Luận văn Bước đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích đa dạng di truyền nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa

ày đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao. Tuy nhiên, phương pháp này có thể được sử dụng để phân tích plasmid, acteriophages, hoặc cosmid 235 [14]. 2.5.4. Phƣơng pháp chuyển bằng điện Theo phương pháp này, những phân đoạn DNA sẽ di chuyển từ gel đến màng lai thông qua dòng điện. Dung dịch đệm đóng vai trò lưu dẫn dòng điện. Do sự điện giải, tính dẫn điện của dung dịch giảm dần, vì thế cần sử dụng một lượng dung dịch đệm thích hợp để dòng điện luôn ổn định trong khi chuyển. Tốc độ chuyển phụ thuộc vào kích thước đoạn DNA, nồng độ gel và hiệu điện thế dòng điện [14]. 2.5.5. Phƣơng pháp chuyển bằng chân không Phương pháp này tương tự phương pháp mao dẫn. Buồng chân không sẽ kéo dung dịch chuyển xuyên qua gel và màng, DNA từ gel sẽ di chuyển theo sự di chuyển của dung dịch đệm đến màng. So với phương pháp mao dẫn, phương pháp này nhanh và hiệu quả hơn [14]. 2.6. Probe đánh dấu đƣợc sử dụng trong Southern blot Probe là những đoạn acid nucleic (DNA, RNA hoặc oligonucletide) đã biết rõ trình tự và kích thước, dùng để định vị các đoạn acid nucleic cần nghiên cứu có trình tự bổ sung với trình tự của probe, qua một phản ứng chuyên biệt gọi là lai phân tử. Probe có độ đặc hiệu cao, do đó nó có thể phát hiện ra đoạn gen cần tìm trong hàng ngàn đoạn DNA hoặc RNA khác nhau. Có hai hệ thống đánh dấu probe. Hệ thống đánh dấu (labeling) bằng chất đồng vị phóng xạ như 32P, 35S, 125I, 3H, được phát hiện bằng hiện tượng phóng xạ tự ghi hoặc sử dụng các loại máy đếm Geiger- Muller. Hệ thống đánh dấu không dùng chất đồng vị phóng xạ như Biotin, Enzyme, Chemiluminescence, Fluorescence, Kháng thể (Antibodies). Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”, “digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin”. Cả ba hệ thống này, thể probe lai có thể sẽ được phát hiện với cơ chất chromogenic. Cơ chất này sẽ tạo ra ánh sáng đối với enzyme có trong hệ thống [2]. Đánh dấu probe được thực hiện bằng một số phương pháp sau: phương pháp nick – translation, phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên), phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi), phương pháp photobiotin. 10 2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea Transposon là yếu tố thường gặp trong cả prokaryote và eukaryote, đây là những vùng có khả năng chuyển vị trong genome. Trong những năm gần đây, những yếu tố này được phát hiện tăng số lượng trong các loài nấm sợi. Transposon của nấm cũng giống như transposon của của các loài eukaryote khác, chúng được phân thành 2 nhóm chính. Các yếu tố nhóm I chuyển vị qua trung gian RNA, các yếu tố nhóm II chuyển vị trực tiếp từ DNA sang DNA. Yếu tố nhóm I phân thành 3 loại: retrotransposon LTR mã hóa enzyme RT (reverse transcription) và có chứa LTR (long terminal repeat) ở cả hai đầu, retrotransposon LINE cũng mã hóa RT và có đuôi polyA nhưng không có LTR và yếu tố SINE thể hiện đặc tính cần phải phiên mã bằng polymerase RNA III và không có gen RT. Sự biểu hiện của các transposon trong vi sinh vật luôn được quy định hoàn toàn bởi genome kí chủ. Nhưng hoạt tính của chúng lại rất khác nhau tùy theo điều kiện xử lý: shock nhiệt, chiếu tia UV, nuôi cấy mô, lai và chủng với vi khuẩn hoặc xử lý với những yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [17]. M. grisea là một loại nấm có phổ kí chủ rất rộng, chúng có thể kí sinh trên hơn 50 loại thực vật thân cỏ và một số loài cây 1 lá mầm khác [11]. Loại nấm này phân hóa và gồm một số loại tác nhân gây bệnh chuyên biệt cho kí chủ. Tác nhân Oryza gây bệnh cho cây lúa (Oriza sativa), Setaria gây bệnh trên loài kê đuôi cáo (Setaria italica), Panicum gây bệnh trên loài kê thường (Panicum miliaceum), Triticum là tác nhân gây bệnh trên lúa mì (Triticum aesticum), Eleusine là tác nhân gây bệnh trên kê hình ngón tay (Eleusine coracana) và digitaria tác nhân gây bệnh trên loài cỏ crabgrass (Digitaria sanguinalis) [17]. Hình 2.4. Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY . Các phân đoạn của nó pMGY18, pMGY23 (dòng kẻ đậm) và probe SB (bằng dòng kẻ trắng) để đánh giá số lượng bản sao của MAGGY trong genome. Tên viết tắt của các enzym cắt: BamHI (B), EcoRV (E), HindIII (H), PstI (P), SalI (S).(Yukio Tosa và ctv, 1995). 11 Genome M. grisea có 6 nhiễm sắc thể, có trọng lượng phân tử là 38 megabase và kích thước mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. Có nhiều transposon được tìm thấy trong genome của M. grisea tạo nên những trình tự DNA lập lại được gọi là MGR (M. grisea repeat), các MGR này giúp phân biệt các cá thể trong một quần thể nấm M. grisea đa hình. Một số MGR được tìm thấy trong quần thể nấm M. grisea: MGR583, MGR586, MGSR1, Grasshopper, MAGGY, Fosburi và Pot2 [9, 16]. Nhóm I gồm các retrotransposon LTR Grasshopper, MAGGY và fosbury, retrotransposon MGR583- LINE, yếu tố MGSR1-SINE và Mg-SINE, nhóm II gồm MGR586 hoặc Pot3 và Pot2. MGR583 được cho là những yếu tố cũ, đã xuất hiện rất sớm trong quần thể M. grisea trong quá trình tiến hóa của nó, LTR-retrotransposon MAGGY và Grasshopper thì bị giới hạn, và được cho là những yếu tố mới cái mà gần đây mới xuất hiện trong quần thể nấm Pyricularia bằng sự di chuyển ngang. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng MAGGY là yếu tố hoạt động mạnh nhất trong các yếu tố được kiểm tra về sự chuyển vị trong quần thể M. grisea [17]. MAGGY là một retrotransposon kích thước 5,6 kb, được phân tách từ nấm Magnaporthe grisea và có 2 ORF và các LTR có kích thước 253-bp ( Farman và ctv 1996). ORF1 mã hóa chuỗi polypeptide gồm 457 amino acid, ORF2 có đặc tính của gen pol mã hóa một polypeptide có chức năng protease. Hầu hết các retrotransposon được tìm thấy trong các loại nấm sợi ngày nay được phân vào nhóm Ty3-gypsy với một vài ngoại lệ. MAGGY có nhiều coppy trong bộ gen M. grisea phân lập được từ cây lúa, cây kê đuôi cáo, và một số loại cỏ khác, nhưng chúng không tìm thấy trong nấm M. grisea phân lập từ lúa mì [8]. 2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe grisea Hamer và ctv (1989) là những người đầu tiên tìm ra một họ những trình tự DNA lập lại trong genome của M. grisea được gọi là MGR586. Ứng dụng phương pháp DNA-fingerprinting sử dụng probe MGR586 đã mở ra một hướng mới trong nghiên cứu cấu trúc của quần thể nấm M. grisea. Sau đó, những nghiên cứu này được phát triển xa hơn trong nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm gây bệnh cháy lá trong các vùng trồng lúa trên thế giới. Một vài trình tự DNA lập lại trong quần thể nấm này cũng được tìm thấy sau đó như: Pot2, Fosbury, MGSR1, MAGGY và được sử 12 dụng thay thế cho probe MGR586. Trong đó, MAGGY được xem là probe tốt nhất vì trong một số trường hợp nó có thể cho thấy sự khác biệt giữa các nòi nấm M. grisea trong cùng một kí chủ. Hamer và ctv (1992) đã sử dụng probe MGR586, lai chéo với các dòng là tác nhân gây bệnh cho lúa và những dòng không gây bệnh trong phòng thí nghiệm. Kết quả ông đã tìm được 57 đoạn DNA cắt giới hạn được lai với probe MGR586 của dòng gây bệnh trên lúa và phát hiện ra 8 nhóm liên kết. Những kết quả đó cho phép Hamer xây dựng bản đồ 3 gen sắc tố (Alb1, Rsy1 và Buf1), vị trí lai (Mat1), tổ chức tạo nhân con (Rdn1), gen Smo1 và hai đa hình RFLP liên kết với Smo1. Kết quả của Hamer đã chỉ ra rằng vị trí của các MGR586 được phân bố một cách ngẫu nhiên trong genome của nấm M. grisea. Yukio Tosa và ctv (1995) đã sử dụng hai probe pMGY23 và pMGY18 được tách dòng từ MAGGY, để phân tích sự phân bố của retrootransposon MAGGY trong các dòng Pyricularia được phân lập từ các loài thực vật một lá mầm ở nhiều nước khác nhau. Kết quả ông đã tìm thấy được nhiều bản sao của MAGGY trong các nòi phân lập từ lúa và kê đuôi cáo (Setaria italica). Điều này chứng tỏ các nòi là tác nhân gây bệnh trên lúa có quan hệ di truyền gần với nòi từ loài Setaria. Pradeep Kachroo và ctv (1995) sử dụng phương pháp Southern blot với probe Mg-SINE, phân tích genome của các nòi M. grisea. Qua nghiên cứu Kachroo đã phát hiện ra khoảng 100 bản sao của Mg-SINE trên một thể đơn bội trong cả các nòi gây bệnh cho lúa và các nòi không gây bệnh cho lúa. Verel Shull và John E. Hamer (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn MGR586 trong quần thể nấm M. grisea. Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2. P2 được tạo ra do một đoạn chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR. Kết quả các ông đưa ra rằng những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác. Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M. grisea ở Nhật Bản bằng phương pháp DNA fingerprinting. Don đã sử dụng Probe SB lai với MAGGY và MGR586. Kết quả đã cho thấy rằng có hai dòng liên kết trong quần thể nấm, hai dòng này chỉ ra khả năng gây độc tương tự nhau. MAGGY thể hiện trong các nhóm cũng tương tự như MGR586, mặc dù hai yếu tố nay khác nhau về tính chất và 13 cấu trúc. Điều này cho thấy rằng MAGGY có thể thay thế cho MGR586 trong những nghiên cứu khác trong quần thể các nòi M. grisea gây bệnh cho lúa. Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần thể nấm M. grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng bằng Sông Cửu Long (1996). Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen MAGGY. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa các nòi ở hai vùng trồng lúa này. Đầu tiên, khả năng gây độc rất khác nhau đặc biệt là trên những dòng có gen kháng Pi-ks và Pi-ta. Thứ hai, các nòi ở khu vực phía Bắc thì đa dạng về cấu trúc dòng hơn các nòi ở khu vực phía Nam. Motoaki Kusaba và ctv (1999) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea được phân lập từ nhiều loại kí chủ khác nhau bằng sự đa hình các đoạn MAGGY trong DNA genome. Kusaba nhận ra sự hiện diện với số lượng bản sao nhiều của MAGGY trong genome, thực hiện đọc trình tự vùng ITS2 để xây dựng sơ đồ mối quan hệ giữa các dòng. Những kết quả cho thấy rằng MAGGY di chuyển ngang trong di truyền quần thể nấm M. grisea. Những kết quả nghiên cứu đó đã xây dựng một cơ sở dữ liệu về bản đồ di truyền của quần thể nấm M. grisea kí sinh trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là trên cây lúa. Cơ sở dữ liệu đó có thể được sử dụng cho những nghiên cứu sau này. 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ 06-02-2006 đến ngày 15-08-2006. 3.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông Học, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phòng công nghệ sinh học, trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Đối Tƣợng khảo sát Các dòng nấm Magnaporthe grisea được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. 3.3. Nội dung thực hiện - Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea. - Thiết lập phản ứng cắt DNA genome bằng enzyme cắt giới hạn. - Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 . - Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn. - Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid. - Tạo mẫu lai trên DNA genome của nấm M. grisea. - Thực hiện lai Southern với probe palsmid pMGY-SB được đánh dấu bằng biotin 3.4. Vật liệu và hóa chất 3.4.1. Dụng cụ và thiết bị 3.4.1.1. Dụng cụ - Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl), đầu tip các loại - Eppendorf 1,5 ml, 200 µl, ống ly tâm 15 ml 15 - Màng Hybond-N - Bình đựng nitơ lỏng - Kính hiển vi quang học - Bình tam giác (250, 500, 1000ml), ống nghiệm, đĩa petri, becher - Phim Konica 30 x 40 cm (100 tấm / hộp) - Cassette 30 x 40 Konica 3.4.1.2. Máy móc và thiết bị - Buồng lai: HB – 1000 Hybridizer - Máy cross-linker: GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio-Rad) - Máy điện di (Bio - Rad) - Máy chụp gel (Bio - Rad) - Máy lắc định ôn - Máy vortex - Bồn nước ổn nhiệt - Tủ sấy dụng cụ - Nồi hấp (Autoclave - Tomy) - Máy đo pH - Cân kỹ thuật - Máy khuấy từ - Máy lọc nước khử ion - Tủ cấy vô trùng (micro flow) - Tủ lạnh -4oC, - 20oC, - 70oC 3.4.2. Hóa chất Các hoá chất được sử dụng trong đề tài này được sản xuất bởi Công ty Sigma, Meark, Amersham Biosence và Bio Rad. 3.4.2.1. Môi trƣờng - Môi trường lỏng CZA : yeast extract, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, Glucose. - Môi trường lỏng LB chứa Ampiciline: yeast extract, bactose trypton, NaCl. 3.4.2.2. Hóa chất dùng trong ly trích DNA - Nitơ lỏng - Phenol /Chloroform/Isoamyl (25:24:1) - Isopropanol - Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM tris HCl, 1mM EDTA pH 8.0 - Ethanol 70%, 100% - RNAse 16 - Dung dịch ly trích (lyssis buffer): 50mM tris HCl, 50mM EDTA, 3% SDS, 1% - mercaptoethanol. 3.4.2.3. Hóa chất dùng trong Southern blot Hóa chất chuyển DNA lên màng - Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M - Đệm trung tính: Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0 - Đệm chuyển (transfer buffer): SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X. Hóa chất để tạo probe - Reaction buffer - Labelling reagent - Cross – linker working Hóa chất dùng trong phản ứng lai - Dung dịch đệm lai: Alkphos Direct hybridization buffer (Amersham) - Dung dịch rửa 1 (Primary wash buffer): Urea 2 M; SDS 0,1%; natri phosphate. - Dung dịch rửa 2 (Secondary wash buffer ): Tris-base 1M, NaCl 2M, pH 10.0. Hóa chất để phát hiện phản ứng lai - Chất phát hiện: detection reagent with CDP – star (Amersham) - Bộ thuốc rửa phim Konica (developer + fixer) Enzyme cắt giới hạn Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai Tên enzyme Trình tự nhận biết Mã hàng Nhà sản xuất BamHI EcoRV HindIII G /GATCC GAT/ATG A/AGCTT Cat. No. 220 612 Cat. No. 667 145 Cat. No. 656 313 Roche Roche Roche 17 3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm (isolate) 3.5.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm Các mẫu phân lập được nuôi cấy trên môi trường lỏng CZA (Czapek- Dox) (Tuite, 1969): 20g Glucose, 3g yeast extract, 0,5g KH2PO4, 0,5g K2HPO4, 0,5g MgSO4-7H2O (hoặc 0.005g/500 ml FeSO4-H2O), một ít NaCL trên tổng thể tích 1000ml, pH 6.0-6.5. Chuẩn bị một cốc dung tích 1000ml, cho vào cốc 800ml nước cất vô trùng, cân đủ lượng tất cả các loại hóa chất này và cho vào cốc khuấy tan bằng máy khuấy từ. Sau đó, môi trường được san đều vào 10 bình tam giác, mỗi bình 100ml, hấp khử trùng trong nồi hấp 20 phút ở 1210C. Sợi nấm được lấy ra trên một đĩa petri vô trùng, dùng dao vô trùng băm nhỏ ra và cho vào bình chứa môi trường lỏng. Sinh khối nấm được nhân trong điều kiện lắc với tốc độ 5000 vòng, trong khoảng 72 giờ. Sau đó, tôi thu được khối sợi nấm là những hạt tròn nhỏ li ti, lọc lấy khối sợi nấm này qua vải lọc (đã được khử trùng) và làm khô bằng giấy thấm, đặt khối sợi nấm vào giấy bạc và giữ ở -80oC. 3.5.1.2. Ly trích DNA theo phƣơng pháp lysis buffer - Đặt 10 g sợi nấm đã được làm khô kiệt vào cối và nghiền nát trong dung dịch nitơ lòng. Sau đó, sinh khối nấm đã nghiền nát được chuyển vào ống ly tâm 15 ml. Chú ý, trong giai đoạn này tránh để bột nấm bị ướt. - Thêm 400 l Lysis buffer, trộn đều hỗn hợp và đem ủ khoảng 1 giờ ở 65oC. - Lấy ống nghiệm ra khỏi dung dịch nước ấm. Thêm vào khoảng 300 l Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ, dung dịch lúc này có màu trắng đục như sữa (không nên lắc mạnh tránh DNA bị đứt gãy). - Ly tâm 20 phút 10000 vòng ở nhiệt độ phòng. - Dùng pipet hút dịch nổi và chuyển vào một ống nghiệm mới. - Thêm 0,5 vol Isopropanol, vào dịch nổi mới thu được, trộn nhẹ nhàng, ủ ở - 20 0C khoảng 1 giờ, để làm kết tủa DNA, lúc này DNA kết tủa tạo thành những sợi màu trắng đục. 18 - Dùng ống thủy tinh (hiệu Ikarea) được tạo thành một đầu cong dưới đèn cồn và móc lấy DNA chuyển qua eppendorf sạch, dùng ethanol 70% rửa DNA nhiều lần mỗi lầm khoảng 300 l. - Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở tủ mát 40C hoặc tủ -200C cho đến khi sử dụng. 3.5.1.3. Phƣơng pháp tinh sạch DNA Các bước tinh sạch DNA bằng RNAse như sau: - Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nước cất vô trùng (hoặc TE 1X) vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) - Thêm 2 l RNAse vào hỗn hợp trên và trộn đều - Ủ ở 370C trong khoảng 2 giờ - Thêm vào 20 l phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1) - Ly tâm 13500 vòng trong 10 phút, thu phần dịch nổi cho vào eppendorf mới - Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút - Ly tâm 13500 vòng 1 phút bỏ phần dịch nổi bên trên - Làm khô DNA và hòa tan DNA với TE 1X - Điện di trên gel agarose 0,8%, với dung dịch đệm TAE 0,5X, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA. Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. - Kết quả được đọc bằng máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm quantity one 2000). 3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp - Cấy 30 l dịch vi khuẩn E.coli DH5 vào 3 ống nghiệm chứa 3 ml môi trường LB lỏng. - Nuôi cấy lắc ở 370C trong 4 giờ đến khi đạt được mật độ khoảng 108 tế bào/ml. - Chuyển ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong 10 phút. 19 - Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên thu phần sinh khối ở bên dưới, lập lại bước này 3 lần. - Thêm 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu được, votex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. - Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf để làm khô kết tủa. - Thêm 150 l CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf hòa tan phần kết tủa trên, thêm 20 l glycerol 98% trộn đều và trữ ở -700C. 3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) - Hút 30 l dịch tế bào vi khuẩn E.coli DH5 đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1,5 ml, thêm một thể tích phù hợp tương ứng với 100ng của DNA plasmid, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá 20 phút - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf vào nước đá, giữ lạnh trong 2 phút. - Thêm 800 l môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200 l huyền phù tế bào đã biến nạp ở trên cho vào 3 ml môi trường LB chứa kháng sinh Ampiciline với nồng độ 70 g/ml, nuôi cấy lắc ở 37 0C qua đêm. Tôi tiến hành cùng một quy trình trên với tế bào khả nạp nhưng không cho DNA plasmid vào để làm đối chứng. 3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp Kết quả biến nạp có thể được kiểm tra trực tiếp bằng cách nuôi trong môi trường LB chứa kháng sinh với nồng độ 70 g/ml. Những tế bào vi khuẩn nào có chứa plasmid thì có thể sống và tăng sinh trong môi trường kháng sinh, cón những tế bào nào không chứa plasmid thì không kháng lại được kháng sinh và chết. Từ đó, tôi có thể chọn lọc được dòng vi khuẩn chứa plasmid, và ly trích được plasmid mà tôi cần sử dụng với số lượng lớn. 20 Phƣơng pháp chiết tách plasmid sử dụng SDS-kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng, Sau khi màng tế bào bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của enzyme DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách triết, làm cho DNA genome và DNA plasmid bị biến tính. Sau đó, trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA plasmid sẽ được phục hồi nhanh chóng, DNA của bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA plasmid. Vì vậy, DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein và DNA genome của tế bào sẽ bị tủa suống. Như vậy, ta có thể tách DNA plasmid ra khỏi tế bào của bộ gen mà it bị lẫn DNA genome. Chọn những ống vi khuẩn tăng sinh được trong môi trường kháng sinh ở trên để ly trích DNA plasmid theo quy trình sau: - Hút địch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000vòng/phút trong 1 phút ở 200C để thu sinh khối. - Hút bỏ dịch bên, tiếp tục hút dịch vi khuẩn từ những ống nghiệm tương ứng cho vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. - Cho 150 l dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, votex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. - Thêm 200 l dung dịch II, đảo nhẹ khoảng 8 lần (dịch trong eppendorf trở nên nhớt), sau đó thêm tiếp 150 l dung dịch III, đảo nhẹ eppendorf (chú ý trong bước này không nên votex). - Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút ở 200C, thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tương ứng. - Thêm 1 l RNAse vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi mới thu được, ủ 370C trong 1 giờ để khử hết RNA. 21 - Cho vào mỗi eppendorf 300 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. - Cho vào mỗi eppendorf 300 l chloroform/isoamylalcohol (24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. - Thêm vào mỗi eppendorf trên 300 l isopropanol, ủ -200C 30 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. hút bỏ dịch nổi thu kết tủa. - Rửa tủa trên bằng ethanol 70% 3 lần, úp ngược eppendorf trên giấy thấm để làm khô DNA. - Thêm 20 l TE 1X vào eppendorf để hòa tan kết tủa. - Hút 4 l chạy điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả ly trích 3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit DNA plasmid để sử dụng làm probe phải có độ tinh sạch cao nên tôi tiến hành ly trích DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid mini kit của Bio-Rad. Quy trình ly trích như sau: - Chuyển 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi thu sinh khối, lập lại bước này 3 lần. - Thêm 250 l dung dịch đệm hòa tan (resuspension solution), votex hoặc dùng pipet làm tan kết tủa trong dung dịch. - Thêm 250 l dung dịch ly trích (lysis solution), đảo ngược eppendorf 6-8 lần. - Thêm 350 l dung dịch trung hòa (neutralization solution) trong vòng 5 phút sau khi cho dung dịch ly trích, đảo ngược từ 6-8 lần (không votex). - Ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 5 phút, thu dịch nổi. - Trong khi ly tâm, tiến hành chèn cột vào ống do bộ kit cung cấp (capless wash). - Hút dịch nổi cho vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để DNA plasmid gắn vào màng, bỏ phần dịch bên dưới ống, lập lại bước này một lần nữa. 22 - Thêm 750 l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 1 phút, sau đó ly tâm tiếp một phút. - Loại bỏ dịch rửa chuyển cột chứa plasmid sang eppendorf 1,5 ml, thêm 50 l dung dịch elution vào màng, để 1 phút, ly tâm 1phút để tách plasmid ra khỏi màng, thu phần dung dịch chứa DNA plasmis. 3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid pMGY-SB bằng biotin Chúng tôi sử dụng plasmid pMGY-SB đã được ly trích ở trên, có chứa đoạn MAGGY có kích thước 0,56 kp để tạo probe. Trước khi thực hiện phản ứng đánh dấu cần phải pha loãng dung dịch cross - linker thành dung dịch có nồng độ sử dụng, dung dịch này có thể bảo quản lạnh 2–80C trong một tuần. Bên cạnh đó, DNA plasmid cũng cần phải được pha loãng với nước tới nồng độ 10 ng / µl dùng để đánh dấu (nồng độ muối trong mẫu DNA nên được giữ ở mức thấp nhất, không quá 50 mM). Thực hiện phản ứng đánh dấu theo kit của Amersham gồm các bước như sau: - Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl, biến tính hoàn toàn bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nước đang sôi mạnh. - Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000 vòng/30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống. - Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer vào DNA đã được làm lạnh, đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá. - Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent, trộn nhẹ, đều. - Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4000 vòng / 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy. - Ủ 30 phút ở 370C cho phản ứng xảy ra. - Probe có thể được dùng ngay, trong trường hợp muốn bảo quản lâu hơn, probe đã đánh dấu được giữ trong 50 %V glycerol ở - 150C đến – 300C trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo quản). 3.5.4. Tạo mẫu lai 3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn 23 Sử dụng genomic DNA của các nòi đã được ly trích ở trên, tôi đã thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn BamHI, EcoRV và HindIII để ở thể tích 25 µl và 50 µl như sau: Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl BamHI HindIII EcoRV Thể tích DNA 10X đệm BamHI Enzyme BamHI Nước DNA 10X đệm HindIII Enzyme EcoRV Nước DNA 10X đệm EcoRV Enzyme