Luận văn Chế tạo và nghiên cứu quá trình hấp thụ plasmon của các hạt nano bạc nhằm ứng dụng trong diệt khuẩn escherichia coli

ày. Hình 1.10. Tác động của ion bạc lên vi khuẩn Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như sau: sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin –SH của phân tử enzym chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn [23]. Hình 1.11. Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn [23] Ngoài ra, các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA [24]. 16 Hình 1.12. Ion bạc liên kết với các base của DNA [24] Xét trên góc độ sinh học các nhà nghiên cứu đều có một quan điểm thống nhất rằng hạt keo nano nạc diệt khuẩn theo một trong những cơ chế sau: − Một là: Nano bạc phá hủy chức năng hô hấp. − Hai là: Nano bạc phá hủy chức năng của thành tế bào. − Ba là: Nano bạc liên kết với DNA của tế bào vi sinh vật và ức chế chức năng sao chép của chúng, kìm hãm chúng, không cho chúng phát triển mạnh. Hiện nay có nhiều lý thuyết về cơ chế tác dụng diệt vi khuẩn của nano bạc đã được đề xuất, trong đó lý thuyết hấp thụ được nhiều người chấp nhận hơn cả. Bản chất của thuyết này là ở chỗ tế bào vi khuẩn bị vô hiệu hóa là do kết quả của quá trình tương tác tĩnh điện giữa bề mặt mang điện tích âm của tế bào vi khuẩn và ion Ag+ được hấp phụ lên đó, các ion này sau đó xâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn và vô hiệu hóa chúng. Hình 1.13. Các hạt nano tương tác với tế bào vi khuẩn bằng lực bám hút tĩnh điện và phá vỡ cấu trúc màng Cho đến nay, những gì liên quan đến cơ chế tác động của hạt keo nano bạc lên tế bào vi sinh vật (đơn bào), mới chỉ có một quan điểm được hầu hết các nhà khoa học thừa nhận. Đó là khả năng diệt khuẩn của hạt keo nano bạc là kết quả của quá trình biến đổi (giải phóng liên tục) các nguyên tử bạc kim loại trên bề mặt 17 hạt nano nạc thành các ion Ag+ tự do và các ion tự do này sau đó tác dụng lên vi khuẩn và diệt khuẩn theo những cơ chế đã nói ở trên. Tuy nhiên, nếu dùng Ag+ thì lại không có hiệu quả cao mà phải là hạt nano Ag, tức phân tử bạc. Có 4 cơ chế diệt khuẩn của hạt keo AgNPs thể hiện bằng hình ảnh dưới đây: Hình 1.14. Cơ chế diệt khuẩn của hạt keo nano bạc - Cơ chế thứ nhất: Ức chế quá trình vận chuyển các ion Na+ và Сa2+ qua màng tế bào, ngăn cản quá trình trao đổi chất (Hình A). - Cơ chế thứ hai: Phá vỡ màng tế bào, oxy hóa nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, phá hủy nguyên sinh chất bởi oxy hòa tan trong nước với vai trò xúc tác của bạc (Hình B). - Cơ chế thứ ba: Tác động gián tiếp lên phân tử DNA bằng cách tăng số lượng các gốc tự do làm giảm hoạt tính của các hợp chất chứa ôxy hoạt động, làm rối loạn các quá trình ôxy hóa cũng như Phosphoryl hóa trong tế bào vi khuẩn (Hình C). - Cơ chế thứ tư: vô hiệu hóa enzym có chứa các nhóm –SH và –COOH, phá vỡ cân bằng áp suất thẩm thấu, hoặc tạo phức với axit nucleic dẫn đến làm thay đổi cấu trúc DNA của tế bào vi sinh vật (tác động trực tiếp đến cấu trúc DNA (Hình D). 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn của keo nano bạc Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến tính kháng khuẩn của hạt keo nano bạc. Kích thước hạt keo nano bạc là yếu tố quan trọng quyết định khả năng diệt khuẩn của chúng. Hạt keo nano bạc có kích thước càng nhỏ thì khả năng diệt khuẩn của chúng càng mạnh, vì khi ở kích thước càng nhỏ thì tỉ số giữa diện tích bề mặt và thể tích càng lớn và hạt cũng có thể dễ dàng tương tác với vi khuẩn hơn. Tuy nhiên các hạt có kích thước nhỏ lại có khuynh hướng liên kết với nhau trong quá trình lưu trữ tạo thành các hạt lớn hơn gây ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn 18 và bảo quản keo nano bạc. Do đó trong quá trình chế tạo chúng ta phải tìm ra các phương pháp vừa tạo ra hạt nano bạc có kích thước nhỏ vừa bền vững. Các hạt nano có thể có rất nhiều hình dạng khác nhau như: hình que, hình cầu, hình tam giác, Và sự thể hiện của các hạt nano bạc với cùng nồng độ, sự phân bố nhưng với các hình dạng khác nhau là không giống nhau. Các hạt nano bạc có hình tam giác có tính kháng khuẩn cao hơn các hạt hình cầu và các hạt nano que có tính kháng khuẩn thấp nhất. Hạt nano bạc có nồng độ càng cao và sự phân bố đều thì khả năng diệt khuẩn càng tốt. Tuy nhiên khi nồng độ quá cao, do năng lượng bề mặt hạt nano lớn, nên các hạt keo nano bạc sẽ va chạm vào nhau và phá vỡ cấu trúc nano. Vì vậy chúng ta cũng cần tìm nồng độ thích hợp để các hạt phân bố đồng đều và tránh kết tủa. 1.3.3. Ảnh hưởng của hạt keo nano bạc đến sức khỏe con người Nano bạc được đưa vào sử dụng với mục đích kháng khuẩn và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn. Điều đó nói lên mối quan hệ của nano bạc và con người. Một nghiên cứu của trường đại học y khoa ODENSE cho thấy hạt keo nano bạc không có tương tác mạnh với cơ thể con người và cũng không là tác nhân gây độc. Chính vì vậy, nano bạc không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và được xem là vô hại. 1.4. Ứng dụng của hạt keo nano bạc Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh: Các hạt keo nano bạc được sử dụng trong các cảm biến sinh học và các xét nghiệm nhiều nơi các vật liệu nano bạc có thể được sử dụng làm các thẻ sinh học để phát hiện định lượng. Ứng dụng dẫn điện: Các hạt keo AgNPs được sử dụng trong các loại giấy dẫn điện và được tích hợp vào các vật liệu composite để tăng tính dẫn nhiệt và điện. Ứng dụng quang học: Các hạt keo AgNPs được sử dụng để thu thập năng lượng một cách hiệu quả và tăng cường quang phổ quang học bao gồm cả tăng cường sự phát quang huỳnh quang kim loại (MEF) và tán xạ Raman (SERS). Ứng dụng kháng khuẩn: Các hạt keo AgNPs được kết hợp trong quần áo, giày dép, sơn, băng vết thương, dụng cụ, mỹ phẩm, chất dẻo cho tính chất kháng 19 khuẩn của chúng. Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi Bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc Các hạt keo AgNPs được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi Điều hòa Khẩu trang nano bạc Hình 1.15. Một vài sản phẩm chứa hạt keo nano bạc Trong năm gần đây nano bạc đã có nhiều ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp. Khử mùi hôi và diệt vi khuẩn, nấm theo cơ chế đặc thù, ức chế và kìm hãm quá trình phát sinh và phát triển của virus gây bệnh. Khác với các dòng thuốc kháng sinh, nano bạc không có tính kháng thuốc, không độc hại, an toàn khi sử dụng. Hạt keo AgNPs không bị thay đổi tính chất, trơ với hầu hết mọi môi trường nên hiệu quả diệt nấm và vi khuẩn rất bền vững. Các hạt keo AgNPs có tác dụng diệt nấm khuẩn theo cơ chế đặc thù riêng biệt do đó hạt nano bạc được sử dụng như một loại thuốc BVTV, có vai trò quan trọng trong việc phòng và trị bệnh. Hạt nano bạc có tác dụng phòng chống sự xâm nhiễm của nấm và vi khuẩn gây bệnh xâm nhập qua các tế bào lá và rễ. Phòng và trị rất tốt các nhóm bệnh do nấm khuẩn gây ra như: bệnh lở cổ rễ, vàng lá thối rễ, các bệnh đốm lá, loét cam, thối nhũn − Đối với trồng trọt: Phòng và trị bệnh do nấm, khuẩn và virus gây ra (thay thế hoàn thoàn thuốc BVTV hóa học dùng để phòng trị bệnh trên cây trồng). Sử dụng hạt keo AgNP thường xuyên định kỳ theo các giai đoạn sinh trưởng, phát 20 triển của cây giúp cây trồng ngăn ngừa chủ động từ xa dịch bệnh, giảm chi phí trong việc BVTV, tăng giá trị nông sản phẩm. + Nâng cao khả năng hấp thụ ánh sáng cho bộ lá cây trồng qua đó làm tăng hiệu suất quang hợp của cây trồng, tăng cường vận chuyển dinh dưỡng về các cơ quan dự trữ, giúp cây trồng tăng năng suất, sản lượng. + Sử dụng hạt keo AgNPs trong việc sản xuất giá đỗ và rau mầm làm tăng chất lượng giá đỗ: giảm quá trình gây mùi hôi trong quá trình trồng rau mầm và sản xuất giá đỗ, tăng thời gian bảo quản,tiêu diệt vi khuẩn và nấm gây bệnh thối nhũn + Bổ sung hạt keo AgNPs vào nước cắm hoa, giúp hoa tươi lâu, kéo dài thời gian chơi hoa, giảm mùi hôi thối và các bệnh thối nhũn hoa − Đối với thủy sản: + Cải thiện môi trường ao nuôi, giảm mùi hôi tanh của nước. + Phòng và trị bệnh do các VSV đơn bào gây ra trên: tôm, cá, ba ba, ếch(nấm, vi khuẩn và virus gây bệnh). Hạt keo nano bạc thể hiện vai trò diệt khuẩn cực mạnh trong môi trường nước. Trong quá trình di chuyển và phân tán ở môi trường nước chúng vừa khử mùi và tiêu diệt mầm bệnh. Các hạt keo nano bạc tồn tại trong môi trường nước trong quá trình phân tán và di chuyển chúng sẽ bám hút trên bề mặt tế bào vi khuẩn và diệt chúng theo cơ chế đặc thù. Các hạt keo AgNPs mang điện tích dương, vi sinh vật (VSV) gây bệnh mang điện tích âm do đó hạt keo nano bạc và vi khuẩn gây bệnh sẽ hút nhau. − Đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm: + Hạt keo AgNPs có tác dụng phòng và trị bệnh thông qua việc phun hạt nano bạc trong môi trường sống của vật nuôi. Sử dụng hạt nano bạc pha loãng với nước phun định kỳ 7-10 ngày có tác dụng phòng bệnh rất tốt, chúng sẽ tiêu diệt các nhóm vi khuẩn, nấm gây bệnh trên vật nuôi tồn tại ở môi trường sống. Ngoài ra AgNPs còn có tác dụng khử mùi hôi chuồng trại, giúp không khí sạch hơn qua đó phòng bệnh cho vật nuôi một cách chủ động (đặc biệt là bệnh hô hấp). + Sử dụng hạt keo AgNPs cho vật nuôi ăn/uống: Tiêu diệt vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột (tiêu chảy, phân trắng), phòng và trị bệnh cầu trùng trên gà 1.5. Khái quát về vi khuẩn 21 1.5.1. Khái niệm chung về vi khuẩn Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào, có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân (Prokaryote – sinh vật nhân sơ). Vi khuẩn hiện diện ở khắp mọi nơi trong đất, nước, không khí, kể cả những nơi có điều kiện sống khắc nghiệt như: trên miệng núi lửa hay trên băng tuyết.v.v. Có rất nhiều chủng vi khuẩn, và mỗi chủng vi khuẩn đều có sự khác nhau về đặc tính và hình thái. Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác nhau và được gọi với tên gọi theo hình dạng của chúng như: trực khuẩn (bacillus), hình cầu, xoắn khuẩn (spirillum), hình que, cầu khuẩn (coccus) Hình dáng vi khuẩn là một đặc điểm quan trọng để nhận dạng các chi được đặt tên theo hình dạng. Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành thử nhiệm khả năng diệt khuẩn của hạt keo nano bạc với hai lại vi khuẩn là: vi khuẩn Gram âm Escherichia coli (E. coli). 1.5.2. Vi khuẩn Gram âm “Escherichia coli”  Phân loại khoa học: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ : Enterobacteriales Họ : Enterobacteriaceae Chi : Escherichia Loài: E.coli Hình 1.16. Hình dạng của vi khuẩn E.coli quan sát dưới kính hiển vi [25] Đặc điểm: Escherichia coli (E.coli) hay còn gọi là vi khuẩn đại tràng, là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của người và động vật máu nóng. Chúng được phát hiện đầu tiên vào năm 1885 do Escherich phát hiện, thuộc 21 họ vi khuẩn Enterobacteriaceae. Chúng là các trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình (2-3µm) x 0.5 µm. Trong những điều kiện không thích hợp vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ. 22 Chương 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐẠC 2.1. Trang thiết bị, vật liệu và hóa chất sử dụng 2.1.1. Các dụng cụ, thiết bị nghiên cứu Máy khuấy từ gia nhiệt, cân phân tích 4 số GR-200, tủ sấy, máy ly tâm tốc độ cao. Bộ sưu tập các chủng vi khuẩn và box nuôi cấy vi khuẩn; các đĩa petri nuôi cấy vi khuẩn, nấm. Máy đo pH để bàn sension 3, máy đo quang phổ hấp thụ UV-Vis HITACHI U-2900 (Japan). Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope-TEM) JEM 1010 (Jeol). Phổ kế hồng ngoại Spectrum FTIR Affinity-1S (SHIMADZU). Máy đo phổ nhiễu xạ tia X. 2.1.2. Các hoá chất sử dụng  Các hóa chất sử dụng: Bạc nitrat (AgNO3, 99.8%), tác nhân khử mạnh Sodium Bohidrid (NaBH4) xuất sứ từ Đức; NaOH; axit nitric (HNO3) có độ tinh khiết cao; Trisodium citrate dihydrate (TSC) (𝐶6𝐻5𝑁𝑎3𝑂7 · 2𝐻2𝑂, 99%) đóng vai trò vừa là chất khử vừa là tác nhân ổn định, mua của hãng Sigma Aldrich. Các hóa chất đều được pha bằng nước cất 2 lần và nước khử ion.  Các môi trường nuôi cấy: Nuôi cấy vi khuẩn E.coli. 2.2. Chế tạo các hạt keo nano bạc dạng cầu 2.2.1. Phương pháp khử hóa học sử dụng citrate Đây là phương pháp mà sử dụng một bước để tổng hợp các hạt keo nano bạc với tác nhân khử là TSC. TSC ngoài việc đóng vai trò là tác nhân khử còn đóng vai trò là tác nhân ổn định để ngăn cản sự kết đám của hạt nano trong quá trình tổng hợp các hạt nano AgNPs. Quá trình tổng hợp được thực hiện như sau: Đầu tiên, dung dịch muối bạc AgNO3 có nồng độ 1mM được khuấy từ mạnh và gia nhiệt đến sôi. Tiếp theo, dung dịch TSC được thêm từng giọt vào bình đựng AgNO3 khi nhiệt độ trong bình phản ứng đã đạt 100oC. Quan sát thấy khi mầu của dung dịch chuyển sang hơi vàng nhạt, chứng tỏ đã xảy ra phản ứng khử ion Ag+. Ngừng các điều kiện phản ứng và để bình phản ứng nguội dần đến nhiệt độ phòng. Quá trình tạo thành hạt nano bạc được mô tả trên Hình 2.1. 23 Hình 2.1. Hình minh họa cơ chế phát triển mầm tạo thành các AgNPs bằng phương pháp khử citrate. Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như Hình 2.2. Hình 2.2. a) Thí nghiệm chế tạo hạt nano bạc. b) Dung dịch hạt nano bạc sau khi chế tạo Các mẫu sau khi chế tạo được bảo quản trong bóng tối và ở nhiệt độ 4oC. Một số tham số ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp hạt nano bạc được khảo sát nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để ổn định hạt nano với hiệu suất cộng hưởng Plasmon cao. Phản ứng khử ion Ag+ theo tác giả Pillai Z.S và cộng sự [1] như sau; 4Ag+ + C6H5O7Na3 + 2H2O → 4Ag0+ C6H5O7H3 + 3Na+ + H+ +O2↑ 24 Để khảo sát ảnh hưởng của 3 tham số (tỷ lệ mol TCS/AgNO3), thời gian phản ứng và pH), đối với mỗi thí nghiệm chỉ một tham số thay đổi còn các tham số khác được giữ nguyên. 2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mẫu Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của 3 tham số đối với quá trình tổng hợp các hạt nano bạc, ảnh hưởng cụ thể của từng tham số được trình bày cụ thể sau đây. a) Ảnh hưởng của tỷ lệ mol TSC/AgNO3 lên AgNPs Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của hàm lượng chất khử, tiến hành làm 7 thí nghiệm riêng rẽ, với tỷ lệ mol giữaTSC/AgNO3 lần lượt: 2:1; 3,5:1; 5:1; 8:1; 15:1; 20:1 và 35:1 và phản ứng được thực hiện trong 25 phút. Thí nghiệm các tỷ lệ này được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TSC/AgNO3 đến quá trình tổng hợp các hạt keo nano bạc Tên mẫu TSC (mol) AgNO3 (mol) Thời gian phản ứng (phút) M1 2 1 3 M2 3,5 M3 5 M4 8 M5 15 M6 20 M7 35 b) Ảnh hưởng của thời gian tiêm TSC và thời gian phản ứng lên AgNPs Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian phản ứng được chuẩn bị 90ml AgNO3(10 -3M) và 15ml TSC (5x10-3M). Tỷ lệ mol của TSC/AgNO3 là 5:1 được lựa chọn để nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên quá trình chế tạo các hạt nano bạc. Đầu tiên khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ bơm TSC vào dung dịch AgNO3 trong 2 trường hợp: Tiêm nhanh và tiêm chậm (từng giọt). Kết quả chi tiết sẽ được bàn luận trong chương 3. Thứ hai là, khảo sát ảnh hưởng của thời 25 gian phản ứng lên sự tạo thành hạt nano bạc. 7 mẫu với thời gian phản ứng khác nhau được khảo sát lần lượt: 4, 8, 14, 20, 25, 32 và 42 phút. Ở mỗi thời gian phản ứng này, 10 ml dung dịch keo hạt nano bạc được lấy ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Các thông số của thí nghiệm được trình bày tóm tắt trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp các hạt keo nano bạc Tên mẫu Tỷ lệ mol TSC/ AgNO3 Thời gian phản ứng (phút) T1 5:1 4 T2 5:1 8 T3 5:1 14 T4 5:1 20 T5 5:1 25 T6 5:1 32 T7 5:1 42 c) Khảo sát sự ảnh hưởng của pH Bảng 2.3. Các điều kiện thực nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của pH Mẫu Tỷ lệ mol (TSC:AgNO3) Thời gian phản ứng (min) Thể tích mẫu[ml] HNO3 (30%) [µl] NaOH (0.3 M) [µl] pH P1 5:1 25 10 - - 7.3 P2 10 100 - 1.53 P3 10 30 - 2.1 P4 10 10 - 2.5 P5 10 - 20 10.3 P6 10 - 10 10 P7 10 - 5 9.6 P8 30 - 200 11.3 Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến tính chất quang của các hạt nano bạc AgNPs, pH của môi trường được điều chỉnh bằng axit nitric (HNO3) và natri 26 hydroxit (NaOH) vào dung dịch hạt nano bạc ở nhiệt độ phòng sau khi tổng hợp. Tỷ lệ mol của TSC/AgNO3 được chọn là 5:1, nhiệt độ phản ứng ở 100°C và thời gian phản ứng là 25 phút. Các thông số điều chỉnh pH của môi trường chứa AgNPs được trình bày trong bảng 2.3. 2.3. Chế tạo các hạt nano bạc dạng đĩa bằng cảm quang dùng LED 2.3.1. Quy trình Quá trình chế tạo hạt nano bạc hình thù khác nhau bằng phương pháp quang hóa gồm có 2 bước cơ bản: Bước 1: Tạo mầm Lấy 50ml H2O cho vào bình cầu đã được làm sạch. Thêm 2ml AgNO3 (2,5 mM) + 4 ml TSC (2,5 mM). Cho bình cầu vào hộp xốp đá lạnh và khuấy từ trong thời gian 30 phút. Sau đó, nhỏ giọt từ từ 400l dung dịch NaBH4 (10 mM) đã được làm lạnh. Khuấy từ thêm 60 phút. Nhỏ từ từ 200l dung dịch NaOH (10 mM) và khuấy từ thêm 15 phút. Sơ đồ tạo mầm được thể hiện ở Hình 2.3. Hình 2.3. Sơ đồ chế tạo mầm Ag Bước 2: Phát triển mầm để tạo các đĩa AgNPs bằng chiếu LED Dung dịch mầm nano bạc sau khi tạo ra sẽ được chiếu bằng hệ thống LED (532 nm) trong những khoảng thời gian cần khảo sát ở nhiệt độ phòng. Hình 2.4 là ảnh chụp thí nghiệm các hạt nano bạc được chiếu sáng bởi LED với công suất 0,51 mW/cm2. 27 Hình 2.4. Phát triển mầm bằng đèn LED với mật độ công suất 0,51 mW/cm2 2.3.2. Ảnh hưởng của lượng TSC lên các đĩa AgNPs Để nghiên cứu ảnh hưởng của lượng citrate lên sự tạo thành đĩa AgNPs dưới kích thích của LED, đề tài tiến hành khảo sát thay đổi lượng TSC ngay trong quá trình tạo mầm. Các thông số thay đổi TSC được trình bày như trong bảng 2.4. Trong trường hợp này tỷ số nồng độ [NaBH4]/[AgNO3] được chọn cố định bằng 5:4. Sự ảnh hưởng chi tiết của TSC sẽ được trình bày chi tiết trong chương 3. Bảng 2.4. Bảng số liệu thay đổi lượng TSC lên sự tạo thành mầm Stt Mẫu [NaBH4]/[AgNO3] TSC (2,5mM) (µl) 1 E1 5:4 50 2 E2 100 3 E3 500 4 E4 1000 5 E5 2500 6 E6 4000 2.4. Khảo sát tính kháng khuẩn của hạt keo nano bạc với khuẩn E.coli Các mẫu nano bạc chế tạo được ở trên đem thử nghiệm kháng khuẩn với chủng vi khuẩn Gram âm-vi khuẩn E.coli. Các thí nghiệm được tiến hành trên đĩa Petri đã được khử trùng. Phương pháp đục lỗ được sử dụng để xác định đường kính vô khuẩn bởi đây là phương pháp dễ thực hiện và phù hợp với điều kiện trong phòng thí nghiệm. Các bước tiến hành thí nghiệm: Phương pháp đục lỗ được tiến hành trong box nuôi cấy: 28 Cho 3 ml môi trường nuôi dưỡng được đổ vào các đĩa Petri vô trùng (như một lớp cơ bản). Lấy 15 μL dịch huyền phù của chủng vi khuẩn để thử nghiệm có số lượng khoảng 79 tế bào nhỏ trên bề mặt của môi trường của đĩa và trải đều trên bề mặt đến khi khô bằng que trang thủy tinh vô trùng. Hình 2.5. Hình ảnh đĩa Petri được đục lỗ để làm thí nghiệm thử kháng khuẩn 2.5. Các phương pháp khảo sát 2.5.1. Phổ hấp thụ UV-Vis Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ 0 I vào môi trường vật chất có bề dày 1(cm) và nồng độ C(mol/l), thì chùm tia này sẽ bị môi trường vật chất hấp thụ và truyền qua. Cường độ I của chùm tia truyền qua môi trường này bị giảm theo quy luật Lamber-Beer: 𝐿𝑜𝑔 ( 𝐼0 𝐼 ) = 𝐾. 𝑛 (2.1) Hay: log ( 𝐼0 𝐼 ) = 𝜀1𝐶 (2.2) Trong đó: 𝐾: là hệ số hấp thụ mol hay độ hấp thụ của môi trường, 𝑛: là số mol chất nghiên cứu đặt trên đường đi của bức xạ. Đại lượng log( 0I / I ) được gọi là mật độ quang (D) hoặc độ hấp thụ (A). 𝜀 là hệ số hấp thụ mol (hệ số mol) có giá trị bằng mật độ quang của dung dịch khi nồng độ chất hấp thụ bằng một đơn vị và độ dầy chất hấp thụ bằng một đơn vị. Hệ số hấp thụ  chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ và bước sóng của bức xạ bị hấp thụ. Độ truyền qua của môi trường T= I / 0I . 29 Hình 2.6. Biểu diễn định luật Lamber-Beer Không một chất nào lại hấp thụ trong toàn bộ các vùng phổ điện từ. Sự hấp thụ thường tập trung vào từng vùng phổ hẹp, cho nên để thuận lợi, người ta thường biểu diễn và xem xét từng vùng phổ riêng biệt như: vùng tử ngoại, khả kiến, hồng ngoại Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ νK vào tần số  hoặc bước sóng  gọi là đường cong hấp thụ (hay phổ hấp thụ). Mỗi chất hấp thụ đều hấp thụ lọc lựa ở những tần số bước sóng khác nhau. Phương trình (2.1) là biểu thức toán học của định luật Beer-Lamber: khi hấp thụ tia đơn sắc, độ hấp thụ phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ chất hấp thụ. Tùy từng chất, định luật Beer-Lamber thường đúng trong một khoảng nồng độ. Hình 2.7. Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ UV-Vis hai chùm tia Đối với các dung dịch nano kim loại nói chung và nano bạc nói riêng thì việc phân tích phổ hấp thụ UV-Vis (hay còn gọi là phổ hấp thụ Plasmon) cho các thông tin quan trọng về tính chất quang của chúng. Nguồn bức xạ Dung dịch mẫu Bộ dò bức xạ 30 Hình 2.4 trình bày sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang hai chùm tia. Ánh sáng tới được tách thành các bước sóng đơn sắc nhờ cách tử nhiễu xạ. Tiếp đó, chùm sáng đơn sắc được chia thành hai tia có cường độ bằng nhau nhờ gương bán phản xạ. Một trong hai tia sáng truyền qua cuvet thạch anh chứa dung dịch mẫu cần nghiên cứu, có cường độ I sau khi truyền qua mẫu. Tia còn lại truyền qua cuvet tương tự chứa dung môi để so sánh. Cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu so sánh là I0. Việc quay cách tử và tự động so sánh cường độ các tia sáng sau khi truyền qua dung dịch chứa mẫu nghiên cứu và mẫu dung môi sẽ cho phép nhận được phổ hấp thụ của mẫu nghiên cứu dưới dạng sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào bước sóng. Các dung dịch chứa keo nano bạc được đo trên thiết bị UV-Vis hai chùm tia Jasco V530 tại Khoa Môi Trường và Trái Đất-Trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên. Thiết bị này cho phép đo phổ từ 200nm đến 1100nm. 2.5.2. Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope −TEM) Đối với hạt nano bạc kích thước nanomet, chúng tôi sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua để xác định hình dạng, kích thước của mẫu. Kính hiển vi điện tử truyền qua có ưu điểm nổi bật: nhờ bước sóng của chùm điện tử ngắn hơn rất nhiều so với ánh sáng nhìn thấy nên nó có thể quan sát tới kích cỡ 0,2 nm. Hơn nữa, việc xác định hình dạng và kích thước của hạt nano bạc cũng rất quan trọng. Vì vậy việc sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua là cần thiết. Kính hiển vi điện tử truyền qua (tiếng Anh: transmission electron microscopy, viết tắt: TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên fim quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số. Nguyên lý hoạt động: Kính hiển vi điện tử truyền qua làm việc theo nguyên tắc phóng đại nhờ các thấu kính, ánh sáng tới là tia điện tử có bước sóng ngắn cỡ 0,05 Å và thấu kính 31 thường là các thấu kính điện tử có tiêu cự f thay đổi được. Chùm tia điện tử phát ra từ súng điện tử được gia tốc với điện thế tăng tốc (80 kV), qua một số kính hội tụ và chiếu lên mẫu. Kính vật tạo ra ảnh trung gian và kính phóng sẽ phóng đại ảnh trung gian thành ảnh cuối cùng với độ phóng đại M = Mv ∗ Mp. Hiện nay, năng suất phân giải của kính hiển vi điện tử truyền qua không bị giới hạn. Phương pháp này có độ phân giải cỡ 2-3Å. Một nhược điểm cơ bản của kính hiển vi điện tử truyền qua là các mẫu nghiên cứu phải được xử lý thành các lát rất mỏng (< 0.1 mm), hoặc tạo thành các dung dịch để nhỏ lên các tấm lưới bằng đồng mà đã được trải một lớp màng Cacbon, các hạt nano tinh thể sẽ mắc trên các lưới đỡ này khi đo dưới kính hiển vi điện tử. Các lớp này phải đủ dày để tồn tại ở dạng rắn, ít nhất là vài chục đến vài trăm lớp nguyên tử. Như vậy ứng với mỗi điểm trên ảnh hiển vi điện tử truyền qua là những cột điện tử mẫu (chiều cao của cột nguyên tử là chiều dày trên mẫu). Việc quan sát chi tiết của vật rắn như: lệch mạng, các sai hỏng,được giải thích theo cơ chế tương phản nhiễu xạ. Nguyên lý hoạt động của TEM được minh họa trong Hình 2.8. Hình 2.8. Sơ đồ khối kính hiển vi điện tử truyền qua Cơ chế tương phản nhiễu xạ ở ảnh TEM: Điện tử đi vào mẫu gặp các nguyên tử, bị tán xạ, nguyên tử số Z của mẫu càng lớn, phần tán xạ càng mạnh, phần truyền thẳng càng yếu. Mặt khác, khi điện tử đi qua chỗ dày gặp nhiều nguyên tử hơn là đi qua chỗ mỏng. Một trong những ưu điểm của TEM là có thể dễ dàng điều khiển thay đổi tiêu cự (bằng cách thay đổi dòng điện kích thích vào thấu kính) nên có thể thay đổi tiêu cự của kính phóng để trên màn có ảnh hiển vi 32 hay ảnh nhiễu xạ, nhờ đó mà kết hợp biết được nhiều thông tin về cấu trúc, cách sắp xếp các nguyên tử của mẫu nghiên cứu. Hơn nữa, có thể dùng diafram đặt ở vị trí thích hợp để che bớt các tia tán xạ, chỉ lấy các tia đi giữa, đó là c