Luận văn Bước đầu tạo cây tiêu (Piper nigrum) In Vitro kháng nấm Phytophthora SP

ytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới – điểm hình nhƣ bệnh mốc sƣơng mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở Châu Âu những năm 1840, nguyên nhân do nấm P. infestans (Bourke, 1964). Bệnh Phytophthora đã đƣợc nghiên cứu sâu tại Châu Âu. Tuy nhiên đây lại là bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này; nhƣ bệnh thối rễ, thối ở cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái. Nấm P. palmivora đã gây rất nhiều bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau: đen vỏ cacao; thân và trái đu đủ; thối rễ và tàn lụi trên cam quýt; thối chồi trên cọ; sọc đen trên cao su; thối rễ loét thân sầu riêng; chết nhanh trên tiêu. Trên cây tiêu dòng nấm Phytophthora gây hại đƣợc xác định là nấm Phytophthora sp. gây hại chủ yếu trong mùa mƣa, nhất là vào cuối mùa mƣa khi có khí hậu ấm và ẩm. Nấm Phytophthora sp. có thể tấn công riêng lẻ nhƣng đa số có sự kết hợp với các nấm khác nhƣ Fusarium, Pythium và Rhizoctonia. Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi P. cinnamomi đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P. palmivora, P. paracitica (P. nicotianae) và P. citrophthora là đặc trƣng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P. infestans, P. syringae và P. fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới. 2.5 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1983, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwan đã đề xƣớng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt là ngƣời đầu tiên đƣa các giả thuyết của Schleiden và Schwan vào thực nghiệm. Ông viết trong một tác phẩm nhƣ sau: “Để kết luận, tôi tin tƣởng rằng tôi không đƣa ra một tiên đoán quá táo bạo nếu cho rằng bằng nuôi cấy, ngƣời ta có khả năng tạo các phôi nhân tạo từ các tế bào soma”. Haberlandt đã gặp thất bại trong nuôi cấy từ lá một số cây một lá mầm nhƣ: Erythronium, Ornithogalum, 11 Tradescantia. Ngày nay, chúng ta biết rất rõ thất bại của Haberlandt vì các cây một lá mầm rất khó nuôi cấy, hơn nữa, ông đã dùng những tế bào đã mất khả năng tái sinh. Năm 1922, Kotte, học trò của Haberlandt, và Robins, ngƣời Mỹ, lập lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo. Trong môi trƣờng lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trƣởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trƣởng nhƣ vậy chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trƣờng mới. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White nuôi cấy thành công trong một thời gian dài rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum) với một môi trƣờng lỏng chứa muối khoáng, glucose và nƣớc chiết nấm men. Sau đó ít lâu, White chứng minh là có thể thay thế nƣớc chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: thiamine (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã đƣợc tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Cũng trong thời gian này Gautheret ở Pháp đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy mô tƣợng tầng một số cây gỗ. Sau khi Went và Thimann phát hiện chất điều hóa sinh trƣởng (hormon) đầu tiên, acid- -indolacetic (IAA), và kết tinh đƣợc chất này, Gautheret xác nhân tác dụng kích thích sinh trƣởng mô sẹo của IAA và nhóm 3 vitamin do White đề nghị. Cùng với Nobercourt, năm 1939, Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trƣởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên một môi trƣờng rắn bằng thạch, bằng cách cấy chuyền 6 tuần một lần. Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trƣởng của nƣớc dừa trong nuôi cấy phôi họ cà (Datura). Sau đó, năm 1948, Steward xác nhận tác dụng nƣớc dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này, nhiều chất sinh trƣởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đƣợc nghiên cứu và tổng hợp thành công. Chất -napthyl acetic acid (NAA) và chất 2,4-dichloro phenoxy acetic acid (2,4D) đƣợc bắt đầu sử dụng để trừ lá cỏ rộng trong nông nghiệp. Nhiều tác giả đã nhận thấy rằng cùng với nƣớc dừa, 2,4D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bao thành công ở nhiều đối tƣợng thực trƣớc đây rất khó nuôi cấy. Năm 1954, Skoog đã tình cờ thấy, nếu thêm một ít chế phẩm đã để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trƣờng nuôi cấy các mảnh mô 12 thân cây thì tác dụng kích thích sinh trƣởng trở nên rõ rệt. Phòng thí nghiệm Skoog cố gắng tìm bản chất hiện tƣợng kích thích sinh trƣởng của DNA. DNA mới ly trích từ tinh dịch cá bẹ không có tác dụng nhƣng nếu đem hấp trong hơi acid thì mẫu DNA cũng có hoạt tính nhƣ mẫu DNA cũ. Skoog cho rằng chất có hoạt tính là một sản phẩm phân giải của DNA. Năm 1955, chất này đƣợc xác lập là 6-furfurylaminopurine và đƣợc Skoog đặt tên là Kinetin do tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này ngƣời ta chứng minh rằng sự phân bào của thực vật trong tự nhiên cũng do chất hóa học tƣơng tự nhƣ kinetin điều khiển và gộp các chất này vào nhóm cytokinin. Chất cytokinin đầu tiên đƣợc tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô. Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin và nƣớc dừa là những bƣớc tiến rất quan trọng trong giai đoạn phát triển thứ hai cùa nuôi cấy mô thực vật, đó là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trƣờng xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này. Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hƣởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trƣờng nuôi cấy đối với việc hình thành các cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hƣớng phát triển rễ, ngƣợc lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến hiện tƣợng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tƣợng này đƣợc xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trƣởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật. Trong thời gian từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác đã đƣợc phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào mô sẹo thành một dịch huyền phù các tế bào đơn bằng cách đƣa lắc trên máy lắc. Nickell (1956) nuôi liên tục đƣợc một huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris). Melches và Beckman (1959) đã nuôi liên tục tế bào đơn trong các bình dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dƣỡng mới. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã phát triển cao độ với các thiết bị tinh vi phức tạp do Street và những ngƣời cộng tác đề nghị. Năm 1960 Bergman công bố có thể dùng phƣơng pháp lọc đơn giản để thu đƣợc một huyền 13 phù không có tế bào dính cụm ma gồm hầu hết là tế bào đơn. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trƣờng, trong các hộp lồng, tiếp tục sống, phân chia và tái tạo mô sẹo. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo dựng đƣợc một cây hoàn chỉnh từ một tễ bào, chứng minh một cách tốt đẹp tính toàn thế của tế bào thực vật. Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất (over production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao. Ngƣời ta bắt đầu chú ý đến kỹ thuật nuôi cấy túi phấn sau khi Guha và Maheswari (1966) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dƣợc (Datura inoxia). Một năm sau, nhóm Bourgin và Nitsch tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn dã thành công ở rất nhiều cây và đã đóng góp vô cùng lớn vào việc tăng thêm các kiến thức di truyền thực vật và thực tiễn tuyển chọn giống. Năm 1960, Cooking ở trƣờng đại học Nottingham công bố có thể dùng cellulase để phân hủy vỏ cellulose của vỏ tế bào thực vật, kết quả thu đƣợc các tế bào tròn, không có vỏ bọc gọi là protoplast. Ngƣời ta thật sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo thành một quần lạc tế bào trong môi trƣờng lỏng. Đông thời Takebe, Labib và Melchers đã sử dụng kỹ thuật gieo tế bào của Bergman vào protoplast và tạo cây hoàn chỉnh từ protoplast. Do các protoplast có khả năng dung hợp đƣợc với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan tử từ bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hi vòng vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có hiệu quả hơn. Hy vọng này đến nay đƣợc thực tế hoàn toàn xác nhận sau khi nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã tuyên bố lai thành công giữa loài nhờ kỹ thuật protoplast, một việc không thể thực hiện đƣợc bằng lai hữu tính cổ điển. Về mặt lý luận di truyền học, protoplast là công cụ không thay thế đƣợc để nghiên cứu hiện tƣợng NST hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, vai trò của DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với DNA trong nhân bào. 14 Vấn đề biến tính của tế bào thực vật đƣợc Ledoux và cộng tác viên đề xƣớng vào năm 1965. Ông cho rằng tế bào, thậm chi hạt gống thực vật, có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào trong tế bào. DNA ngoại lai có thể gắn với DNA nội bào và có hoạt động biểu hiện tính di truyền, gây nên sự biến tính ở thực vật nhƣ đã chứng minh ở vi sinh vật Các thí nghiệm của Ledoux đƣợc tranh cãi rất nhiều, đến nay hầu hết các nhà khoa học có liên quan đều xác nhận khả năng xâm nhập của DNA ngoại lai, nhất là vào protoplast thực vật, khả năng tồn tại và biểu hiện các thông tin di truyền của chúng. Vấn đề quan trọng là làm thế nào để bảo vệ DNA ngoại lai chống lại hệ phân hủy acid nucleic có trong tế bào chủ. Từ năm 1980 đến 1922 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực gene thực vật và đƣợc công bố. Nhờ các plasmid, phân tử DNA vòng thƣờng có trong tế bào vi khuẩn, đƣợc lắp ghép, cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gene xác định đã thực hiện thành công, hàng loạt công trình chuyển gene ngoại lai vào nhiều họ thực vật. Chỉ trong một thời gian rất ngắn các thành công này đƣợc các công ty cây trồng siêu quốc gia khai thác triệt để. Các phƣơng pháp để đƣa gene ngoại lai vào tế bào thực vật cũng trở nên đa dạng. Ngoài phƣơng pháp chuyển gene bằng vi khuẩn Agrobacterium, các phƣơng pháp chuyển gene trực tiếp nhƣ kỹ thuật sử dụng điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang đƣợc các phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt kết quả rất chắc chắn. Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân giống cây trồng và phục tráng cây trồng. Ngay từ năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trƣởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp lại thì đƣợc các protocorm mới. Khi để trong các điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con. Hơn nữa các tế bào ở đỉnh sinh trƣởng thực vật chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus, do đó với phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị với cây khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác. Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống đƣợc Nozeran nhân lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của chồi nách cây nho và cầy khoai tây 15 đem nuôi cấy nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô ở quy mô lớn không còn hạn chế ở cây cảnh mà đƣợc thực hiện ở quy mô thƣơng mại đối với hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao nhƣ chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đống góp to lớn cho nông nghiệp thế giới. Chúng ta đang bƣớc vào giai đoạn phát triển thứ 4 của nuôi cấy mô thực vật. Đó là gia đoạn nuôi cấy mô thực vật đƣợc ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn độc trong môi trƣờng nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trƣởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề đƣợc chuẩn bị trong giai đoạn trƣớc. Nuôi cấy mô thực vật hiện nay đƣợc đƣa vào trong các chƣơng trình chọn giống, nhân giống hiện đại. Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu đẻ giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát ra khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp. 2.6 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 2.6.1 Sự hình thành mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô. Mô sẹo đƣợc hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Điều quan trọng đƣợc nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là.: mô sẹo phát triển không theo quy luật nhƣng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh. Đặc điểm sinh trƣởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trƣờng nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa. (1) Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô đƣợc đƣa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. (2) Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối. 16 (3) Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đƣờng trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison và ctv, 1977). Mô sẹo thƣờng có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Sự biệt hóa tế bào hình thành chất liệu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ. Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo đƣợc tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dƣỡng (Street, 1969). Hildebrandt và ctv (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lƣợng đƣờng bổ sung trong môi trƣờng và cƣờng độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng quang tự dƣỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) nhƣ: cƣờng độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xanh cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzyme, đƣờng thấp, auxin thấp, CO2 cao và tăng hàm lƣợng phosphate (Barz và Husemanm, 1982), và những tế bào quang tự dƣỡng này có khả năng cố định 14CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 cacbon (Yamada, Sato và Watanabe, 1982). Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này xảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội có số lƣợng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy, thành phần môi trƣờng nhất là hormon (Earle và Demarly, 1982). (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) Để tạo mô sẹo trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất sinh trƣởng, đôi khi có dịch chiết (Kordan, 1959). Phụ thuộc vào loại mô nuôi cấy mà chất sinh trƣởng thêm vào có khác nhau (Yeoman và Macleod, 1977). Chất hormon thƣờng tổ hợp thành 4 nhóm: (1) Auxin (2) Cytokinin (3) Auxin + Cytokinin (4) Dịch chiết Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo đƣợc cấy chuyền. Môi trƣờng cấy chuyền cũng giống nhƣ môi trƣờng tạo mô sẹo nhƣng chất sinh trƣởng đƣợc giảm nồng độ. Kích thƣớc tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thƣờng cụm mô sẹo có kích thƣớc 5-10mm và có trọng lƣợng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy 17 chuyền là 20-30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thƣờng xuất hiện hai loại tế bào: (1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng. (2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc. Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm. 2.6.2 Sự hình thành chồi từ mô sẹo Sự hình thành chồi từ mô sẹo đƣợc kích thích bởi: - Các chất sinh trƣởng đƣa vào môi trƣờng. - Chất đƣợc sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo. - Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy. Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài và sự hình thành tế bào xốp. Sự hình thành chồi đƣợc điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần Thanh Vân & Trinh (1978) sự hình thành chồi đƣợc điều khiển bằng: - Tỷ lệ cytokinin / auxin từ 10-100. - Cacbohydrate nhƣ sucrose và các chất hữu cở nhƣ casein hydrolysate. - Điều kiện nuôi cấy. - Dịch chiết Tạo rễ cần auxin, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng. Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi. Sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trƣờng không sinh trƣởng (Walker, Wendeln và Jaworski, 1979), hay có cytokinin và không có auxin (Gresshoff, 1978). Để tạo ra rễ thƣờng dùng phlorolgucinol + IBA có hiệu quả hơn chỉ dùng auxin. (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) 2.7 Các nhóm chất kích thích ảnh hƣởng lên quá trình tạo mô sẹo 2.7.1 Auxin Auxin đƣợc khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique. 18 2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau: - Kéo dài tế bào: làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. - Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+, ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+. - Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique. - Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium. Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”. - Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất ethylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở. - Hoạt động trong các phản ứng về tăng trƣởng và trong các sự hỗ tƣơng giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ƣu thế của chồi non. - Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái. - Có tác dụng kích thích tạo rễ. 2.7.1.2 Auxin trong cây trồng Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra đƣợc hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non. Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống phần dƣới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhƣng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào. 19 2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp Ngay từ khi auxin đƣợc nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hóa học đã đƣợc thí nghiệm. Một vài chất trong số này đã thể hiện những đặc tính tƣơng tự nhƣ đặc tính của auxin, nhƣng thƣờng với các liều lƣợng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme, chúng có thể có một hoạt động kéo dài. Trong số những chất đƣợc sử dụng, chúng ta có thể kể ra các chất chính sau:  Acid indolylbutyrique (AIB)  Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng nhƣ: Acid naphtyloxyacetique (ANOA) Acid naphtylacétamide (NAD)  Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D) Trong thực tế, auxin có thể đƣợc sử dụng, nó ít độc nhƣng cũng ít hiệu quả bởi vì nó bị kiểm soát rất nhanh, chính vì vậy mà các chất tổng hợp đã thay thế chất auxin mặc dù chúng có những nguy hại về độc tính cao hơn. Trong những ứng dụng thực tiễn, các chất có cấu trúc giống auxin đƣợc sử dụng để giâm cành, chúng đƣợc tìm thấy trong các ứng dụng quan trọng nhƣ: trong nghành cây ăn quả dùng để làm trống, sáng các quả, sự đậu quả hoặc còn để làm chậm sự thu hoạch quả. Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống đƣợc sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng đƣợc nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn đƣợc dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả. 2.7.2 Cytokinine Cytokinine đƣợc khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Ngƣời ta đã biết sự thêm nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập đƣợc một chất rất hoạt động mà ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất. Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:  Zeatine.  Isopentényladénine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp. Có hai 20 loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là: Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine). Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine). 2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine - Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhƣng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome. - Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. - Hoạt động kích thích sự chuyển hóa, làm thuận lợi việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải. - Hiệu quả đối kháng của tính ƣu thế chồi non: các chồi nách đƣợc xử lí Cytokinine sẽ tăng trƣởng và cạnh tranh với chồi tận cùng. - Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa. 2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn Corynebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây. 2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Dựa trên kỹ thuật chọn dòng đột biến in vitro, Steiner, đã chọn đƣợc dòng mía chống chịu bệnh mắt én (eyes spot), bệnh này do Helmintosporium sacchari, một loại nấm sản sinh ra độc tố Helmintosporoside gây hƣ hại lá. Những cây mía tái sinh chống chịu bệnh mắt én từ dòng tế bào bố mẹ CP-57-603 qua chọn dòng chống chịu độc tố Helmintosporoside, những cây mía này đƣợc trồng ra đồng và tiếp tục chọn lựa. Tƣơng tự, Krsishamarthi đã tạo ra dòng mía Pinda 70-31 chống chịu bệnh Fiji, một loại bệnh dự đoán là do virus gây ra. Do tính chống chịu bệnh Fiji tố