làm giảm rõ rệt nồng độ PSA (prostate-specific antigen), diệt được các tế bào ung thư, đồng thời làm giảm đáng kể testosterones. Trong 2 thử nghiệm, nồng độ PSA giảm hạ ngay sau 1 tháng dùng thuốc (New England Journal of Medicine Số 339-1998). Đặc chế Hua-sheng-ping phối hợp Cúc trắng, Cam thảo và Tam thất đã được dùng để trị các vết lở loét tiền ung thư[13]. Cúc hoa vàng hay Kim cúc (Chrysanthemum indicum L.): Cúc hoa vàng có nguồn gốc từ Trung Hoa, Nhật Bản, được trồng rất phổ biến tại các quốc gia Châu Á như Ấn Độ, Việt Nam. Các nghiên cứu dược học về Cúc hoa vàng: Hình 1.2: Kim Cúc Tác dụng ức chế sự sản xuất nitric oxide: Nghiên cứu tại Đại học Kyoto (Nhật) ghi nhận dịch chiết hoa Cúc vàng bằng methanol và ethyl acetate chứa các flavonoids có hoạt tính ức chế sự sản xuất nitric oxide nơi các đại thực bào kích khởi do liposaccharides, và ức chế hoạt động của men aldose-reductase (Chemical Pharmacy Bulletin (Tokyo) Số 5-2000)[13]. Khả năng trị gout: Trong trường hợp bệnh gout: men xanthine oxydase là chất xúc tác sự oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó thành acid uric. Acid uric là chất đóng vai trò quan trọng gây ra gout. Nghiên cứu tại ĐH Nam Kinh (Trung Hoa) ghi nhận dịch chiết hoa Cúc vàng bằng methanol cho thấy có tác dụng ức chế men này ở nồng độ IC50 là 22 microgram/ml (trong khi đó nồng độ allopurinol dùng làm đối chứng là 1.06 microg/ml) (Journal of Ethnopharmacology Số 73-2000)[13]. Hoạt tính kháng sinh: Các dịch chiết từ hoa cúc vàng có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của nhiều vi khuẩn (15 loại) và nấm trong đó gồm Staphylococcus aureus, Shigella spp và cả vài siêu vi trùng loại Echo[13]. Khả năng hạ huyết áp: Các chế phẩm từ hoa cúc vàng khi cho dùng uống hay chích đều làm hạ huyết áp nhanh chóng. Các chế phẩm dùng toàn cây có tác dụng độc hại hơn và hoạt tính kém hơn là trích từ hoa. Dịch chiết từ hoa ở liều 100-200mg/kg có thể gây ra hạ huyết áp nhưng không ảnh hưởng trên tim và gan (The Pharmacology of Chinese Herbs)[13]. Tác dụng trị bệnh đường hô hấp: Trong một thử nghiệm tại Nhật trên 1000 bệnh nhân về tác dụng của Cúc vàng trong việc ngừa cảm, ghi nhận những người uống nước sắc hoa cúc vàng mỗi tuần một lần, có thể giảm được 13.2% những cơn cảm lạnh (so với năm trước đó). Khi thử nghiệm trên 119 trường hợp sưng phổi kinh niên, 38% giảm được các cơn bệnh so với nhóm đối chứng[13]. Ngoài ra còn rất nhiều loài hoa khác thuộc họ Cúc (Asteraceae) có khả năng chữa bệnh đã được nghiên cứu. Nhưng tôi chỉ giới thiệu về hai loại hoa điển hình và thường gặp trên. Hình 1.3: Núc áo rau 1.2.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Hiệu ứng chống viêm của Spilanthol trên Murine – đại thực bào – điều tiết LPS – điều trị cảm ứng viêm: Khoa hóa học ứng dụng và viện công nghệ y sinh thuộc Đại học Quốc gia ChiNan, Puli, Đài Loan đã nghiên cứu hiệu ứng chống viêm của Spilanthol từ hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) trên Murine - đại thực bào - điều tiết LPS - điều trị cảm ứng viêm. Nghiên cứu này nhằm phân lập hoạt chất hoạt động Spilanthol, bằng phương pháp bioactivity - guided để cho biết ý nghĩa hoạt động chống viêm trên mô hình kích hoạt lipopolysaccharide đại thực bào Murine RAW 264,7. Cơ chế chống viêm của paracress cũng được khảo sát nghiên cứu. Chất chiết xuất từ Spilanthes oleraceae L. được thu nhận nhờ dùng dung môi ethanol 85%, căn cứ theo việc phân vùng chất lỏng chống lại hexane, chloroform, ethyl acetate, và butanol. Cao chiết bởi ethyl acetate tỏ ra rất tốt trong việc tìm ra khả năng hoạt động của chất có trong loài hoa này. Thí nghiệm được xác định bởi DPPH và ABTS tìm ra dung môi giúp chất hoạt động triệt để. Các chất chiết xuất từ dung môi là Chloroform ức chế đáng kể việc sản xuất oxit nitric (p <0,01) và Spilanthol là chất hoạt động mạnh nhất, tác dụng đến việc ức chế. Mức suy giảm LPS gây ra cảm ứng nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX-2) mRNA và hổ trợ các hoạt động biểu hiện của protein. Spilanthol ức chế sản sinh các chất tiền viêm trung gian trong quá trình phiên mã và dịch mã. Ngoài ra, các chất kích thích LPS IL-1β, IL-6 và sản phẩm TNF-α tùy thuộc vào liều giảm Spilanthol. Quá trình LPS - phosphryl hóa còn tạo ra các chất ức chế tế bào chất và nhân NF-κB AND. Kết quả nghiên cứu này cho thấy Spilathol được chiết xuất từ Spilanthes oleraceae L. có khả năng tích cực để điều chỉnh việc sản xuất các chất trung gian tiền viêm[14]. Diệt ấu trùng của muỗi: Pendse et. al . (1946), Mehra et. al . (2000), Kalyansundaram và Das (1985) và một vài công sự khác đã tiến hành nhiều nghiên cứu tìm ra công dụng của một số các hợp chất tự nhiên. Năm 1946 họ đã chứng minh được Spilanthol trong hoa Núc áo rau khi kết hợp với DDT có thể diệt được ấu trùng của muỗi Anophen. Gokhle and Bhide (1945) đã chiết xuất chất Spilanthol có trong loài hoa này. Sau đó họ tiến hành thử nghiệm trên ấu trùng muỗi Culex, Anopheles and Aede. Phần đầu hoa được thu thập chủ yếu từ vùng đồi Gour Nagar, bảo quản khô sau đó tiến hành chiết xuất. 1kg hoa được chiết xuất với khí ete ở 60-80 °C trong vòng 12 giờ. Sau đó cô đặc cho bốc hết dung môi, rửa qua bằng acetone. Hàm lượng Spilanthol thu được vào khoảng 407mg/90%kg bột hoa khô. Tiếp đó hòa 100mg trong 10ml ethanol. Trứng muỗi thu được chứa trong nước có 0.1% albumin ở 28°C,để trong chu kì sáng tối là 12/12. Lấy 25 trứng mỗi loại cho thử với 1,3,5,10 ppm của Spilanthol. Sau 24 giờ, tỉ lệ trứng sống và bị tiêu diệt được ghi nhận. Họ nhận thấy với nồng đô Spilanthol càng cao, ấu trùng muỗi bị tiêu diệt càng nhiều[15]. Chống lão hóa da: Tiến sĩ Paula Lennon (người Pháp) và Laurent Schubnel – Gattefossé qua nhiều khảo sát đã nhận thấy nhiều người ngày nay đang muốn thay đổi diện mạo của mình và họ sẵn sàng chi trả một khoản tiền lớn cho việc sửa sang sắc đẹp để thấy kết quả một cách nhanh chóng, không phải chờ đợi trong thời gian dài. Việc phẫu thuật thẫm mĩ đang ngày càng trở nên phổ biến trong giới trẻ và ngay cả những người lớn tuổi. Việc sử dụng mỹ phẩm để bôi lên da có vẻ an toàn hơn nhưng người tiêu dùng phải chờ một thời gian mới thấy sự chuyển biến rõ nét. Việc tạo ra một sản phẩm mang lại hiệu quả nhanh chóng đã thúc đẩy Gattefossé nghiên cứu ra một chất chống lão hóa an toàn và hoa Núc áo rau là đối tượng Gattefossé lựa chọn. Loài hoa này xuất hiện nhiều ở Ấn Độ Dương, phát triển quanh năm, mọc nhiều ở Châu Phi, Nam Mỹ và Châu Á. Gattefossé thu nhận loài hoa này chủ yếu từ đảo La Reunion. Một cuộc điều tra về những tính năng phi thường của loài hoa này ứng dụng trong đời sống đã được diễn ra. Qua nhiều nghiên cứu ông đã xác định được hợp chất chính có trong loài hoa này là Spilanthol. Ông đã tiến hành một cuộc thử nghiệm trên ống nghiệm và trên cơ thể người về việc chống lão hóa. Bởi vì hằng ngày chúng ta cười nói, cau mày, da mặt chúng ta chịu nhiều lực tác động nên thường để lại nhiều nếp nhăn. Tuổi càng cao những nếp nhăn này càng xuất hiện rõ hơn. Chất chiết xuất từ loài hoa này thông qua cơ chế myorelaxing làm chậm lại sự xuất hiện của những nếp nhăn. Hiệu quả: đầu tiên hoạt động myorelaxing đã được thử nghiệm trên mô hình tái tạo các cơn co thắt cơ bắp. Mô hình này dựa trên sự kết hợp giữa nơron thần kinh và cơ bắp khi vận động. Kết quả cho thấy chỉ cần 0.6% chất chiết xuất là có thể hoàn tất 1 myorelaxation. Việc tác dụng phụ thuộc vào nồng độ chất đó trong các thử nghiệm. Sau khi hoàn tất myorelaxation, môi trường nuôi cấy được rửa sạch chất chiết xuất. Các cơn co thắt cơ bắp trở lại chứng tỏ hiệu lực của chất tác dụng. Nghiên cứu lâm sàng: nghiên cứu với những bệnh nhân có vết chân chim ở đuôi mắt. Chất chiết này có thể làm mịn làn da và mờ dần các vết chân chim. Độ mịn của làn da được đánh giá bằng 1 phương pháp quang. Nó xác định được độ nhám của làn da trước và sau khi điều trị. Các thử nghiệm được tiến hành trên da của các tình nguyện viên 2 lần mỗi ngày trong 28 ngày. Trên hai nhóm người, một nhóm bôi kem có chứa 5% chất chiết, một nhóm bôi kem chứa 2% chất chiết. Độ khô ráp của da được đánh giá qua nhiều giai đoạn trong vòng 28 ngày. Kết quả cho thấy chất chiết xuất tác động một cách mạnh mẽ và ngay lập tức. Gần 75% tình nguyện viên thấy sự khác biệt rõ rệt của làn da sau khi bôi thuốc có 2% chất chiết, còn những người bôi thuốc có 5% chất chiết thì 83% người hài lòng. Các thử nghiệm đã chứng minh chất chiết xuất này có tác dụng tốt trên những làn da bị lão hóa, ngoài ra thành phần này còn an toàn, không gây ra dị ứng[16]. Kháng nấm: Viện công nghệ ở Ấn Độ đã khảo sát nồng độ khác nhau của Spilanthol chiết từ Spilanthes oleraceae L. lên hoạt động kháng nấm (nồng độ từ 0.1-.2.0mg). Đường kính của khu ức chế trong khoảng 0.1 - 2.3cm. Trong những loài nấm khác nhau được tiến hành thí nghiệm thì sự ức chế nấm giảm dần từ Fusarium oxysporium (2,3 cm) và Fusarum moniliformis. (2,1 cm) tiếp theo là Aspergillus niger (2.0) và paraciticus Aspergillus (1,8 cm)[17] 1.2.3. Giới thiệu một số bài thuốc trong y học cổ truyền có chứa hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Chữa đau nhức răng: Lấy hoa Núc áo rau đặt trực tiếp vào chỗ răng bị đau, rồi cắn nhẹ dần dần. Sau vài phút, cơn đau nhức dịu hẳn. Một ngày chúng ta làm khoảng vài lần. Có thể lấy cụm hoa phơi khô, giã nhỏ, ngâm với rượu trong vài giờ (càng lâu càng tốt), rồi ngậm, không nuốt. Có người còn dùng Núc áo rau thay thuốc tê để nhổ răng. Trong trường hợp răng bị sâu, đau nhức dữ dội, dùng cồn thuốc ngâm hoa để ngậm cũng có tác dụng tốt[18]. Chữa tê thấp, đau nhức xương, chân tay tê mỏi: Rễ Núc áo rau 5-10g, để sống hoặc tẩm rượu, sao vàng, rồi sắc hoặc hãm uống. Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác theo công thức sau:Rễ Núc áo rau 200g, rễ độc lực 200g, rễ bưởi bung 150g, rễ vú bò 150g, rễ thiên niên kiện 100g. Bốn vị đều phơi khô, thái nhỏ, sắc với hai lần nước rồi cô thành nửa lít cao. Rễ thiên niên kiện thái phiến mỏng, ngâm với nửa lít rượu 35-40° trong 10-15 ngày, sau đó lọc, trộn cao với rượu. Ngày uống hai lần, mỗi lần một chén. Có thể thêm đường cho dễ uống. Kết hợp dùng ngoài, lấy 30-50g cả cây Núc áo rau để tươi, rửa sạch, giã nhỏ, thêm ít rượu, chưng nóng, gói vào một miếng vải màn, đắp lên chỗ đau và băng lại[18]. Chữa đau bụng, đau đầu, tiêu chảy: Rễ Núc áo rau, rễ hoàng lực, rễ kim sương, rễ chanh và quả màng tang, mỗi vị 8g. Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày[18]. Chữa đinh râu: Hoa hoặc lá Núc áo rau giã nhỏ, cho vào nồi cùng với rượu đổ ngập, đun sôi trong 10-15 phút. Bắc ra, gạn rượu, để nguội. Uống khoảng một chén nhỏ, lấy bã đắp vào chỗ sưng đau[18]. Chữa mụn nhọt, lở loét: Hoa Núc áo rau 10g, giã giập, sắc với 200ml nước còn 50ml, uống làm một lần trong ngày (Hải Thượng Lãn Ông)[18]. Diệt muỗi, ruồi: Chất chiết các cụm hoa tươi của Núc áo rau dưới dạng nhũ dịch với xà phòng và hòa loãng với nước có tác dụng diệt bọ gậy của muỗi Anophen và giòi của ruồi nhà. Hoạt chất Spilanthol chiết được từ hoa cúc áo phơi khô cũng diệt được bọ gậy muỗi Anophen, muỗi Culicides và giòi ruồi nhà. Spilanthol diệt bọ gậy kém hơn thuốc DDT, nhưng nếu phối hợp hai chất này thì tác dụng sẽ tốt hơn[18]. Chữa hóc xương cá, xương gà: Lấy cụm hoa hoặc lá Núc áo rau 50g, lá mảnh cộng 50g, lá dưa chuột dại 50g, giấm thanh 20ml. Ba thứ lá dùng tươi, rửa sạch, giã nát, thêm giấm vào, trộn đều. Đợi khoảng 20 phút, vắt lấy một chén nhỏ, cho bệnh nhân vừa ngậm, vừa uống ít một làm nhiều lần[18]. Chữa cảm, sốt: Cây Núc áo rau khô 10-12g (nếu tươi thì dùng lượng gấp đôi). Sắc uống. Nếu có ho, đờm thì có thể thêm một số vị như mạch môn, thiên môn, vỏ rễ dâu[18]. PHẦN HAIĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu thuộc đề tài này là hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Đối tượng hỗ trợ trong nghiên cứu: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và trực khuẩn Escherichia coli. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu Thu hái hoa lúc còn tươi và đang nở rộ. Sau đó cắt phần cuống, chỉ giữ lại đầu hoa, đem sấy khô ở nhiệt độ từ 50-60°C. Giã nhỏ hoặc xay bằng máy, rồi cất vào túi sạch bảo quản ở điều kiện thường. 2.2.2. Định danh khoa học Sử dụng phương pháp hình thái và so sánh thực vật kết hợp với tài liệu tra cứu về thực vật, chúng tôi xác định tên thông thường, tên khoa học, họ thực vật của đối tượng nghiên cứu. 2.2.3. Phương pháp chiết Phương pháp chiết (ly trích) là phương pháp dùng dung môi để tách lấy một hay một nhóm chất từ đối tượng nghiên cứu. Phương pháp chiết bao gồm việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết. Trong đề tài này chúng tôi thực hiện chiết bằng phương pháp chiết Soxthlet (chiết nóng) và ngấm kiệt ngược dòng (chiết lạnh). Sau mỗi phân đoạn chiết tiến hành thu hồi cao chiết bằng cách chưng cách thủy để loại dung môi. Dung môi chúng tôi sử dụng cho cả hai phương pháp chiết là: cồn 98° và Chloroform. Vì hai loại dung môi này có thể hòa tan được nhiều loại chất từ phân cực yếu tới không phân cực. Nó hòa tan tốt các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực yếu khác. 2.2.3.1. Phương pháp chiết Soxthlet Phương pháp này được thực hiện bằng bộ chiết Soxthlet với hai loại dung môi là cồn 98° và Chlorofrom. Mỗi lần chiết kéo dài 4,5giờ. Hoàn lưu dung môi. Đây là phương pháp chiết nóng. Sau khi chiết, tiến hành thu cao chiết bằng cách chưng cách thủy để loại dung môi. Nguyên liệu: Đầu hoa Núc áo rau đã được phơi khô, giã nhỏ. Dung môi: tiến hành ly trích riêng với hai loại dung môi là Cồn 980 và Chloroform. Dụng cụ: Máy xay, cân. Bếp điện. Ống đong, cốc thủy tinh, phễu. Bộ chiết Soxthlet gồm: bình cầu, ống chứa mẫu, ống sinh hàn có hệ thống nước ra vào. Giấy lọc lớn để gói mẫu. Bình có nút mài để bảo quản sau khi ly trích. 2.2.3.2. Phương pháp ngấm kiệt ngược dòng Đây là phương pháp chiết lạnh, hoàn lưu dung môi. Chúng tôi cũng sử dụng hai loại dung môi là cồn 98° và Chloroform. Sau khi chiết, cũng tiến hành thu cao chiết bằng cách chưng cách thủy để loại dung môi. Nguyên liệu: Đầu hoa Núc áo rau đã được phơi khô, giã nhỏ. Dung môi: tiến hành ly trích riêng với hai loại dung môi là cồn 98° và Chloroform. Dụng cụ: Bình nút mài. Cốc đong, ống đong, phễu. Máy xay, cân. Giấy lọc loại lớn. 2.2.4. Phương pháp hình thái và giải phẫu Nguyên liệu: Thân, lá của hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Dụng cụ: Kính hiển vi với độ phóng đại x4, x10, x40, x100 có gắn máy chụp ảnh. Đĩa petri, cốc thủy tinh, bình tam giác. Đèn cồn, dao lam, lam kính, kim mũi mác. Xốp và các dụng cụ cần thiết khác. Hóa chất: Dung dịch KOH 5%. Dung dịch H2O2. Cồn 98°. Acid acetic, Carmin, Xanh Metyl, nước cất, Glycerin. Quy trình tiến hành giải phẫu: Bước 1: Chuẩn bị Lá được hái lúc còn tươi, rửa sạch, ngâm trong dung dịch KOH 5% trong vòng từ 6-7 ngày trước khi tiến hành giải phẫu. Thân cây thì được hái lúc còn tươi, rữa sạch và giải phẫu ngay sau khi hái. Bước 2: Quy trình giải phẫu Phương pháp cắt lát mỏng thực vật: Cắt một miếng xốp có mặt phẳng. Khoét ở mặt phẳng miếng xốp một khe nhỏ theo hình vật cắt, sao cho vật cắt được giữ chặt trong miếng xốp. Để mặt phẳng của lưỡi dao lam áp sát với mặt phẳng của miếng xốp gắn vật cắt, sau đó kéo chéo từ trái sang phải. Không kéo thẳng vào ngực, không day đi day lại vì sẽ làm nát miếng cắt. Sau mỗi lần cắt dùng kim mũi mác lấy vi phẫu đã cắt cho ngay vào dung dịch nước Javen. Phương pháp tách tế bào biểu bì trên lá: Lá sau khi ngâm trong dung dịch KOH 5% từ 6-7 ngày, dùng kẹp gắp ra cho vào cốc đựng dung dịch H2O2. Đun trên ngọn lửa đèn cồn khoảng 5 phút. Sau đó, cho lá vào nước để tế bào biểu bì lá tách ra. Phương pháp nhuộm màu tế bào thực vật: Vi phẫu sau khi cắt, ngâm ngay vào nước Javen trong 15-30 phút để loại hết nội dung của tế bào. Rửa sạch nước Javen bằng nước thường. Tiếp đó ngâm vào nước có pha Acid acetic trong 5 phút để loại hết nước Javen còn dính lại (Nếu không nước Javen sẽ làm mất màu của thuốc nhuộm về sau). Rửa sạch Acid acetic bằng nước thường. Nhuộm đỏ trong dung dịch Carmin khoảng 30 phút. Rửa qua bằng nước thường rồi nhuộm trong dung dịch Xanh metyl khoảng 1 phút. Rửa sạch bằng nước thường rồi làm tiêu bản quan sát trong một giọt Glicerin. Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh: Đo đếm kích thước của tế bào biểu bì, khe lỗ khí khổng, cũng như số lượng lỗ khí khổng. Quan sát các tế bào, mạch, bó mạch. - Chụp ảnh các tiêu bản. 2.2.5. Phương pháp phục hồi chủng giống và thử khả năng ức chế của cao chiết trên vi sinh vật Phục hồi chủng giống: Chủng vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh (0 – 6oC)phòng thí nghiệm. Vì vậy trước khi tiến hành nuôi cấy ta phải tiến hành phục hồi chủng giống. Cách thức phục hồi chủng giống được tiến hành như sau: Dùng que cấy đầu tròn hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu que cấy đỏ rực, sau đó hơ phần cán để khử trùng toàn bộ que cấy. Trước khi lấy huyền dịch vi khuẩn, di đầu que cấy trên thành ống nghiệm cho đầu que cấy nguội, rồi gạt lấy huyền dịch vi khuẩn. Nhẹ nhàng cấy ria trên đĩa petri có chứa môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp. Lật úp đĩa petri, bỏ vào tủ ấm, nuôi cấy ở 30°C trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành chọn các khuẩn lạc điển hình như sau: Dùng que cấy đầu tròn, sau khi hơ đỏ rực trên ngọn lửa đèn cồn, làm nguội que cấy, gạc lấy một khuẩn lạc điển hình nằm rời, rõ cho vào bình tam giác có chứa môi trường canh thang dinh dưỡng thích hợp, dùng que cấy đánh tan tế bào trên thành ống nghiệm và tiếp tục nuôi cấy ở 30°C trong 24 giờ. Từ đây ta tiến hành pha loãng dịch vi khuẩn rồi cấy lên đĩa petri có môi trường canh thang dinh dưỡng phù hợp, ta sẽ có các khuẩn lạc vi khuẩn đồng nhất, dùng làm giống. Thử khả năng ức chế: Phân thành năm lô thí nghiệm cho mỗi chủng vi sinh vật thử nghiệm như sau: Lô ĐC: Lô đối chứng chỉ nuôi riêng đối tượng vi sinh vật và có bổ sung thêm 5ml cồn 10%. Lô A1/C1: Bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật 0.1g cao chiết được chiết bằng dung môi cồn 98°. Lô A2/C2: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật 0.2g cao chiết được chiết bằng dung môi cồn 98°. Lô B1/D1: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật 0.1g cao chiết được chiết bằng dung môi Chloroform. Lô B2/D2: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật 0.2g cao chiết được chiết bằng dung môi Chloroform. Vi khuẩn sau khi đã được kích hoạt, ta chọn khuẩn lạc riêng lẻ để cấy vào cả năm lô thí nghiệm với một lượng vi khuẩn tương đương nhau Sau 24giờ nuôi cấy lắc ở tất cả các lô, tiến hành pha loãng mẫu với mật độ tế bào tương đương nhau. Sau đó cấy lên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp. Nuôi cấy ở 30°C trong 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định mật độ vi sinh vật bằng cách đếm khuẩn lạc. So sánh với lô đối chứng để đánh giá khả năng ảnh hưởng của cao chiết lên sự phát triển của vi sinh vật. 2.2.6. Phương pháp pha loãng mẫu * Đối với chủng L.acidophillus Lấy 6 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 tới 6 và cho vào mỗi ống 9ml nước muối sinh lý 0.85% . Hút lấy 1 ml huyền dịch vi khuẩn cho vào ống 1 lắc đều, được tỉ lệ pha loãng 1/10 (10-1) Tiếp theo hút lấy 1 ml ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 được tỷ lệ pha loãng 1/100 (10-2). Tiếp tục pha loãng đến 10-6. Hút lấy 0.1ml dịch tế bào ở độ pha loãng 10-5 và 10-6. Ở mỗi độ pha loãng cấy vào 2 đĩa petri có chứa môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp nuôi cấy trong tủ ấm 30°C trong 48 giờ. Đọc kết quả mật độ khuẩn lạc mọc trên các đĩa. * Đối với chủng E.coli: - Tiến hành pha loãng tương tự như đối với chủng L.acidophillus nhưng pha loãng tới 10-8. 2.2.7. Phương pháp pha loãng cao chiết Hấp khử trùng đũa thủy tinh, cốc thủy tinh 100ml. Phương pháp pha loãng cao chiết được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Cao chiết được khử trùng bằng tia UV trong vòng 30phút. Hòa cao chiết trong 0.5ml cồn 98°. Sau đó thêm 4.5ml nước. Ta được cao chiết trong cồn 10%. PHẦN BAKẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, SINH THÁI CỦA NÚC ÁO RAU (SPILANTHES OLERACEAE L.) 3.1.1. Đặc điểm về hình thái 3.1.1.1. Hình thái bên ngoài Thân: Thân có màu tía, thường mọc đứng hoặc nằm ngang ở phần gốc, thân nhẵn, đôi khi có lông nhỏ, cao từ 30-60cm, thân tương đối mềm, phân thành nhiều nhánh. Lá: Lá mọc đối, hình bầu dục hoặc bầu dục tam giác, lá dài 3-7cm, gốc hơi thuôn, đầu nhọn, mép khía răng có 3 gân chính, có 5 cặp gân phụ, cuống lá dài từ 1 – 1.5cm. Hình 3.1: Núc áo rau Hoa: Cụm hoa mọc trên một cán dài 8-10cm, thành đầu mọc vàng, mọc ở ngọn thân hoặc kẽ lá, tổng bao có lá bắc hình bầu dục nhọn đầu, đế hoa có hình nón nhọn, mào lông có 2 răng cứng, tràng hoa hình lưỡi thường không rõ, tràng hoa ống hình bầu dục, bao phấn có phần phụ hình tam giác, hơi có tai ở gốc, bầu gân bầu dục có lông. Hoa đầu có độc ở chót nhánh, thường ở nơi chẻ hai của nhánh, cọng tương đối ngắn 1.5-2 cm, hoa đầu rộng 8 mm. 3.1.1.2. Hình thái giải phẫu Để nghiên cứu cấu trúc giải phẫu của hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) chúng tôi thực hiện các