Luận văn Chế tạo và khảo sát các thông số động học của các hạt nano vàng trong môi trường phức hợp

và ba chiều (xem các đánh giá gần đây [13]). Vào năm 1930, kính hiển vi huỳnh quang đã có một bước đột phá mới, khi các phân tử đơn lẻ có thể được phát hiện ở nhiệt độ phòng bằng tín hiệu huỳnh quang [14]. Ngay sau đó, SPT đã được thực hiện bằng cách thay thế các hạt đơn lẻ bằng các phân tử huỳnh quang đơn hoặc protein huỳnh quang [15, 16, 17]. Kể từ đó lĩnh vực này đã cho thấy một sự bùng Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 12 nổ về việc triển khai quang khác nhau, các thuật toán để xây dựng lại quỹ đạo và phân tích dữ liệu, mô hình vật lý, và quan trọng, nó đã dẫn đến những khám phá mới trong sinh học. Điều thú vị là, sự phát triển vượt trội của SPT đã không chỉ cho ta những hiểu biết sâu về sinh học mà còn tạo ra một công cụ đơn phân tử tinh tế để khám phá sự phức tạp của hệ thống sống từ góc độ vật lý. Đặc biệt, hai phát hiện chính từ các thí nghiệm SPT đã tạo nên sự quan tâm của các nhà lý thuyết và các thống kê vật lý. Để hiểu hơn về các thuật toán phân tích dữ liệu cần giải thích quỹ đạo từ hình ảnh SPT. Các thuật toán này được tách thành hai khối chính:  Phần đầu tiên của thuật toán là tập trung vào xác định các vị trí tâm của các hạt sử dụng cho SPT và các liên kết của các tọa độ để tạo ra quỹ đạo mà mô tả sự chuyển động của các hạt.  Phần thứ hai của thuật toán là tập trung vào việc tái liên kết các hạt, giải thích và phân tích những quỹ đạo để xác định các thông số như kiểu khuếch tán, hệ số khuếch tán, vận tốc, quãng đường dịch chuyển trung bình, v.v. Cuối cùng, tập trung vào các mô hình lý thuyết hiện đang được phát triển để giải thích phép đo SPT. Trong hình 1.3 cho thấy một loạt các hình ảnh được thực hiện ghi lại, có chứa một số lượng ít các phân tử có gắn nhãn (đốm đỏ). Phim chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn hình ảnh ghi lại bằng camera nhanh. Trong bước xác định vị trí, hình ảnh huỳnh quang tại một thời điểm nhất định được phân tích để lấy lại vị trí của các hạt. Độ chính xác vị trí cuối cùng phụ thuộc vào nửa độ bán rộng tối đa (FWHM) của hàm điểm lan tỏa (PSF), số lượng photon thu thập từ nguồn phát xạ và các nguồn nhiễu khác nhau từ thực nghiệm. Sau khi lặp đi lặp lại bước xác định vị trí trên một chuỗi thời gian của rất nhiều hình ảnh, các vị trí được liên kết lại để tạo ra quỹ đạo theo dõi sự chuyển động của các hạt (đường nét đứt mầu trắng được liên kết lại như là một hàm của thời gian ở hình 1.3). Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 13 Hình 1.3 Sơ đồ minh họa của SPT 1.3.2.Thiết lập hệ quang học cho SPT trong không gian 2 chiều (2D) và 3 chiều (3D) Không gian hay sử dụng nhất SPT thực hiện quang học cho hình ảnh 2D dựa trên vùng sáng rộng và phát hiện một vết loang thấp, máy ảnh có độ nhạy cao. Cấu hình này cho phép phát hiện nhanh các tín hiệu để thu thập dữ liệu và theo dõi các phân tử chuyển động. Ngày nay hầu hết các nghiên cứu sử dụng SPT dựa trên tín hiệu huỳnh quang.Thông thường, các phân tử được kích thích sử dụng một chùm tia laser tập trung vào các mặt phẳng tiêu cự, các vật kính tạo ra một chùm tia song song kích thích một vùng của mẫu trong suốt toàn bộ chiều sâu của nó. Huỳnh quang phát ra được chọn lọc từ ánh sáng kích thích và phát hiện bằng cách sử dụng máy ảnh. Việc phát hiện và theo dõi các tín hiệu phát ra riêng biệt đòi hỏi đến tỷ lệ tín hiệu cao, mà phụ thuộc vào cách sử dụng tính chất ảnh vật lý của quá trình phân tích. Thông thường, với khẩu độ số NA> 1.2 được sử dụng để thu thập số lượng lớn nhất có thể của các photon phát ra. Hơn nữa, các bộ lọc huỳnh quang có độ sắc nét với độ truyền cao (> 80%) và máy ảnh phát hiện với năng suất lượng tử cao. Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 14 Hình 1.4 Sơ đồ quang học khác nhau cho SPT trong 2D và 3D Trong Hình 1.4 (a) dùng laser kích thích mẫu ở chế độ epi hoặc phản xạ nội toàn phần (TIRF). Ánh sáng phát xạ được tách ra từ ánh sáng kích thích sử dụng bộ lọc phù hợp và để phát hiện ta sử dụng một máy ảnh CCD... (b) Cách chiếu sáng khác nhau, bao gồm cả epi, TIRF và (highly inclined and laminated optical) HILO. Trong các cấu hình này, các chùm tia laser được hội tụ tại mặt phẳng tiêu cự của vật kính. Tùy thuộc vào độ nghiêng của các chùm tia laser đối với trục của vật kính mà độ sâu chiếu sáng đạt được khác nhau. (c) nguyên tắc theo dõi quỹ đạo của các hạt trong 3D sử dụng kính hiển vi hai photon. Tia laser được quét trong vòng tròn xung quanh hạt quan tâm (hình elip màu xanh). Trong ví dụ này, hai quỹ đạo vào vị trí z khác nhau và hai hạt khác nhau (màu xanh lá cây và màu đỏ) được hiển thị. Các cường độ huỳnh quang được tích hợp tại điểm nhất định của những quỹ đạo như di chuyển laze xung quanh hạt. Cường độ có liên quan đến vị trí thực tế của hạt đối với các quỹ đạo và được sử dụng để theo dõi vị trí của hạt trong 3D. (d) kỹ thuật PSF tiếp cận phá vỡ đối xứng trục của PSF để mã hóa thông tin 3D trong hình dạng PSF. 1.3.3. Phân tích dữ liệu Các kết quả chung của một thí nghiệm SPT gồm một chuỗi hình ảnh nhiễu xạ được giới hạn bởi thời gian của các hạt thu được thông qua các kỹ thuật kính hiển vi nói trên. Một bước quan trọng để đánh giá định lượng về động học là phát hiện hạt với độ phân giải nhiễu xạ của từng vị trí hạt và kết nối chúng lại để xây dựng lại quỹ đạo hạt duy nhất (Hình 1.5). Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 15 Toàn bộ quá trình này, thường được gọi là kỹ thuật “theo dõi hạt duy nhất” [13], kỹ thuật này lần đầu tiên được thực hiện bằng một thiết bị điện tử. Bên cạnh đó kỹ thuật đó tốn thời gian và không có độ phân dải cao nên rất chậm, nhu cầu về dữ liệu thông lượng cao đòi hỏi một số lượng cao mật độ của các hạt, do đó một số thuật toán máy tính tiên tiến đã được phát triển để đạt được độ chính xác về vị trí (xem xét trong [19], [20]). Các phân tích gồm 2 bước chính: (1). Các thuật toán cho việc xác định vị trí các hạt Các dữ liệu ban đầu của thí nghiệm SPT thường bao gồm một trình tự thời gian của các hình ảnh giới hạn nhiễu xạ của các hạt phát quang. Trong mỗi khung hình của một chuỗi, hạt xuất hiện những đốm sáng trên nền tối. Chiều rộng PSF tỷ lệ thuận với các bước sóng phát xạ quang và khẩu độ số của thấu kính chụp ảnh, xác định độ phân giải không gian của các kính hiển vi, trong khi cường độ PSF là tỷ lệ thuận với số lượng của các photon thu được. Nhiệm vụ đầu tiên là ước tính các tọa độ trọng tâm trong những điểm phát quang, do đó vị trí các hạt từ hình ảnh được xác định với độ chính xác cao (pixel) (Hình 1.5 (a) - (d)). Xác định vị trí của một hạt từ hình ảnh khá phức tạp. Hình 1.5 Ước lượng vị trí hạt và tính toán chính xác vị trí Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 16 Hình 1.5 (a), (b) Mô phỏng hình ảnh giới hạn nhiễu xạ của một đốm sáng huỳnh quang đẳng hướng, bao gồm hiệu ứng của nhiễu Poisson và đầu thu pixelation (a), và tương ứng histogram đếm photon (b). Biểu tượng màu đỏ trong (a) đại diện cho vị trí thực phát xạ (c), (d) Kết quả bình phương trọng số nhỏ nhất làm khớp với dữ liệu trong (a), (b) bằng khớp hàm Gaussian 2D. Các vị trí trọng tâm ước tính được thể hiện như một dấu chấm màu xanh trong (c). (e), (f) ước tính vị trí từ hình ảnh khác nhau của cùng một phát xạ (chấm màu xanh). Các vết cắt màu xanh lá cây tương ứng với trung bình của vị trí riêng biệt, trong khi các vòng tròn màu xanh lá cây biểu thị độ lệch chuẩn của chúng, tương ứng với độ chính xác vị trí. Sự khác biệt giữa vị trí trung bình (vết cắt màu xanh lá cây) và vị trí hạt thực tế (biểu tượng màu đỏ) cho vị trí chính xác. Các phân phối xác suất của vị trí riêng lẻ điểm (f) được biểu diễn trên cùng một thang đo như (b) và (d). (2). Các thuật toán cho liên kết hạt Khi các tọa độ của hạt được tìm thấy, một thuật toán liên kết là cần thiết để kết nối các vị trí của hạt từ frame này đến frame kế tiếp để xây dựng các quỹ đạo (Hình 1.6). Hình 1.6 Liên kết các vị trí và xây dựng quỹ đạo các hạt (a) ước tính về vị trí của một hạt khuếch tán (chấm xanh) .Các vị trí hạt thực được thể hiện như những dấu cộng màu đỏ. Các vòng tròn màu xám bóng mờ tương ứng với độ chính xác của vị trí. (b) các hình ảnh đại diện của một bộ phim SPT trong đó có vài hạt huỳnh quang và mô tả sơ đồ của các nguyên tắc của thuật toán liên kết vị trí. Trong khi các vị trí là tương đối thưa thớt có thể dễ dàng kết nối lại (hình chóp màu xanh ngọc), phải dự tính các thuật toán khả năng để tính toán với sự xuất hiện hạt là không Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 17 rõ ràng phát sinh từ các vị trí gần nhau (tế bào hình nón màu vàng / cam), các hạt nhấp nháy khi xuất hiện sẽ bị biến mất (nón màu xám) và dẫn đến không xác định được vị trí (đường màu xám). Trong trường hợp đơn giản của mật độ phát quang thấp, cách xác định vị trí có thể được thực hiện tự động bằng cách định vị các điểm có cường độ với khoảng cách gần nhất (Hình 1.6 (a)). Đối với mỗi hạt được định vị trong một frame nhất định, khoảng cách với tất cả các vị trí thu được trong khung tiếp theo được tính toán tương ứng. Sự xác định vị trí cho thấy khoảng cách tối thiểu được chọn là sự xuất hiện nhiều khả năng của hạt giống trong khung hình kế tiếp và được liên kết với nhau. Lặp lại quy trình này trên tất cả các hạt và tất cả các khung hình cuối cùng cung cấp cho ta các quỹ đạo được xây dựng lại. Tuy nhiên, điều kiện thí nghiệm thường xuyên cản trở thiết lập này từ sự phân tích đáng tin cậy (Hình 1.6 (b)). Một thách thức đầu tiên được đặt ra bởi những khả năng mà các hạt bị biến mất hoặc tạm thời biến mất do nhấp nháy. Các tiêu chí để ngăn chặn sự tái tạo quỹ đạo khi không có vị trí chính xác được tìm thấy trong một khoảng cách nhất định. Đối với lý do tương tự, một hạt có thể (lại) xuất hiện ở bất kỳ khung được trong quá trình ghi. Do đó, quá trình liên kết phải đối phó với những hiện tượng này và có khả năng khoảng cách đóng lại do nguồn gốc từ hạt nhấp nháy và / hoặc xác định lỗi vị trí. Ở mật độ cao, độ phức tạp tăng thêm nữa bởi khả năng của các hạt qua mỗi ảnh và không rõ ràng có thể phát sinh khi tham gia xác định vị trí. Để tính toán cho những vấn đề này, các thuật toán đã được phát triển để thiết lập lớn nhất của thông tin và cung cấp theo dõi đáng tin cậy. Nhiều cách tiếp cận bao gồm theo dõi đa hạt, nghĩa là tất cả các quỹ đạo đồng thời được xây dựng và tối ưu về sự va chạm giữa các hạt. (3). Phân tích và giải thích quỹ đạo Sau khi quá trình xử lý dữ liệu của SPT được thực hiện và thu được các quỹ đạo đã hoàn thành, bước cuối cùng bao gồm việc phân tích quỹ đạo, kiểm tra động lực học hạt và mô tả chúng theo kiểu chuyển động và định lượng các tham số khác nhau. Cách tiếp cận phổ biến nhất để phân tích các quỹ đạo phân tử đơn bao gồm việc tính toán độ dịch chuyển bình phương trung bình (MSD), mô tả phạm vi trung bình của không gian được phát hiện bởi một hạt như là một hàm của độ trễ thời gian. Đối với một hạt j khuếch tán trong 3D, có Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 18 tọa độ vị trí xj = {xj, yj, zj} được lấy mẫu tại N lần rời rạc mΔt, MSD cho một quỹ đạo đơn được tính như sau: MSD(tlag=mΔt)= 1 𝑁−𝑚 ∑ [𝑥𝑗(𝑡𝑖 + 𝑚∆𝑡) − 𝑁−𝑚 𝑖=1 𝑥𝑗(𝑡𝑖)] 2 (1.13) Một ví dụ về cách thực hiện tính toán MSD được cung cấp trong hình 1.7 (a) và (b) cho trường hợp 2D. Cần lưu ý rằng MSD trong phương trình (1.13) được tính toán với giả thiết về sự tương đương của các chuyển vị tại các thời điểm khác nhau và do đó nó đại diện cho thời gian trung bình. Hình 1.7. Phân tích quỹ đạo và đường cong MSD. (a) Trình bày sơ đồ tính toán chuyển vị vuông của quỹ đạo trong một thời gian trong không gian 2 chiều. (b) MSD trung bình theo thời gian của một quỹ đạo đơn hạt trong trong không gian 2 chiều, như là một hàm của độ trễ thời gian. (c) Vẽ MSD trên thang đo trong không gian 2 chiều .(d) Cho các loại khuếch tán đại diện trong không gian 2 chiều. Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 19 Tuy nhiên, quy mô khác nhau của MSD có thể xảy ra trong thực tế do hậu quả của môi trường không đồng nhất trong đó các hạt khuếch tán và tương tác với các thành phần xung quanh [18, 21, 22, 23]. 1.3.4. Kết luận Các nghiên cứu SPT đã chứng minh tầm quan trọng của việc thực hiện các thí nghiệm động trong các tế bào sống bằng cách cung cấp quyền truy cập vào hành vi phân tử đơn và do đó mô tả đặc điểm thống kê đầy đủ của hệ thống đang nghiên cứu. Từ những hướng dẫn này, chúng ta đã có thể phát hiện ra các đặc tính vận chuyển trong các quá trình sinh học ở quy mô nano và mesoscopic. Bây giờ chúng ta có thể hiểu làm thế nào các tham số khác nhau liên quan đến tương tác phân tử di động và cách chúng chuyển thành chức năng tế bào. Những kết quả này đã thúc đẩy rất nhiều sự hiểu biết của chúng ta về các cơ chế phối hợp tổ chức các phân tử không gian trong các hệ thống sống. SPT đã được thành lập trong gần ba mươi năm nay. Tuy nhiên, thay vì đạt đến độ chín bằng cách trải qua các phát triển khiêm tốn, kỹ thuật này liên tục được mở rộng rất nhiều, được hưởng lợi từ sự phát triển của các kỹ thuật quang học mới, chiến lược ghi nhãn tốt hơn và từ những tiến bộ ấn tượng trong sinh học phân tử. Sau khi được thực hiện với các hạt keo vàng lớn, SPT có thể được thực hiện với một loạt các phân tử huỳnh quang và không huỳnh quang có kích thước nano. Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 20 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM CHẾ TẠO , KHẢO SÁT VÀ THEO DÕI HẠT NANO VÀNG Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu động học của các đơn hạt nano vàng dạng cầu trong môi trường phức hợp Glycerol- nước. Do đó, trong phần thực nghiệm này, chúng tôi sẽ trình bày các vấn đề liên quan đến việc chuẩn bị mẫu, như: chế tạo hạt nano vàng dạng cầu và đưa vào môi trường phức hợp, đo đạc và quan sát các đơn hạt chuyển động trong môi trường phức hợp,Các thông số động học mà chúng tôi quan tâm đó là: hệ số khuếch tán dịch chuyển, quãng đường dịch chuyển và vận tốc dịch chuyển của các đơn hạt nano vàng. 2.1. Chế tạo các hạt nano vàng bằng phương pháp Turkevitch – Oxi hoá khử Các hạt nano vàng dạng cầu được chế tạo bằng phương pháp Turkevitch với tiền chất ban đầu là muối vàng HAuCl4.2H2O. Cụ thể, lấy 0,5 mL HAuCl4 0,05M đổ vào 50 mL H2O được gia nhiệt đến 100 oC và khuấy từ mạnh. Tiếp đến thêm chậm từng giọt 0,5 mL tác nhân khử Na3C6H5O7. Quan sát bình phản ứng, dung dịch chuyển màu từ vàng nhạt sang đỏ thẫm chứng tỏ đã hình thành các hạt nano vàng. Sau phản ứng 15 phút, dung dịch được dừng gia nhiệt và để nguội tự nhiên. Thí nghiệm được biểu diễn trong hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ chế tạo hạt keo vàng bằng phương pháp Turkevitch Bình phản ứng HAuCl4 Na3C6H5O7 Khuấy từ ~ 1000C Dung dịch hạt keo vàng Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 21 Quá trình làm thí nghiệm được tiến hành theo mô hình của hình 2.2 Hình 2.2. Mô hình phản ứng xảy ra trong phương pháp Turkevitch Các dung dịch hạt nano vàng sau khi chế tạo có mầu đỏ thậm hoặc mầu vang nho tùy thuộc vào kích thích hạt. Để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường chứa hạt (như hệ số nhớt) lên các thông số động học của hạt nano, chúng tôi tạo ra các môi trường phức hợp gồm nước và glycerol với nồng độ khác nhau. 7 mẫu hỗn hợp dung dịch chứa nano vàng và glycerol theo các tỉ lệ tương ứng trước khi đo đạc và xác định các thông số động học là: Mẫu 1: 20% Glycerol - 80% Nước Mẫu 2: 30% Glycerol - 70% Nước Mẫu 3: 40% Glycerol - 60% Nước Mẫu 4: 50% Glycerol - 50% Nước Mẫu 5: 60% Glycerol - 40% Nước Mẫu 6: 70% Glycerol - 30% Nước Mẫu 7: 90% Glycerol - 10% Nước 2.2. Các phương pháp khảo sát 2.2.1. Kính hiển vi điện tử quét (SEM- Scanning Electron Microscope) H2O HAuCl4 Na3C6H5O7 ~1000C ~1000C ~1000C ~1000C ~1000C 1) 2) 3) Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 22 Hiện nay, kính hiển vi điện tử quét đang được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu ảnh vi hình thái bề mặt mẫu. Tuỳ thuộc vào chất lượng thiết bị, có thể ghi ảnh hiển vi với phân giải tới vài nanô mét. Nguyên lý hoạt động: Một chùm tia điện tử đi qua các thấu kính điện từ hội tụ tại một diện tích rất nhỏ chiếu lên bề mặt mẫu nghiên cứu làm phát ra điện tử thứ cấp. Một detector được bố trí để thu tín hiệu điện tử thứ cấp từ mẫu phát ra khi điện tử chiếu vào, quét trên bề mặt mẫu và dùng tín hiệu này khuếch đại lên để điều khiển cường độ sáng của tia điện tử quét trên màn hình quan sát (hình 2.3). Giới hạn của độ phân giải hay khoảng cách tối thiểu d có thể phân biệt được theo Rayleigh tỷ lệ với bước sóng  của tia chiếu tới d ~ . Vì vậy tia điện tử có bước sóng ngắn vài chục nm tùy thuộc vào trường gia tốc sẽ cho độ phân giải của kính hiển vi điện tử cao nhiều lần so với giới hạn quang học. Hình 2.3. Sơ đồ khối của kính hiển vi điện tử quét Đầu dò điện tử thứ cấp Các thấu kính từ Các cuộn dây quét Điện cực Anốt Súng điện tử Chùm tia điện tử Bộ quét màn hình Đầu dò điện tử tán xạ ngược Mẫu đo Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 23 Các tính năng của kính hiển vi điện tử quét SEM: - Quan sát bề mặt mẫu rắn ở các độ phóng đại khác nhau. - Độ sâu trường quan sát lớn hơn rất nhiều so với kính hiển vi quang học, cho phép thu ảnh lập thể. - Kết hợp với đầu thu phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX) cho phép phân tích thành phần nguyên tố của vùng quan sát. Trên sơ sở đó trong đề tài này tôi đã dùng kính hiển vi điện tử quét SEM để quan sát và xác định kích thước của các hạt nano vàng chế tạo được 2.2.2. Phổ hấp thụ UV-Vis Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ 0I vào môi trường vật chất có bề dày l (cm) và nồng độ C(mol/l), thì chùm tia này sẽ bị môi trường vật chất hấp thụ và truyền qua. Cường độ I của chùm tia truyền qua môi trường này bị giảm theo quy luật Lamber-Beer: 𝐿𝑜𝑔 ( 𝐼0 𝐼 ) = 𝐾. 𝑛 (2.1) Hay: log ( 𝐼0 𝐼 ) = 𝜀1𝐶 (2.2) Trong đó: 𝐾: là hệ số hấp thụ mol hay độ hấp thụ của môi trường, 𝑛: là số mol chất nghiên cứu đặt trên đường đi của bức xạ. Đại lượng log( 0I / I ) được gọi là mật độ quang (D) hoặc độ hấp thụ (A). 𝜀 là hệ số hấp thụ mol (hệ số mol) có giá trị bằng mật độ quang của dung dịch khi nồng độ chất hấp thụ bằng một đơn vị và độ dầy chất hấp thụ bằng một đơn vị. Hệ số hấp thụ  chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ và bước sóng của bức xạ bị hấp thụ. Độ truyền qua của môi trường T= I / 0I Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 24 Hình 2.4. Biểu diễn định luật Lamber-Beer Không một chất nào lại hấp thụ trong toàn bộ các vùng phổ điện từ. Sự hấp thụ thường tập trung vào từng vùng phổ hẹp, cho nên để thuận lợi, người ta thường biểu diễn và xem xét từng vùng phổ riêng biệt như: vùng tử ngoại, khả kiến, hồng ngoại Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ νK vào tần số  hoặc bước sóng  gọi là đường cong hấp thụ (hay phổ hấp thụ). Mỗi chất hấp thụ đều hấp thụ lọc lựa ở những bước sóng khác nhau. Phương trình (2.1) là biểu thức toán học của định luật Beer-Lamber: khi hấp thụ tia đơn sắc, độ hấp thụ phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ chất hấp thụ. Tùy từng chất, định luật Beer-Lamber thường đúng trong một khoảng nồng độ. Hình 2.5 trình bày sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang hai chùm tia. Ánh sáng tới được tách thành các ánh sáng đơn sắc nhờ cách tử nhiễu xạ. Tiếp đó, chùm sáng đơn sắc được chia thành hai tia có cường độ bằng nhau nhờ gương bán phản xạ. Một trong hai tia sáng truyền qua cuvet thạch anh chứa dung dịch mẫu cần nghiên cứu, có cường độ I sau khi truyền qua mẫu. Tia còn lại truyền qua cuvet tương tự chứa dung môi để so sánh. Cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu so sánh là I0. Việc quay cách tử và tự động so sánh cường độ các tia sáng sau khi truyền qua dung dịch chứa mẫu nghiên cứu và mẫu Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 25 dung môi sẽ cho phép nhận được phổ hấp thụ của mẫu nghiên cứu dưới dạng sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào bước sóng. Hình 2.5. Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ UV-Vis hai chùm tia Các dung dịch chứa keo nano vàng được đo trên thiết bị UV-Vis hai chùm tia Jasco V770 tại Khoa Vật lý và Công nghệ-Trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên. Thiết bị này cho phép đo phổ từ 200 nm đến 2700 nm. 2.2.3. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học trường tối Để ghi lại hình ảnh và theo dõi sự chuyển động của các hạt nano vàng sau khi chế tạo được, chúng tôi sử dụng kính hiển vi quang học trường tối. Nguyên lý: Dựa vào sự tương phản giữa ảnh vật với nền tối để nâng cao khả năng quan sát của mắt người hay camera về ảnh đó. Kính hiển vi trường tối chủ yếu dùng quan sát mẫu bị khúc xạ hay tán xạ mạnh. Chùm ánh sáng từ nguồn được chặn lại bởi tấm chắn sáng, màn chắn sáng chắn chùm sáng trung tâm (tạo nền đen của trường nhìn), chỉ cho ánh sáng vòng ngoài Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 26 đi qua để tạo góc chiếu tới mẫu lớn. Ánh sáng vòng ngoài được hội tụ trên mẫu và truyền tới vật kính để tạo ảnh của mẫu. Như vậy ảnh của mẫu sẽ là các đốm sáng trên nền đen trong trường nhìn. Với cấu hình này, chỉ có ánh sáng nào đi qua mẫu, mang thông tin về mẫu thì mới đóng góp vào việc tạo ảnh của mẫu. Những ánh sáng nào không đi qua mẫu sẽ không được vật kính thu thập và bị loại bỏ hoàn toàn (loại nhiễu). Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi trường tối được minh họa trên hình 2.6a. (a) (b) Hình 2.6.(a) Sơ đồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi trường tối. (b) Ảnh trường tối (bên phải) được so sánh với ảnh trường sáng (bên trái) được tạo bởi kính hiển vi trường tối. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kính hiển vi trường tối có cấu hình quang học được thiết kế như hình 2.7. Với cấu hình quang học này, ánh sáng kích mẫu có thể ở chế độ truyền qua hoặc phản xạ nhờ đèn halogen 1 và halogen 2. Để điều khiển mẫu được dễ dàng, một giá để mẫu với độ phân giải cao được lắp thêm vào và hiệu chỉnh một cách dễ dàng tới µm. Sau khi ánh sáng tán xạ từ mẫu phát ra được thu vào một camera nhanh nhạy EMCCD. Với camera này cho phép thu được tín hiệu với tần số lên đến gần 35 kHz, từ đó có thể dễ dàng ghi lại các video mô tả quá trình chuyển động của hạt nano. Các kết quả đo đạc sẽ được phân tích kỹ trong chương 3. Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 27 Hình 2.7. Cấu hình quang học của kính hiển vi trường tối phản xạ và truyền qua được sử dụng để quan sát các hạt nano vàng 2.3. Quy trình theo dõi đơn hạt nano vàng trong môi trường phức hợp Theo dõi một hạt duy nhất chuyển động trong dung dịch là một công nghệ theo dõi sự chuyển động của từng phân tử phát quang (huỳnh quang chẳng hạn) dựa trên một hệ ghi ảnh nhanh. Chúng ta lưu lại các quỹ đạo của từng hạt đã được đánh dấu, điều này cho phép nhận được tín hiệu/nhiễu rất tốt và do đó xác định được vị trí của hạt cần theo dõi. Đây là một phương pháp rất mới đang được phát triển để hiện ảnh các quỹ đạo từng phân tử phát quang riêng lẻ có kích thước rất bé (do đó khuếch tán rất nhanh) hoặc là hiện ảnh quỹ đạo Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên Học viên: Hoàng Văn Quế Trang 28 các phân tử có nồng độ lớn. Công nghệ này được đánh giá rất cao trong lĩnh vực nghiên cứu động học các hạt nano vàng trong môi trường phức hợp. Như đã trình bày trong phần trên, kính hiển vi trường tối là ứng viên sáng giá được dùng để quan sát sự tán xạ và hiện ảnh plasmon của hạt nano vàng trong các môi trường phức hợp. Công nghệ theo dõi đơn phân tử là rất lý tưởng cho việc làm bộc lộ các đặc trưng của từng hạt nano sẽ được sử dụng để xác định sự dịch chuyển, hệ số khuếch tán hay vận tốc của nó. Để thuận lợi, chúng tôi ghi một video gồm 1000 ảnh nhờ một camera rất nhạy EM-CCD Andor. Khoảng thời gian giữa 2 ảnh là 0,3s. Quy trình của công nghệ theo dõi đơn hạt thông thường bao gồm 4 bước ( Hình 2.8) Hình 2.8. Sơ đồ minh họa quy trình theo dõi đơn hạt Bước 1: Ghi một video dưới kính hiển vi trường tối. Video bao gồm 1000 ảnh và khoảng thời gian giữa 2 ảnh là 0,3s. Bước 2: Xác định các vị trí tương ứng với mỗi ảnh hiển thị. Một chuỗi các ảnh được ghi lại bởi camera, sau đó được phân tích bởi phần mềm ImageJ bằng cách sử dụng công cụ plug-in de MOSAIC [24]. Có một số thông số cần được lựa chọn phù hợp để phát hiện ra các hạt, như; radius of particle (pixel)