Luận văn Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của lá cây đơn tướng quân ( syzygium formosum wall), họ myrtaceae ở Thái Nguyên

ược kết hợp những phương pháp khác nhau: dùng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau làm cho hỗn hợp ban đầu đơn giản hơn, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn hoặc tách trên sắc ký cột lặp lại nhiều lần v.v...để được chất tinh khiết. Quá trính nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm 2.1.2. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tình vi sinh vật kiểm định đối với các dịch chiết thô được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm Viện Hoá học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, từ kết quả thử hoạt tình sẽ xác định bản chất hoá học của hoạt chất. 2.1.3. Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết Để phân tìch và phân tách hỗn hợp các chất cũng như phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột thường 2.1.4. Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hính, Rf, điểm nóng chảy, đo hoạt tình quang học v.v.. khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR) với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tìch (PA). Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kìch thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ 120C thời gian từ 1,5 giờ đến 2 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554). Các hệ dung môi triển khai SKLM: 1. n-Hexan - EtOAc (8 : 1) hệ A 2. n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B 3. Cloroform - metanol (9 : 1) hệ C 4. Cloroform - metanol (5 : 1) hệ D Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 trên 100 oC để phát hiện các hợp chất. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 đến 0,200 mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kình hiển vi Boëtus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) dưới dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học -Khoa học và Công nghệ Việt nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD. - Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6. 2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÂY SYZYGIUM FORMOSUM WALL., 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm. Cặn dịch chiết metanol được chiết lần lượt với n- hexan, etylaxetat, metanol và thu được các cặn chiết tương ứng, làm khan bằng Na2SO4. Việc thu nhận các dịch chiết từ cây Đơn tướng quân (Syzygium Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 formosum Wall.,) tóm tắt trong sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu cây Đơn tướng quân (Syzygium formosum Wall., ) 1. MeOH 2. Cất loại dung môi dưói áp suất giảm 3. Cặn Sy.H Sy.E Sy.M Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4 , lọc rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi. Như vậy từ lá cây Syzygium formosum Wall., sẽ có 3 loại cặn chiết được ký hiệu là: Sy. H, Sy. E, Sy. M Ký hiệu: Sy. H: Cặn chiết n-Hexan của lá Syzygium formosum Wall Sy. E: Cặn chiết EtOAc của lá cây Syzygium formosum Wall Sy. M: Cặn chiết MeOH của lá cây Syzygium formosum Wall Mẫu khô nghiền nhỏ n- hexan Etylaxetat Metanol Cặn tổng Metanol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Kết quả thu nhận các dịch chiết từ lá cây Đơn tướng quân ở Thái Nguyên được nêu trong bảng 2.1 Bảng 2.1 : Khối lượng các cặn chiết thu được từ cây Đơn tướng quân ( Syzygium formosum Wall.,) Mẫu thu vào tháng 02/2009 Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cặn chiết thu được (g) n-hexan EtOAc MeOH Lá 1200 15,3 ( Sy.H) 48,2 ( Sy.E) 52,1 (Sy.M) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tình các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhydric acetic + 1ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1ml dịch cloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tình. 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloid Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit. Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tình. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tình. Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tình. 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ìt bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bính cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tình với các flavonoid. 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin Dịch để thử định tình được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tình, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tình. Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tình cho cumarin. 2.3.2.5. Định tính các glucosid tim Chuẩn bị dịch thử định tình cũng làm như mục 2.3.2.1. + Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tình với vòng butenolid. + Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5% Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tình với các glucosit tim. 2.3.2.6. Định tính các saponin Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tình. Kết quả phân tìch định tình các nhóm chất trong cây Syzygium formosum Wall được nêu trong bảng 2.2. Bảng 2.2 :Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Đơn tướng quân STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Lá 1 Sterol Lieberman- Bourchard Màu xanh vàng + 2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam ─ 3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + H2SO4 đặc Hồng nhạt + NaOH đặc Vàng + Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 FeCl3 5% Xanh thẫm + 4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa bông Có kết tủa - 5 Glucosit trợ tim FeCl3 trong CH3COOH + H2SO4đ Vàng nâu rõ - 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH - Chú giải : + : Phản ứng dương tình ─ : Phản ứng âm tình 2.3.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity) 2.3.3.1. Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở người Vi khuẩn: Gram (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442 E. coli (Ec) ATCC 25922 Gram (+): Staphylococus aureus (Sa) ATCC 13709 Bacillus subtilis (Bs) ATCC 6633 Lactobasillus fermentum N4 Enterococus faecium B650 Nấm : Candida albicans (Ca) ATCC 10231 2.3.3.2. Môi trường nuôi cấy MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Broth) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm. 2.3.3.3. Phương pháp pha loãng nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34  Pha loãng mẫu thử: - Mẫu ban đầu được pha trong dung môi DMSO với nồng độ thìch hợp theo yêu cầu và mục đìch thử. - Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau, có thể dãy 5 nồng độ hay 10 nồng độ. - Mẫu ban đầu có nồng độ 40mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tình với các chủng từ nồng độ 256µg/ml, 64µg/ml, 16µg/ml, 4µg/ml, 1µg/ml.  Thử hoạt tình: - Chuẩn bị vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105cfu/ml khi tiến hành thử. - Lấy 10µg dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm 200µg dung dịch vi sinh vật và nấm rồi ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá tị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tình toán dựa trên số liệu đo đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.  Chất tham khảo: - Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi khuẩn Ec gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2µg/ml. - Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn Pa gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 4-5µg/ml. - Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1µg/ml.  Giá trị nồng độ mẫu thử : - Mẫu thô có giá trị MIC ≤ 200µg/ml được coi là dương tình. - Mẫu tinh có giá trị MIC ≤ 50µg/ml được coi là hoạt tình. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Bảng 2.3 : Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn chiết lá cây Đơn tướng quân (Syzygium formosum Wall.,) STT Ký hiệu mẫu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC : µg/ml) Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm men E. coli P.aeruginosa S. aureus B.subtilis C.albicans 1 Sy.H >256 >256 >256 >256 >256 2 Sy.E >256 >256 20.21 >256 >256 3 Sy.M >256 >256 >256 >256 >256 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT 2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của lá (Sy. H) Lấy 15,0 g cặn chiết hexan đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat-hexan theo tỷ lệ tăng dần từ 0-100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5÷10 ml/ phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 5%, sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. 2.4.1.1. Ancol mạch dài (tritriacontanol) Sy.E 2/7 :C33H68O Rửa giải cột bằng hệ dung môi theo tỷ lệ n-hexan - etyl axetat theo tỉ lệ 20:1 thu được khối chất rắn vô định hính. Khối chất rắn này tiếp tục được tinh chế lại trên cột silica gel cỡ hạt nhỏ 0,040 – 0,063mm thu được chất rắn vô định hính, màu trắng khối lượng 15,2mg, RfB = 77, nóng chảy ở 84-85 o C. EI-MS (m/z : %) : [M]+ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 3.57 (2H, t), 1.54 (2H, t), 1.26 (60H, m), 0.88 (3H, t, J= 6.5Hz, 7.0Hz, CH3). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 63.6 (t, CH2OH), 14.16 (q, CH3), các tìn hiệu còn lại nằm trong vùng từ 22.86ppm đến 32.7ppm là của một dãy CH2. 2.4.1.2.  - Sitosterol (Sy.H19) Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etyl axetat (20:1), thu được khối chất rắn vô định hính, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexan đã thu được những tinh thể hính kim, không màu, có khối lượng 23mg, RfB=50, nóng chảy ở 135-136C. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H, s, 19-Me); 2 cụm doublet  0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 và Me- 27);0,83 (3H, t, 7.32Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,52 (1H, m, H-3); 5,35 (1H, d, J 5Hz, H-6). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 71,8 (d, C-3); 56,8 (d, C-14); 56,1 (d, C-17); 50,2 (d, C-9); 45,9 (d, C-24); 42,3 (s, C-13); 42,3 (t, C-4); 39,8 (t, C-12); 37,3 (t, C-1); 36,5 (s, C-10); 36,2 (d, C-20); 33,9 (d, C-8); 31,9 (t, C-7); 31,7 (t, C-2); 29,2 (d, C-25); 28,3 (t, C-16); 26,2 (t, C-23); 24,3 (t, C-15); 21,1 (t, C-11); 19,8 (q, C-26); 19,4 (q, C-19); 19,1 (q, C-27); 18,8 (q, C-21); 11,9 (q, C-29); 11,9 (q, C-18); 23.1 (t, C-28); 42.3 (t, C- 4). 2.4.1.3.  - Sitosterol-glucopyranosit Sy.H25 (Sy.E18II/22) Tiếp tục rửa giải cột bằng dung môi etylaxetat thu được khối chất rắn vô định hính, RfD=62, nóng chảy ở 269-270 o C. Phổ FT-IR max (cm -1): 3390 (rộng); 2934, 1644, 1464, 1461, 1373, 1073, 1026. Phổ EI-MS : m/z (%) : 396 [M - C6H12O6] + . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), (ppm) : 0.70 (3H, s, 18-Me), 0.93 (3H, s, 19-Me), 0.94 (3H, s, Me). Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), (ppm) : 140.8 (s, C-5), 122.3 (d, C-6), 101.5 (d, C-1’), 79.5 (d, C-3), 76.9 (d, C-5’), 76.2 (d, C-3’), 74.0 (d, C-2’), 70.8 (d, C-4’), 62.3 (t, C-6’), 57.2 (d, C-14), 56.5 (d, C-17), 50.7 (d, C- 9), 46.4 (d, C-24), 42.7 (s, C-13), 40.2 (t, C-12), 39.1 (t, C-4), 37.6 (t, C-1), 37.1 (s, C-10), 36.4 (d, C-20), 34.4 (t, C-22), 32.3 (d, C-8), 32.2 (t, C-7), 29.9 (t, C-16), 29.7 (t, C-25), 28.5 (t, C-2), 26.7 (t, C-23), 24.6 (t, C-15), 23.5 (t, C- 28), 21.4 (t, C-11), 19.9 (q, C-19), 19.5 (q, C-21), 19.2 (q, C-26), 19.0 (q, C- 27), 12.1 (q, C-29), 12.0 (q, C-18). 2.4.2. Cặn chiết etylaxetat (Sy.E) Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, sau đó làm khan bằng Na2SO4 thu được 36,5g cặn thô và 12 g cặn chiết. Kiểm tra sắc ký lớp mỏng thấy các chất chủ yếu tập trung ở cặn thô. Làm tương tự như mục 2.4.1 từ 20g cặn thô EtOAc đem tách trên cột silicagel. Rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform-metanol tăng dần theo độ phân cực (0-100%), dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. 2.4.2.1. Ancol mạch dài (tritriacontanol) Sy.E 2/7 :C33H68O Rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform – metanol theo tỷ lệ 95 :5 thu được khối chất rắn vô định hính. Khối chất rắn này tiếp tục được tinh chế lại trên cột silica gel cỡ hạt nhỏ 0,040 – 0,063mm, với hệ dung môi rửa giải là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 cloroform – metanol theo tỷ lệ 98 :2 thu được chất rắn vô định hính, màu trắng, khối lượng 4,2mg, RfB = 77, nóng chảy ở 84-85 o C. EI-MS (m/z : %) : [M]+ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3),  (ppm): 3.57 (2H, t), 1.54 (2H, t), 1.26 (60H, m), 0.88 (3H, t, J= 6.5Hz, 7.0Hz, CH3). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3),  (ppm): 63.6 (t, CH2OH), 14.16 (q, CH3), các tìn hiệu còn lại nằm trong vùng từ 22.86ppm đến 32.7ppm là của một dãy CH2. 2.4.2.2. 3-hydroxy- lup-20(29)- en (Sy.E 3/12) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi clorform – metanol theo tỷ lệ 95:5 thu được khối chất rắn vô định hính. Khối chất này được kết tinh lại trên cột silica gel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm, hệ dung môi rửa giải cột cloroform – metanol theo tỷ lệ 97:3, kết tinh lại trong metanol thu được những tinh thể hính kim có khối lượng 41,9mg, RfC = 80, nóng chảy ở 282-284 o C. Phổ FT-IR max (cm -1 ): 3588, 3461, 2937, 1685, 1456. ESI-MS (m/z): 426.36 [M+H] + 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm): 4.73 (1H, s, H-30a), 4.60 (1H, s, H-30b), 3.19 (1H, dd, J 4.8Hz và 1.4Hz, H-3β), 2.98 (1H, dd, J 4.7Hz và 1.5Hz, H-19), 0.68 (1H, d, J 9.3Hz, H-5), 0.75 (3H, s, 26-Me), 0.82 (3H, s, 29-Me), 0.94 (3H, s, 25-Me), 0.96 (3H, s, 27-Me), 0.97 (3H, s, 24- Me), 1.69 (3H, s, 28-Me). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm): 150.44 (s, C-20), 109.70 (t, C-30), 79.10 (d, C-3), 56.36 (s, C-17), 55.5 (d, C-5), 50.70 (d, C-9), 49.47 (d, C-18), 46.98 (d, C-19), 42.57 (s, C-14), 40.86 (s, C-8), 38.95 (s, C- 4), 38.87 (t, C-22), 38.53 (d, C-13), 37,35 (s, C-10), 37.09 (t, C-1), 34.50 (t, C-16), 32.27 (t, C-7), 30.70 (t, C-21), 29.80 (t, C-15), 28.06 (q, 23-Me), 27.52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 (t, C-2), 25.66 (t, C-12), 20.99 (t, C-11), 19.45 (q, 28-Me), 18.40 (t, C-6), 16.16 (q, 29-Me), 16.13 (q, 25-Me), 15.37 (q, 26-Me), 14.77 (q, 24-Me), 14.07 (q, 27-Me). 2.4.2.3. Axit ursolic (Sy.E 13/7) Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột clorform – metanol theo tỷ lệ 93 :7 thu được khối chất rắn vô định hính. Khối chất rắn này được tách lặp lại trên cột silica gel với cỡ hạt 0,040 – 0,063mm, hệ dung môi rửa giải cột là cloroform –metanol theo tỷ lệ 95 :5 thu được chất vô định hính, khối lượng 4,6mg, RfC =75, nóng chảy ở 245-246 o C. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm): 5.24 (1H, td, J 3.4Hz và 6.8Hz, H-12), 3.20 (1H, dd, J 6.8Hz và 9.9Hz, H-3), 2.19 (1H, d, J 13.1Hz, H- 18), 1.99 (1H, dd, J 4.1Hz và 13.4Hz, H-6), 1.08 (3H, s, 27-CH3), 0.94 (3H, d, J 6.2Hz, 23-CH3), 0.92 (3H, s, 29-CH3), 0.90 (1H, d, J 4.2Hz, 25-CH3), 0.85 (3H, d, J 6.4Hz, 30-CH3), 0.81 (3H, s, -CH3), 0.77 (3H, s, 24-CH3), 0.72 (1H, d, J 11.3Hz, H-5). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm): 180.62 (s, C-28), 138.28 (s, C-13), 125.63 (d, C-12), 79.02 (d, C-3), 55.35 (d, C-5), 52.92 (d, C-18), 47.92 (s, C-17), 47.67 (d, C-9), 42.18 (s, C-14), 39.58 (s, C-8), 39.19 (d, C-19), 38.99 (d,), 38.800 (t, C-4), 38.75 (t, C-1), 37.05 (t, C-22), 36.90 (s, C-10), 33.14 (t, C-7), 30.78 (t, C-21), 28.15 (q, C-23), 28.13 (t, C-15), 27.05 (t, C-2), 24.32 (t, C-6), 23.60 (q, C-27), 23.37 (t, C-11), 21.22 (q, C-29), 18.41 (t, C-6), 17.07 (q, C-30), 16.99 (q, C-26), 15.67 (q, C-24), 15.50 (q, C-25). 2.4.2.4. 2,3β-dihydroxy- lup-20(29)- en-28-oic acid (Sy.E 26/12) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform –metanol theo tỷ lệ 93:7 thu được khối chất rắn vô định hính. Tinh chế lại khối chất này trên cột silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm, dùng hệ dung môi rửa giải cloroform – Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 metanol theo tỷ lệ 95:5 thu được chất vô định hính. Kết tinh lại trong metanol thu được 20,4mg chất kết tinh hính kim , RfC=70, nóng chảy ở 288-290 o C. Phổ FT-IR max (cm -1 ): 3441, 2946, 1691, 1454 ESI-MS, m/z: 944 [2M-H] + , 472.35 [M+H] + 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm): 4.72 (1H, s, H-30a), 4.60 (1H, s, H-30b), 3.63 (1H, brs, H-19), 2,99 (1H, s, H-18), 2.92 (1H, d, J 9.4Hz, H-3), 1.69 (3H, s, 24-Me), 0.78 (3H, s, 25-Me), 0.89 (3H, s, 26-Me), 0.94 (3H, s, 29-Me), 0.97 (3H, 27-Me), 0.99 (3H, s, 23-Me). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm): 179.2 (s, C-28), 150.81 (s, C-20), 109.64 (t, C-30), 83.61 (d, C-3), 69.01 (d, C-2), 56.40 (s, C- 17), 55.63 (d, C-5), 50.69 (d, C-9), 49.6 (d, C-19), 47.19 (d, C-18), 46.78 (t, C-1), 42.67 (s, C-14), 40.93 (s, C-8), 39.42 (s, C-10), 38.59 (d, C-13), 38.44 (s, C-4), 37.30 (t, C-22), 34.41 (t, C-7), 32.44 (t, C-16), 30.77 (t, C-15), 29.80 (t, C-21), 28.55 (q, 23-Me), 25.64 (t, C-12), 21.18 (t, C-11), 19.39 (q, 24-Me), 18.49 (t, C-6), 17.42 (q, 29-Me), 16.63 (25-Me), 16.06 (q, 26-Me), 14.76 (q, 27-Me). 2.4.2.5. 2-hydroxy-ursolic acid hay 2, 3-dihydroxy- urs-12-en-28-oic (Sy.E 56/22) Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột cloroform - metanol theo tỷ lệ 9:1 thu được khối chất rắn vô định hính. Tách lặp lại trên cột silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm, hệ dung môi rửa giải cloroform – metanol theo tỷ lệ 93:7 thu được 62,2mg chất vô định hính RfC=25, nóng chảy ở 244-245 o C. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO),  (ppm): 5.13 (1H, d, J 14.6 Hz, H-12), 3.40 (1H, dd, J 4.2Hz và 13.7Hz, H-2), 2.73 (1H, d, J 9.3Hz, H-3), 2.10 (1H, d, J 11.3Hz, H-18), 1.03 (3H, s, 27-CH3), 0.91 (3H, s, 27-CH3), 0.90 (3H, s, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 25-CH3), 0.89 (3H, s, 29-CH3), 0.81 (3H, d, J 6.4Hz, 30-CH3), 0.73 (3H, s, 24-CH3), 0.69 (3H, s, 26-CH3). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO),  (ppm): 178.18 (s, C-28), 138.20 (s, C-13), 124.40 (d, C-12), 82.21 (d, C-3), 67.08 (d, C-2), 54.68 (d, C-18), 52.32 (d, C-5), 47.01 (t, C-1), 46.93 (d, C-9), 46.76 (s, C-17), 45.31 (s, C-4), 41.64 (s, C-14), 38.84 (s, C-8), 38.43 (d, C-19), 38.37 (d, C-20), 37.51 (s, C- 10), 36.24 (t, C-22), 32.56 (t, C-7), 30.12 (t, C-21), 28.76 (q, 23-CH3), 27.44 (t, C-15), 23.74 (t, C-16), 23.20 (q, 27-CH3), 20.99 (q, 29-CH3), 17.08 (q, 30- CH3), 16.92 (q, 26-CH3), 16.88 (q, 24-CH3), 16.35 (q, 25-CH3). 2.4.2.6. 2,3β,23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic (Sy.E 18I/22) Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột bằng hệ clorform –metanol theo tỷ lệ 80 :20 thu được khối chất rắn vô định hính. Khối chất rắn này lại tinh chế trên cột silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm, hệ dung môi rửa giải cloroform – metanol tỷ lệ 85 :15 thu được hỗn hợp hai chất có RfD = 75 và RfD = 62. Thực hiện lại trên cột hệ dung môi rửa giải clorform –metanol theo tỷ lệ 9 :1 thu được chất rắn vô định hính Sy.E 18I/22 có khối lượng 98,8mg, RfD = 75, nóng chảy ở 295-296oC. Phổ FT-IR max (cm -1 ): 3450, 2936, 1690, 1457, 1385, 1050. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm):5.26 (1H, t, J 3.46Hz, H- 12), 3.72 (1H, dt, J 10.48, 5.61Hz, H-2), 3.53 (1H, d, J 11.07Hz, H-23b), 3.38 (1H, d, J 9.61Hz, H-3), 3.31 (1H, d, J 9.98Hz, H-23a), 2.22 (1H, d, J 11.27Hz, H-18), 1.15 (3H, s, CH3-27), 1.06 (3H, s, CH3-26), 0.98 (3H, s, CH3-30), 0.91 (3H, d, J 6.93, CH3-30), 0.87 (3H, s, CH3-26), 0.72 (3H, s, CH3-24). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3-MeOD),  (ppm): 181.06 (s, C-28), 139.80 (s, C-13), 126.67 (d, C-12), 78.28 (d, C-3), 69.69 (d, C-2), 66.44 (t, C- 23), 54.35 (d, C-18), 49.51 (s, C-17), 48.48 (d, C-5), 48.24 (d, C-9), 48.02 (t, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 C-1), 44.10 (s, C-4), 43.39 (s, C-14), 40.80 (s, C-8), 40.39 (d, C-19), 40.39 (d, C-20), 38.99 (s, C-10), 38.08 (t, C-22), 33.65 (t, C-7), 31.76 (t, C-21), 29.16 (t, C-15), 25.30 (t, C-16), 24.46 (t, C-11), 24.16 (q, 27-CH3), 21.56 (q, 30- CH3), 19.08 (t, C-6), 17.86 (q, 26-CH3), 17.68 (q, 25-CH3), 17.65 (q, 29-CH3), 13.90 (q, 24-CH3). 2.4.2.7.  - Sitosterol-glucopyranosit Sy.E18 II/22 Trong quá trính thực hiện rửa giải cột thu được Sy.E18I/22, tiếp tục chạy cột nhưng thay đổi hệ dung môi clorform –metanol 83 :17 đã thu được chất rắn vô định hính khối lượng 12,7mg, RfD = 62, nóng chảy ở 269-270 o C. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phát hiện các nhóm chất và thử hoạt tính sinh học dịch chiết của cây Syzygium formosum Wall., Cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ và hoạt tính sinh học của chúng có quan hệ chặt chẽ với nhau do vậy việc tìm hiểu hoạt chất ở những cây thuốc dân gian thường được bắt đầu bằng việc thử hoạt tính sinh học và sàng lọc hoá học để từ đó xác định bản chất hoá học của nhóm chất mang hoạt tính sinh học. Về nguyên tắc, khi ngâm chiết mẫu thường sử dụng những dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần, như vậy sẽ thu được các cặn chiết có độ phân cực tương tự nhau. Việc phân đoạn được thực hiện theo sơ đồ 2.1. Những cặn chiết này đem thử nghiệm với các vi sinh vật kiểm định (biotest) và phản ứng hoá học đặc hiệu sẽ cho biết chúng có hoạt tính hay không và trong đó có những lớp chất nào. Kết quả xác định thành phần định tính một số nhóm chất cơ bản cho biết trong cây Đơn tướng quân có phản ứng dương tính với sterol và flavonoit. Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ