Luận văn Chế tạo các hạt zns bằng phương pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm và ứng dụng trong cảm biến sinh học

ứng dụng, Viện Công nghệ Birla, Ấn Độ ~ 6 [43] 5 Thủy nhiệt kết hợp vi nhũ tƣơng Jun Liu và cộng sự, Viện Vật liệu xây dựng, Trung Quốc 5 – 10 [25] Bảng 1.1. Bảng một số phương pháp chế tạo vật liệu nano ZnS/ZnS pha tạp đã được áp dụng bởi các nhóm nghiên cứu khác. Nhƣ vậy, các nhóm nghiên cứu trƣớc đây đã chế tạo đƣợc hạt nano ZnS có 13 kích thƣớc tƣơng đối nhỏ từ 2,4 nm đến 30 nm. Tuy nhiên, với mong muốn ứng dụng đƣợc trong lĩnh vực y sinh, hạt nano đòi hỏi phải có kích thƣớc nhỏ, phát huỳnh quang mạnh và phân tán tốt trong dung dịch. Do đó, nhóm nhiên cứu chúng tôi đã có ý tƣởng kết hợp các phƣơng pháp chế tạo. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp đồng kết tủa là phƣơng pháp đơn giản, hạt nano chế tạo đƣợc có kích thƣớc tƣơng đối nhỏ (2,6 nm – 5,5 nm) [34, 3, 41], lƣợng mẫu thu đƣợc lớn. Và thay vì phải mất từ 12 h đến 24 h nhƣ trong phƣơng pháp thủy nhiệt thì thời gian chế tạo hạt bằng phƣơng pháp đồng kết tủa chỉ mất từ 2 – 3 h [34]. Thêm vào đó, sóng siêu âm đƣợc cho là tạo ra các dòng xoáy có tần số rất lớn, đồng thời hình thành các tâm thay đổi áp suất trong dung dịch, vì vậy ảnh hƣởng đến việc kết đám hoặc lớn lên của hạt, làm cho hạt có kích thƣớc nhỏ hơn. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành kết hợp phƣơng pháp đồng kết tủa và phƣơng pháp siêu âm để chế tạo vật liệu nano ZnS. Bên cạnh đó, tác động làm thay đổi kích thƣớc hạt của chất hoạt hóa bề mặt cũng đƣợc rất nhiều nhóm nghiên cứu trong và ngoài nƣớc sử dụng để chế tạo vật liệu nano (Bảng 1.2). STT Chất hoạt hóa bề mặt Nhóm nghiên cứu Vật liệu nano Kích thƣớc hạt nano (nm) Tài liệu tham khảo 1 TSC Lee Ji-Hwan và công sự Au 20 – 50 [20] Dhiraj Kumar và cộng sự Au 20 - 80 [12] Landage S.M. và cộng sự, Viện Kỹ thuật ứng dụng và Dệt may, Ấn Độ Ag 40 [19] 2 4-ATP Ayşem Üzer và cộng sự, Đại học Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ Au - [5] 14 Nan Xiao và Chenxu Yu, Đại học Iowa Au - [29] 3 PVP Lo, H., Y. Sylvia, Wang Yung-Yun và Wan Chi- Chao, trƣờng Đại học Quốc gia Tsing Hua, Đài Loan Cu/Pd 3 – 4 [26] 4 PVP Manoj Sharma và cộng sự, ĐH Sri Guru Granth Sahib World, Ấn Độ ZnO 20 [41] 5 CTAB Y. Liu và cộng sự, Đại học Công nghệ Amirkabir, Iran Silica 75 [45] 6 Accrylamide Nguyễn Trí Tuấn, Đại học Cần Thơ ZnS 2 – 3 [4] Bảng 1.2. Bảng một số chất hoạt hóa bề đã được các nhóm nghiên cứu khác sử dụng trong quá trình chế tạo vật liệu nano. Nhóm nghiên cứu của Landage S.M. và cộng sự, Viện Kỹ thuật ứng dụng và Dệt may, Ấn Độ, đã tiến hành sử dụng chất hoạt hóa TSC để chế tạo hạt nano Ag. Kích thƣớc hạt thu đƣợc trung bình khoảng 40 nm, khá đồng đều. Hình 1.7. Ảnh chụp TEM hạt nano Ag chế tạo bới Landage S.M. và cộng sự, Viện Kỹ thuật ứng dụng và Dệt may, Ấn Độ, sử dụng chất hoạt hóa bề mặt TSC. 15 Nhóm nghiên cứu của Ayşem Üzer và cộng sự [5] và Nan Xia, Chenxu Yu [29] đã sử dụng chất hoạt hóa bề mặt 4-ATP để chức năng hóa với nhóm chức amin làm cầu nối với các phân tử sinh học. Từ những kết quả nghiên cứu trên, có thể thấy ảnh hƣởng làm giảm kích thƣớc hạt nano của chất hoạt hóa bề mặt. Do đó, hai loại chất hoạt hóa bề mặt đƣợc sử dụng và khảo sát ảnh hƣởnglên tính chất của vật liệu, đó là: Chất hoạt hóa bề mặt trisodium citrate (TSC): TSC có khả năng tạo ra lớp điện tích âm trên bề mặt của hạt nano, làm các hạt đẩy nhau ra và do đó tác động tạo nên các hạt nano có kích thƣớc nhỏ [20, 12, 19]. Chất hoạt hóa bề mặt 4-aminothiophenol (4-ATP): 4-ATP đƣợc cho là có thể gắn trực tiếp trên bề mặt sulfide kim loại (MS – trong đó M là kim loại hóa trị 2) [5, 29]. Quá trình chế tạo và khảo sát đƣợc tiến hành bằng cách thay đổi các nồng độ chất hoạt hóa bề mặt giam gia tổng hợp ZnS. Nhƣ vậy, hạt nano ZnS sẽ đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm. Đồng thời ảnh hƣởng của các điều kiện chế tạo nhƣ nồng độ chất hoạt hóa bề mặt, công suất siêu âm lên tính chất vật lý của hạt sẽ đƣợc khảo sát. 1.3. Một số ứng dụng của hạt nano ZnS. 1.3.1. Ứng dụng trong laser và diode. ZnS có độ rộng cùng cấm tƣơng đối lớn (3,67 eV) do đó ZnS thƣờng đƣợc ứng dụng trong các diode laser [18] hoặc diode phát quang (LED) [44]. Rất nhiều loại photodiode đã đƣợc chế tạo trên cơ sở lớp chuyển tiếp p-n của ZnS, suất quang điện động của lớp chuyển tiếp p-n thƣờng đạt tới 2,5 V. Điều này còn cho phép hy vọng có những bƣớc phát triển mới trong công nghệ chế tạo thiết bị ghi đọc quang học laser nhƣ làm tăng mật độ ghi thông tin trên đĩa, tăng tốc độ làm việc của các máy in laser, đĩa compact, tạo khả năng sử dụng bảng 16 màu trộn từ 3 laser phát màu cơ bản. 1.3.2. Ứng dụng hạt nano ZnS làm vật liệu phát huỳnh quang Vật liệu nano ZnS là vật liệu nano bán dẫn có khả năng phát huỳnh quang ở vùng tử ngoại gần, khi đƣợc pha tạp với các ion kim loại nhƣ Cu2+, Mn2+... hay với các kim loại đất hiểm nhƣ Eu3+, Sm3+ chúng có thể phát huỳnh quang tại vùng khả kiến với cƣờng độ cao, do đó đƣợc ứng dụng làm các vật liệu phát huỳng nhƣ các tụ điện huỳnh quang, các màu Rơnghen, màu của các ồng phóng điện tử và dụng cụ bức xạ electron làm việc ở dải tần rộng, hay các vật liệu đánh dấu tế bào ung thƣ. Một số những ứng dụng đã đƣợc thực hiện trong việc phát hiện, đánh dấu tế bào ung thƣ có thể kế đến nhƣ: sử dụng hạt nano ZnS:Mn để phát hiện ADN của tế bào ung thƣ; sản xuất bộ Kit phát hiện nhanh ADN [27]. Với khả năng phát xạ ánh sáng khi đƣợc kích thích bởi các chùm tia X hoặc các chùm điện tử, vật liệu ZnS còn đƣợc sử dụng cho màn X-ray và các ống tia cathode. 1.3.3. Ứng dụng hạt nano ZnS làm vật liệu đánh dấu sinh học Cùng với sự phát triển của công nghệ nano, ngày nay, các nhà khoa học đã chế tạo đƣợc các vật liệu nano ZnS có kích thƣớc vô cùng nhỏ, chĩ cỡ khoảng vài nano. Với khả năng phát huỳnh quang mạnh các vật liệu này đƣợc dùng làm các tâm phát huỳnh quang (Gọi tắt là các Quantum Dot – QD) ứng dụng trong việc đánh dấu tế bào. Bên cạnh khả năng gắn kết với các gốc amin tự do (-NH2) – gốc amin có khả năng tƣơng thích sinh học, vật liệu nano ZnS đang đƣợc hƣớng đến để ứng dụng trong cảm biến sinh học nhằm phát hiện sự có mặt của ADN, các chuỗi nucleotide, enzyme, kháng nguyên, kháng thể. 17 Dưới đây là mô hình chung của một cảm biến sinh học Hình 1.8. Mô hình chung của cảm biến sinh học. Cảm biến sinh học đƣợc chia làm ba phần: phận nhận biết (recognition), phần chuyển đối tín hiệu (signal transduction) và xử lý tín hiệu (signal processing) (Hình 1.8). Trong phần nhận biết, cảm biến sinh học sử dụng các tƣơng tác đặc hiệu sinh học để tƣơng tác với đối tƣợng cần nhận biết. Tƣơng tác này thƣờng cho một loại tín hiệu sinh lý đặc trƣng (ví dụ: bắt cặp tín hiệu ADN-ADN, ADN-ARN, kháng nguyên – khánh thể, cơ chất- enzyme, chuỗi nucleotide – cơ chất). Các tín hiệu kiểu này thƣờng không dễ nhận biết một cách trực tiếp mà phải thông qua một hệ thống chuyển tín hiệu để chuyển thành các tín hiệu đọc đƣợc nhƣ tín hiệu quang, tín hiệu điện. Quá trình chuyển tiếp tín hiệu này rất đa dạng: có thể là các tín hiệu gắn với cơ chất sinh học (protein phát huỳnh quang gắn với cơ chất, bức xạ đặc hiệu gắn với cơ chất). Sau khi tín hiệu chuyển sang dạng đọc đƣợc, trong bƣớc cuối cùng, chúng xử lý, đánh giá và so sánh để đƣa ra những nhận định hay thông số vật lý của các đối tƣợng sinh học cần biết. 18 Trong luận văn này, chúng tôi chỉ tập trung giới thiệu về cảm biến sinh học dựa trên sự bắt cặp đặc hiệu ADN-ARN với tín hiệu điện ở đầu ra, còn gọi là cảm biến điện hóa ADN, để xác định hàm lƣợng ADN của virus. Cảm biến điện hóa ADN Cảm biến điện hóa ADN dựa trên sự bắt cặp đặc hiệu ADN-ADN, ADN - ARN để nhận biết các chuỗi gen của các vi khuẩn, virus gây bệnh. Hình 1.9 đƣa ra mô hình cảm biến điện hóa ADN đƣợc sử dụng trong đề tài này. Nhận biết đặc hiệu là quá trình bắt cặp của hai chuỗi nucleotide (lần lƣợt đƣợc gọi là detector probe và catcher probe ) với chuỗi ADN cần nhận biết (target ADN hay detected ADN). Một đầu chuỗi detector probe đƣợc gắn với các hạt nano kim loại hoặc bán dẫn – cũng là các hạt giúp tạo tín hiệu đọc đƣợc (signal agent). Chuỗi catcher probe gắn với điện cực. Hệ thống vi cảm biến chất lỏng đặt trong kênh dẫn sẽ cảm nhận đƣợc sự có mặt của các đối tƣợng cần nhận biết. Lối ra cảm biến đƣợc đƣa vào một bộ tiền khuếch đại và một bộ khuếch đại đi kèm với các mạch lọc trƣớc khi đi vào máy tính. Hình 1.9. Mô tả cấu trúc của cảm biến sinh học sử dụng liên kết đặc hiệu AND – ARN/ ADN để nhận biết ADN nói chung. (Phần nhận biết là quá trình bắt cặp kép của detector probe và catcher probe (hai chuỗi nucleotide đặc hiệu) với chuỗi ADN của đối tƣợng tạo thành hệ thức sandwich. Trong quá trình chuyển hóa tín hiệu, các thông số điện nhƣ độ dẫn, dòng ĐIỆN CỰC VÀNG Pha bắt cặp Pha nhận biết Pha tín hiệu Tín hiệu điện hóa Các phân tử chức năng hóa bề mặt 19 điện của hệ sandwich chuyển tiếp đến hệ đo qua điện cực và cho thông tin về thông số của nồng độ ADN có trong dung dịch.) Nhận định về khả năng ứng dụng của vật liệu ZnS vào cảm biến điện hóa ADN: Hạt nano ZnS khi đƣợc chức năng hóa với các nhóm amin tự do có khả năng liên kết với các phân tử sinh học nhƣ ADN, ARN, kháng nguyên, kháng thể[5, 29]. Và cơ sở từ những nghiên cứu trƣớc đây nhƣ: ứng dụng hạt nano ZnO để nghiên cứu nồng độ glucose, nồng độ ADN trong đó, tín hiệu đo đạc là tín hiệu điện có đƣợc do quá trình oxy hóa khử của ion Zn2+. Do vậy, chúng tôi nhận thấy vật liệu nano ZnS hoàn toàn có thể ứng dụng đƣợc trong cảm biến điện hóa ADN để đo đạc nồng độ ADN. Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi mong muốn có thể sử dụng các hạt nano ZnS đã chức năng hóa liên kết với các phân tử ARN – phân tử ARN có khả năng liên kết đặc hiệu với ADN của virus Epstein-Barr (EBV), từ đó ứng dụng vào cảm biến điện hóa ADN nhằm phát hiện sự có mặt của virus EBV. 1.4. Mục tiêu của luận văn Mục tiêu của luận văn là chế tạo đƣợc vật liệu nano ZnS với kích thƣớc rất nhỏ, có khả năng phát huỳnh quang tốt và phân tán tốt trong dung dịch. Song song với đó, khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện chế tạo lên tính chất vật lý của hạt nhƣ: công suất còi siêu âm, nồng độ chất hoạt hóa bề mặt – những yếu tố tác động để kiểm soát kích thƣớc hạt. Đồng thời, luận văn đề xuất mô hình đánh giá khả năng ứng dụng của vật liệu nano ZnS để khảo sát nồng độ ADN. Để đạt đƣợc mục tiêu trên, nhóm nghiên cứu đã tiến hành chế tạo hạt nano ZnS bằng cách kết hợp phƣơng pháp đồng kết tủa và phƣơng pháp siêu âm. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất hoạt hóa bề mặt và công suất còi siêu âm đến tính chất vật lý của hạt nano. Chất hoạt hóa bề mặt đƣợc sử dụng ở đây là trisodium citrate và 4-aminothiophenol. 20 Với mục tiêu ứng dụng hạt nano trong cảm biến sinh học, nhóm nghiên cứu tiến hành chế tạo hạt nano ZnS chức năng hóa thành công với nhóm chức amin (- NH2); khảo sát khả năng ứng dụng của vật liệu bằng cách liên kết với các phân tử ARN. Sau đó, sử dụng hệ các hạt nano đã chức năng hóa liên kết ARN này vào cảm biến ADN để khảo sát sự có mặt ADN của virus EBV. 21 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHÉP ĐO KHẢO SÁT 2.1. Chế tạo hạt nano ZnS bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm. 2.1.1. Dụng cụ và hóa chất Hệ thí nghiệm bao gồm: Còi siêu âm; khí Ar, bình cầu 3 cổ và các tiền chất: kẽm acetate (Zn(Ac)2), Natri sulfide (Na2S), trisodium citrate (TSC), NaOH và 4- Aminothiophenol (4-ATP). Các hóa chất sử dụng trong quá trình thí nghiệm pha với nồng độ đƣợc thể hiện trong Bảng 2.1. STT Dung dịch hóa chất Nồng độ 1 Zn(Ac)2 0,25 M 2 TSC 2,50 M 3 4-ATP 2×10-3 M 4 Na2S 0,25 M 5 NaOH – 1 0,50 M 6 NaOH – 2 0,10 M Bảng 2.1. Bảng các nồng độ gốc của các hóa chất sử dụng trong quá trình thí nghiệm chế tạo các hạt nano ZnS bằng phương pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm. 2.1.2. Quy trình chế tạo Các hạt nano ZnS đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp hóa ƣớt. Trong dung dịch, các tinh thể ZnS đƣợc hình thành nhờ sự kết hợp của các ion dƣơng Zn2+ và ion âm S 2- . Phƣơng trình phản ứng tạo các hạt ZnS trong dung dịch đƣợc mô tả nhƣ sau: Zn(CH3COO)2 + Na2S  ZnS↓ + 2 CH3COONa 22 Hình 2.1. Sơ đồ và hình mô phỏng thí nghiệm chế tạo các hạt nano ZnS bằng phương pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm. Sơ đồ thí nghiệm đƣợc mô tả nhƣ trong Hình 2.1 và đƣợc tiến hành cụ thể theo 2 bƣớc là pha dung dịch chứa các ion Zn2+ trong môi trƣờng có chất hoạt hóa bề mặt và dùng Na2S để cung cấp ion S 2- , đồng thời tiến hành siêu âm. Trong đó, dung dịch chứa ion Zn2+ và chất hoạt hóa bề mặt chứa trong bình cầu 3 cổ, cổ (1) đƣợc sử dụng để nhỏ giọt ion S2- và đƣờng dẫn vào khí Ar, cổ (2) dùng để đƣa còi siêu âm vào dung dịch chứa ion Zn2+ và chất hoạt hóa bề mặt, cổ (3) là đƣờng khí ra. Quy trình chế tạo đƣợc mô tả chi tiết khi khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất hoạt hóa bề mặt TSC. a. Chế tạo hạt nano ZnS bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm và khảo sát ảnh hƣởng chất hoạt hóa bề mặt.  Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nồng độ TSC Sơ đồ 2.1 mô tả quy trình chế tạo hạt nano ZnS bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm với các nồng độ TSC khác nhau. Nhỏ từ từ Còi siêu âm DD chứa ion S 2- DD chứa ion Zn2+ và chất hoạt hóa bề mặt Bƣớc 1 Bƣớc 2 (2) (1) (3) (2) Dung dịch chứa ion Zn2+ và chất hoạt hóa bề mặt 23 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chế tạo hạt nano ZnS bằng phương pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm với các nồng độ TSC khác nhau Các bƣớc chế tạo hạt nano đƣợc thực hiện chi tiết nhƣ sau: Cho 4 ml dd ZnCl2 0,25 M và dd TSC 2,5 M vào bình cầu 3 cổ, bổ sung thêm 96 ml nƣớc cất để đƣợc 100 ml dung dịch A và độ pH đạt tới 9 (± 0,2). Ở đây, các dung dịch NaOH nồng độ 0,50 M và 0,10 M đƣợc sử dụng để điều chỉnh pH dung dịch. 50 ml dd Na2S (dd B) 0,02 M đƣợc cho vào buret (250 ml) và nhỏ từ từ vào 100 ml dung dịch A. Trong suốt quá trình này, còi siêu công suất ~190W đƣợc áp dụng liên tục. Sau khi dung dịch Na2S đƣợc nhỏ hết, hệ siêu âm vẫn tiếp tục đƣợc bật trong vòng 10 phút. Mẫu vật liệu thu đƣợc có màu trắng nhờ. Để bảm bảo độ lặp lại của mẫu, trƣớc khi nhỏ dd B vào dd A, buret đƣợc điều chỉnh sao cho tốc độ nhỏ giọt là 0,03 ml/s. Nƣớc cất trƣớc khi sử dụng đƣợc thổi bằng khí Ar để đảm bảo không còn khí oxy. Bên cạnh đó, trong suốt quá trình phản ứng, dung dịch đƣợc dùy trì tại 0oC và thổi khí Ar liên tục. Các mẫu ZnS chế tạo với nồng độ chất hoạt hóa bề mặt TSC lần lƣợt nhƣ trong Bảng 2.2. 24 Dung dịch hóa chất Thể tích (ml) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 TSC 2,5M 1 2 4 6 10 20 Bảng 2.2. Thể tích dd TSC thêm vào trong quá trình chế tạo hạt nano ZnS Các mẫu chứa hạt nano ZnS sau khi chế tạo đƣợc lọc rửa 9 lần bằng cồn 50% và khảo sát các phép đo: khảo sát hình thái, cấu trúc và kích thƣớc hạt bằng phổ nhiễu xạ tia X và chụp ảnh TEM, đồng thời khảo sát các tính chất quang bằng phổ hấp thụ UV-Vis và phổ huỳnh quang.  Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nồng độ 4-ATP Các bƣớc chế tạo mẫu ZnS khảo sát với chất hoạt hóa bề mặt 4-ATP đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ chất hoạt hóa bề mặt TSC. Các mẫu ZnS chế tạo với nồng độ 4-ATP thêm vào mô tả nhƣ trong Bảng 2.3. Dung dịch hóa chất Thể tích (ml) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 4-ATP 2.10 -3 M 1 2 4 6 10 20 Bảng 2.3. Thể tích dd 4-ATP thêm vào trong quá trình chế tạo hạt nano ZnS Các mẫu chứa hạt nano ZnS sau khi chế tạo đƣợc lọc rửa 9 lần bằng cồn 50% và khảo sát các phép đo: khảo sát các tính chất quang bằng phổ hấp thụ UV-Vis và khảo sát khả năng chức năng hóa của vật liệu với nhóm amin (-NH2) bằng phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR. b. Chế tạo hạt nano ZnS bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm và khảo sát ảnh hƣởng của công suất còi siêu âm. Chúng tôi đã tiến hành thay đổi công suất còi siêu âm đối với loạt mẫu sử dụng 10 mL TSC để nghiên cứu sự ảnh hƣởng của tác nhân vật lý này đến tính chất của vật liệu. Bảng 2.4 mô tả chi tiết công suất siêu âm đƣợc áp dụng trong quá trình khảo sát. 25 STT Dung dịch hóa chất Công suất còi siêu âm Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 1 TSC 2.5M 10ml 150W 190W 225W 270W 300W Bảng 2.4. Các công suất siêu âm sử dụng để chế tạo ZnS với các mẫu pha tạp 10 mL chất hoạt hóa bề mặt TSC. Các mẫu chứa hạt nano ZnS sau khi chế tạo đƣợc lọc rửa 9 lần bằng cồn 50% và khảo sát các phép đo: Khảo sát các tính chất quang bằng phổ hấp thụ UV- Vis; Khảo sát cấu trúc và kích thƣớc hạt bằng phổ nhiễu xạ tia X. 2.2. Mô hình đánh giá khả năng ứng dụng các hạt ZnS trong cảm biến điện hóa xác định nồng độ ADN trong dung dịch 2.2.1. Hóa chất sử dụng Hóa chất sử dụng bao gồm: MIA (methyl immidazole), EDC (1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide), Natri Hydrogen phosphate (Na2HPO4), Kali dihydrogen phosphate (KH2PO4), natri clorua (NaCl), Kali clorua (KCl), Natri Hydroxit (NaOH), Axit sunphuric (H2SO4), ethanol (C2H5OH). Hai loại ARN: ARN1 để các nhóm phosphate tự do ở vị trí 3’ sau các Adenine (5'-TCTTGTGTCCAGGCATCCCTAAAAAAAAAA-3’-Phosphate) và ARN2 (Phosphate-5'- AAAAAAAAAAGCCTCGGTTGTGACAGAG-3’) có các nhóm phosphate tự do ở vị trí 5’ đƣợc đặt hàng thiết kế bởi PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh (khoa Sinh học – Đại học Khoa học tự nhiên) với 10 Adenine lặp lại). ARN1, ARN2 là hai phân tử ARN có khả năng liên kết đặc hiệu với ADN vủa virus EBV. EDC, MIA đặt hàng từ BioBasic, lƣu trữ trong tủ 4oC. Dung môi nƣớc sử dụng là nƣớc cất 2 lần đƣợc khử trùng. Dung môi PBS đƣợc pha theo công thức 1X thể hiện trong Bảng 2.5. 26 Muối Nồng độ (mmol/L) Nồng độ (g/L) NaCl 137,00 8,00 KCl 2,70 0,20 Na2HPO4 10,00 1,42 KH2PO4 1,80 0,24 Bảng 2.5. Nồng độ các hóa chất sử dụng để pha dung môi PBS 1X. Natri Hydrogen phosphate (Na2HPO4), Kali dihydrogen phosphate (KH2PO4), natri cloride (NaCl), Kali cloride (KCl), Natri Hydroxit (NaOH), Axit sulfuric (H2SO4), ethanol (C2H5OH) đƣợc sử dụng với độ tinh sạch tin cậy. 2.2.1. Quy trình khảo sát khả năng gắn kết của vật liệu với các phân tử ARN Trong quá trình khảo sát chế tạo hạt nao ZnS sử dụng chất hoạt hóa bề mặt 4-ATP, nhóm nghiên cứu chúng tôi nhận ra rằng, ZnS đã đƣợc chức năng hóa với nhóm chức amin ngay trong quá trình chế tạo. Cơ chế hình thành hạt ZnS-4ATP diễn ra nhƣ sau: Để có thể ứng dụng trong cảm biến ADN, nhóm nghiên cứu đã tiến hành gắn kết các hạt nano ZnS-4ATP với các phân tử ARN2 bằng phản ứng liên kết cộng hóa trị thông qua hỗ trợ xúc tác của MIA (methyl immidazole) và EDC (1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide). Quá trình thực hiện đƣợc tiến hành cụ thể nhƣ sau: 2 mg EDC đƣợc cho vào 1 ml MIA trong ống ependorf và lắc đều cho đến khi tan hết; 1 mL ARN2 nồng độ 25 μM đƣợc hòa tan vào trong 5 mL dung dịch PBS pH 7.0 (chứa trong một ống nghiệm nhỏ có thể tích 20 mL). Sau đó 0,5 mL dung dịch ZnS-4ATP đƣợc nhỏ vào trong ống nghiệm, lắc đều. Cuối cùng 1 mL hỗn hợp EDC, MIA đƣợc đổ vào ống Tinh thể Tinh thể 6 27 nghiệm lắc đều nhẹ tay và để qua đêm cho phản ứng hoàn toàn xảy ra. Sau đó dung dịch đƣợc lọc rửa lại bằng quay li tâm, mỗi lần rửa đều sử dụng chế độ 2000 rpm trong vòng 30 phút. Lƣu ý, tất cả dung môi sử dụng để quay li tâm đều là PBS 1X đƣợc pha bằng nƣớc cất 2 lần khử trùng. Cuối cùng dd chứa hệ hạt ZnS-4ATP-ARN đƣợc pha ra 10 mL dung dịch và lƣu trong tủ 4oC. Mỗi lần sử dụng đều đƣợc hút 0,5 mL bằng đầu côn khử trùng. Các mẫu chứa hệ hạt ZnS-4ATP-ARN2 đƣợc tiến hành đo phổ tán xạ Raman để khẳng định sự liên kết của hạt Zn-4ATP với ARN2. 2.2.2. Khảo sát khả năng ứng dụng của vật liệu nano ZnS vào cảm biến điện hóa để xác định nồng độ ADN của virus EBV Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của cảm biến ADN sử dụng hạt nano ZnS- 4ATP để phát hiện sự có mặt ADN của virus. Hình 2.2 mô tả nguyên lý hoạt động của cảm biển, cảm biến ADN sử dụng hai loại ARN khác nhau có khả năng bắt cặp đặc hiệu với ADN của virus Estenbar (EBV). Khi có xự xuất hiện của ADN đích (ADN của virus EBV), chuỗi ARN1 gắn với điện cực vàng và chuỗi ARN2 gắn với hạt nano ZnS sẽ bắt cặp với chuỗi ADN đích tạo thành hệ sandwich “điện cực - 4ATP – ARN1 – ADN đích – ARN2 – 4ATP – ZnS” (Sau đây gọi là hệ “điện cực – ADN – ZnS”). Khi nồng độ ADN thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi về số lƣợng bắt cặp của hệ “điện cực – ADN – ZnS”. Áp dụng phƣơng pháp đo điện thế quét vòng trên bề mặt điện cực có thể xác định đƣợc nồng độ ADN của virus EBV có trong dung dịch. Điện cực sử dụng là điện cực vàng đƣợc thiết kế nhƣ sau: ARN1 ARN2 28 Hình 2.3. Thiết kế của điện cực vàng sử dụng trong cảm biến ADN Mỗi lần sử dụng, bề mặt điện cực đƣợc mài bằng giấy nhám 8000 (8000 hạt/mm2). Sau đó điện cực đƣợc rửa siêu âm trong nƣớc cất 2 lần trong 30 phút, rồi tiếp tục lần lƣợt siêu âm trong H2SO4 0,5 M và NaOH 0,1 M. Cuối cùng nƣớc cất 2 lần đƣợc sử dụng để loại bỏ các hóa chất còn dƣ [45]. Để chức năng hóa, điện cực đƣợc ngâm trong 10 mL dung dịch 4-ATP 0,1M (4-ATP đƣợc pha bằng ethanol), thời gian 12h. Khi này, các phân tử 4-ATP sẽ liên kết với bề mặt điện cực thông qua liên kết Au-S bền vững [23]; đầu còn lại là các nhóm –NH2 tự do. Lƣu ý, là từ sau bƣớc chức năng hóa với 4-ATP điện cực đều đƣợc ngâm rửa với dung dịch đệm PBS 1X đã đƣợc khử trùng, đảm bảo không lẫn các tạp phân tử sinh học lạ. Để khảo sát nồng độ ADN thông qua điện thế quét vòng, ADN đích có trong dung dịch đã đƣợc đun sôi trong 5 phút sau đó nhanh chóng đƣa vào trong nƣớc đá để giải phóng các chủng ADN nhƣng vẫn còn ở dạng mạch đơn. Nồng độ ADN đích khác nhau (Bảng 2.6) đƣợc thêm vào trong dung dịch đệm PBS có chứa ZnS-4ATP-ARN2, điện cực gắn với ARN1 cũng đƣợc đƣa vào cùng lúc. Hệ mẫu đƣợc để phản ứng trong 10 phút sau đó điện cực sẽ đƣợc rửa sạch 3 lần bằng PBS. Mẫu a b c d e Nồng độ AND đích (coppies/ml) 0,5 × 105 1,0 × 105 1,5 × 105 2,0 × 105 1,5 ×105 Bảng 2.6. Nồng độ ADN đích nhỏ vào điện cực trong quá trình khảo sát Điện cực sau đó đƣợc khảo sát bằng phƣơng pháp đo điện thế quét vòng trong khoảng [- 0,2 V, 0,6 V]. Dây Cu Trụ vàng Au 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chế tạo hạt nano ZnS bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm và khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện chế tạo. 3.1.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ TSC Các mẫu chứa hạt nano ZnS sau khi lọc rửa sạch, đƣợc khảo sát hình thái, cấu trúc bằng phổ nhiễu xạ tia X và chụp ảnh TEM và khảo sát các tính chất quang bằng phổ hấp thụ UV-Vis, phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR và phổ quang phát quang. a. Phân tích phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến UV-Vis. Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-Vis của các mấu chứa hạt nano ZnS chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm với các lượng TSC pha tạp khác nhau và tính toán năng lượng vùng cấm. Hình 3.1 mô tả phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến và tính toán năng lƣợng vùng cấm của mẫu hạt nano ZnS đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp đồng kết tủa kết hợp siêu âm với các nồng độ TSC pha tạp khác nhau. Phổ hấp thụ là phổ hấp thụ ánh sáng điển hình của ZnS - hấp thụ yếu ở vùng khả kiến và vùng hồng ngoại gần, hấp thụ mạnh ở vùng UV, điều này phù hợp với kết quả trƣớc đó đƣợc công bố [6, 7]. Đ ộ h ấp t h ụ ( A b s) Bƣớc sóng (nm) 30 Mối quan hệ giữa hệ số hấp thụ α và năng lƣợng photon hν đƣợc thể hiện trong các công thức sau: 2 1 )( EghAh   Trong đó A là hằng số và Eg là độ rộng vùng cấm của vật liệu, hν năng lƣợng photon, α là hệ số hấp thụ [43]. Dựa vào công thức trên, Hình 3.1 bên phải biểu diễn đồ thị sự phụ thuộc của (αhν)2 vào hν và năng lƣợng vùng cấm đƣợc xác định bằng bởi giao điểm các đƣờng fit với trục hoành nhƣ thể hiện trên hình. Kết quả là: độ rộng vùng cấm của vật liệu có xu hƣớng giảm từ 3,79 eV xuống còn 3,6 eV khi lƣợng TSC pha tạp tăng từ 1 ml đến 20 ml (Hình 3.2). Hình 3.2. Sự phụ thuộc của năng lượng vùng cầm vào lượng TSC thêm vào trong quá trình chế tạo vật liệu nano ZnS. Nhƣ vậy, Eg của vật liệu chế tạo đƣợc có xu hƣớng giảm xuống thấp hơn so với độ rộng vùng cấm của vật liệu khối ZnS là 3,67 eV. Điều này có thể giải thích do: các gốc tự do COOH và COH của phân tử TSC đã liên kết trực tiếp trên bề mặt tinh thể ZnS và sự tƣơng tác giữa bề mặt vô cơ với các phân tử hữu cơ đã làm ảnh hƣởng đến năng lƣợng vùng cấm của vật liệu. Để có thể khẳng định giả thuyết trên, nhóm nghiên cứu đã tiến hành đo phổ Thể tích TSC (ml) E g ( eV ) 31 hấp thụ hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR đối với hai loạt mẫu có TSC và không có TSC đƣợc mô tả nhƣ trong Hình 3.3. Hình 3.3. Phổ FTIR của mẫu chứa hạt nano ZnS khi không có TSC và khi có 4 ml TSC Từ phổ FTIR có thể nhận thấy, khi có 4 ml TSC, có sự xuất hiện thêm các đỉnh phổ ở vị trí 558 cm-1, 1293 cm-1, 1394 cm-1, 1580 cm-1 đặc trƣng cho dao động của nhóm COOH và đỉnh phổ ở vị trí 1117 cm-1 đặc trƣng cho dao động củ