Luận văn Chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng phƣơng pháp chỉ thị phân tử cho vùng ven biển đồng bằng Sông Hồng

trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó. Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection = MAS) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau: a. Kiểu gen của các lôcút chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: Tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể. b. Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế. c. Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn. d. Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 20 phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai. e. Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp. Ngày nay, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một phương tiện hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết. Sự phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi những cá thể quan tâm trong số vô vàn các cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình. Phương pháp này còn có thể giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một genôm đích. Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống với các ưu điểm sau: - Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 21 - Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc). - Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều lôcut trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau. - Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả, nếu không muốn nói là không thể được. Nhưng nếu ta áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử, ta có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt. Phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) là sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với lôcut gen đích để xác định các cá thể mang gen trong quần thể phân ly thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình. Bằng phương pháp này cho phép tạo được giống mới mang một hay một vài tính trạng mong muốn một cách nhanh chóng và chính xác. Nhược điểm của phương pháp MAS là giống mới được tạo ra không còn giữ được đặc tính quý của giống ban đầu. Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) có thể khắc phục được nhược điểm này. Với mục tiêu chuyển một tính trạng đặc biệt vào một giống cây trồng. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại là phát triển tiềm năng của lai trở lại trong nghiên cứu và du nhập gen đích vào giống nhận gen. Bằng phương pháp này, chỉ cần chọn lọc đến thế hệ BC3 thì có thể chọn lọc được cá thể mang gen đích và có nền di Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 22 truyền đạt 99.6 - 100% hệ gen của cây nhận gen. Từ đó có thể thấy rằng đây là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển lôcut gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống đồng thời rút ngắn quá trình chọn lọc. Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại có ba bước sau: * Bước thứ nhất: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus hay gen đích để chọn lọc trực tiếp lôcut hay gen tính trạng đó từ các cá thể trong quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2. * Bước thứ hai: Sử dụng chỉ thị phân tử quanh vùng locus gen, chọn lọc cá thể tái tổ hợp mang gen đích, giảm tối thiểu các locus gen không mong muốn quang vùng gen đích. Bước này còn gọi là chọn lọc tái tổ hợp (recombinant selection). * Bước thứ ba: Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, không liên kết với gen đích trên 12 nhiễm sắc thể để chọn lọc cá thể có nền di truyền lớn nhất của giống nhận gen. Bằng phương pháp này có thể giảm ít nhất là 2 nhưng có thể 3 thậm chí là 4 thế hệ lai lại so với chọn lọc lai lại truyền thống. Những năm gần đây, IRRI đã sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) và đã thành công trong việc chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng việc chuyển QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm trên nhiễm sắc thể số 1 vào ba giống lúa trồng đại trà. Kết quả đã tạo được một số dòng triển vọng như: IR72046-B-R-8-3-1-3, IR52713-2B-8-2B-1-2, IR77674-3B-8-2-2-8-3-AJY5, IR45427-2B-2-2B-1-1, IR55179-3B-11-3, IR64197-3B-3-1, IR74099-3R-3-3, IR66946-3R-178-1-1 (FL478). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 23 Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) chuyển gen chịu mặn vào giống lúa trồng đại trà trong sản xuất, với phương pháp này chỉ mất ba năm trong khi phương pháp truyền thống có thể tới 10 đến 15 năm [12]. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là kỹ thuật hiệu quả, rút ngắn thời gian và rẻ tiền so với phương pháp chọn giống truyền thống. Bởi vì, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá thể trong quần thể. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể sử dụng một lượng lớn chỉ thị để kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ. Từ đó có thể kiểm soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể. Kiểm tra theo phương pháp đó kết hợp lai trở lại 2 đến 3 thế hệ là có thể thu được cá thể với nền di truyền của dòng mẹ và mang gen chuyển. Các dòng này có thể cho tự thụ, thu hạt để làm thí nghiệm thử nghiêm trên đồng ruộng. 1.2.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nƣớc Việt Nam có đường bờ biển 3.620 km nằm trải dài từ Bắc vào Nam, hiện tượng xâm thực của nước biển ngày càng trở lên nghiêm trọng làm ảnh hưởng đến năng suất cây trồng nông nghiệp đặc biệt là cây lúa, một cây trồng chủ đạo trong nền nông nghiệp của nước ta. Gần đây, phong trào nuôi tôm nước mặn kết hợp trồn 0,3-0,4% thậm chí có nơi cao hơn cả chục lần. Theo báo cáo của Cục Thủy lợi - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn bằng sông Hồng lên cao và xâm nhập vào trong nội địa từ 30 - 40km làm cho diện tích nhiễm mặn lên tới 100.000ha ở một số tỉnh: Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá. Hơn nữa nghề trồng lúa ở vùng nhiễm mặn đang phải đối mặt với những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 24 tác động của sự biến đổi khí hậu. Theo báo cáo về chỉ số rủi ro khí hậu toàn cầu năm 2010 do tổ chức Germanwatch công bố tại Đan Mạch thì Việt Nam là một trong 10 quốc gia bị thiệt hại nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra; các quốc gia khác đó là: Bangladesh, Myanma, Honduras, Nicaragoa, Haiti, Ấn Độ, Cộng hòa Đôminica, Philippines và Trung Quốc. Theo kết quả nghiên cứu và dự báo của Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên hiệp quốc (IPPC) và Ngân hàng Thế giới thì trong vòng 100 năm tới, nước biển sẽ dâng 1m, nhiệt độ sẽ tăng thêm 20C. Nếu nước biển dâng cao 1m thì vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ có 1,5 -2 triệu ha đất nông nghiệp bị ngập nước; còn ở vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có 1.668 km2 đất bị ngập, trong đó có khoảng 0,3-0,5 triệu ha đất chủ yếu là đất lúa bị ngập. Sự biến đổi khí hậu ở nước ta cũng làm gia tăng thiên tai khiến năng suất cây trồng giảm, ước tính nếu tăng thêm 10C thì năng suất lúa giảm 10% [20]. Trước những biến đổi nghiêm trọng đó, trồng các giống lúa chống chịu tốt với mức nhiễm mặn cao sẽ là giải pháp để khắc phục các hiện tượng trên. Các biện pháp như xây dựng công trình thủy lợi bao đê ngăn mặn, hay bón các loại phân hữu cơ vào đất (bón vôi, thạch cao để cải thiện cấu trúc đất, cày sâu cải thiện tính thoát nước tốt nhằm giảm đóng váng trên mặt đất) thường tốn kém và hiệu quả không cao. Nhiều giống lúa chống chịu mặn như OM732, OM861,OM1314, OM 1490, OM2031, OM1314, OM576, IR42, OM344, OM924, Trắng Điệp, Móng Chim Rơi, Móng Chim, Nếp Áo Già, Nếp Bờ Giếng, Nàng Quốc Đỏ, Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, TD2, CM1, CM5 M6, MT6, MT163, BM9855, BM9820, BM9830.v.v. đã được triển khai ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long và Sông Hồng [2], [3], [9], [8]. - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 25 : lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân Hương, Tam Sắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nàng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng Co đỏ, Bảy Dảnh, Một Bụi. Giống FRG67, có nguồn gốc từ Pakistan cho năng suất cao, chống ch [8]. Diện tích đất mặn nhiều và tập trung nhất ở nước ta là đồng bằng sông Cửu Long, vào khoảng 0,7 triệu ha [4]. Các nhà chọn giống lúa Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã đánh giá 418 giống lúa địa phương trong điều kiện mặn với độ dẫn điện EC: 6 – 12 dS/m đã thu được 44 mẫu giống lúa chống chịu tốt, trong đó có các giống điển hình: Nàng co đỏ, Sóc nâu, Đốc đỏ, Đốc phụng, Trái mây, Cà đung trắng. Đó là những mẫu giống cho gen mục tiêu để cải tiến giống lúa chịu mặn có hiệu quả [5]. Nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ (1997) cho thấy, ở nồng độ muối EC = 10dS/ : Nếp Áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim Rơi và Nếp Bờ Giếng [6]. Theo Ngô Đình Thức (2006) đã 172 giống lúa mùa địa phương và cao sản ở giai đoạn nẩy mầm với 1,5% NaCl và giai đoạn mạ với EC = 12dS/m cho thấy có 8 giống lúa mùa địa phương chống chịu mặn cấp 3, tương đương với giống Pokkali là Nàng Quốc Đỏ, Canh Nông Lùn, Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, Trắng Điệp, TD2. Hai giống lúa trung mùa chống chịu tốt với mặn tương đương với giống Pokkali là Thần Nông Đỏ và OM1352-5. [9] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 26 Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các giống lúa CM1, CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [1]. Tuy nhiên phần lớn các giống lúa có khả năng chịu mặn tốt thì năng suất lại thấp, tính thích nghi kém. Do đó, hướng lai tạo tập trung vào chuyển gen chống chịu mặn ở giống lúa chịu mặn tốt và một số giống lúa mang đặc tính ưu việt về năng suất, chất lượng đang được phát triển. Thông thường phải mất đến 3 - 4 năm lai tạo để chuyển gen. Ngoài ra, một khó khăn thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn thường được lai chuyển vào các con lai cùng lúc. Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó lai tạo tính trạng chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10 – 15 năm để phát triển một giống lúa mới [12]. Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất nhiều thời gian và không hiệu quả. . Năm 2000, Vương Đình Tuấn và cs đã xác định được 3 chỉ thị RFLP đó là: R1928, R674 và G257 liên kết với các QTL điều khiển tính chịu mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6 và 11[10]. Bùi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 27 Chí Bửu và cs. ,(2000) đã xác định được chỉ thị RM223 liên kết với gen chịu mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 [2]. Tác giả Nguyễn Thị Lang và cộng sự (2008), nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy túi phấn, đã tạo ra được 72 dòng lúa bằng nuôi cấy túi phấn trong nhà lưới. Từ kết quả thanh lọc mặn ở giai đoạn mạ thông qua các dữ liệu marker SSR với primer RM 223 sử dụng trên 72 dòng, kết quả, các băng hình thu được có sự phân tách giữa giống chống chịu và giống nhiễm với kích thước phân tử có chiều dài nằm trong khoảng 140 - 160bp. Các dòng lúa tái sinh qua nuôi cấy túi phấn: C53/Đốc Phụng - 17, C53/Đốc Phụng - 19, C53/Pokkali - 5, C53/Pokkali - 11, C53/Pokkali - 27, C53/Pokkali - 42, C53/Pokkali - 43, C53/Pokkali - 44, C53/D51 - 4, C53/D51 - 5 và C53/D51 - 8 là các dòng có khả năng chống chịu tốt với điều kiện mặn [7]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 28 Chƣơng 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Giống lúa FL478: Là giống chịu mặn nhập từ Viện lúa Quốc tế IRRI. Thông qua dự án hợp tác: “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt Nam” do chính phủ Đan Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012. - Giống lúa TL 6 là giống lúa năng suất cao, thơm, chịu thâm canh khá, chống chịu tốt với một số sâu bệnh hại chính như: Bệnh đạo ôn, khô vằn và bạc lá. Phẩm chất gạo ngon, thơm, cơm mềm, nhưng không dính. Gieo cấy được 2 vụ trong năm, được chọn tạo tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam từ tổ hợp lai BT7 x KD18, nuôi cấy bao hạt phấn ở F1 tiếp tục chọn lọc đến F6 chọn ra được TL 6. Giống TL 6 được Hội đồng Khoa học Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận theo QĐ số 215 /QĐ-TT- CLT ngày 02/10/2008. Hình 2.1. Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol [33] Ghi chú: Bên trái là tên các chỉ thị phân tử, bên phải là vị trí trên NST1; Vùng đỏ QTL/Saltol; vùng gạch chéo: tái tổ hợp.) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 29 - Các chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với gen Saltol trên nhiễm sắc thế số 1: RM3412b, RM493 [33], thông tin chi tiết về chỉ thị phân tử được thể hiện qua bảng 2.1 và hình 2.1 Bảng 2.1. Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1 (Nguồn [45] Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng, sử dụng trong nghiên cứu: o Máy PCR (hãng Eppendorf) o Máy li tâm lạnh (Eppedorf 5810 – R và 2K15 Sigma) o Máy điện di ngang Bio-Rad GT (Anh), máy điện di đứng Bio-Rad o Máy soi gel (T2201, sigma), mặt nạ chắn tia UV (Sigma) o Thiết bị Votex (Genie 2 và MS1 Minishaker) o Nồi hấp thanh trùng (05MBI-160T-3- Nga) o Cân điện tử Sartorious (Đức) o Máy lắc o Lò vi sóng o Micropipet, ống Eppendorf, bình tam giác các loại TT Tên mồi NST Vị trí (Mb) Trình tự mồi thuận/nghịch Nhiệt độ gắn mồi (0C) Kích thƣớc (bp) 1 RM3412b 1 11,6 TGATGGATCTCTGAGGTGTAAAGAGC TGCACTAATCTTTCTGCCACAGC 60 110 2 RM493 1 12,3 GTACGTAAACGCGGAAGGTGACG CGACGTACGAGATGCCGATCC 55 211 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 30 - Các hóa chất sử dụng để chiết ADN, PCR, điện di, thanh lọc mặn...của hãng chuyên dụng thuộc quản lí của phòng Sinh Học Phân Tử-Viện Di Truyền Nông nghiệp: Acrylamide, Ammonium persulfate (APS), Agarose, Bis – acylamide, Boric acid, Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB), Chloroform Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA) 0,5M; pH = 8.0, N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine (TEMED), Sodium dedoxyl sulfat (SDS), Sodium thiosulfates, Tris base 1M; pH= 8.0, Tris HCl 1M; pH = 8.0... 2.2. Địa điểm nghiên cứu Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đường Phạm Văn Đồng, Hà Nội. Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. 2.3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn - Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol. - Đánh giá và trồng thử nghiệm các dòng chịu mặn được chọn tạo bằng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Xác định các dòng chịu mặn triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phƣơng pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen Các giống lúa TL6, FL478 được gieo trồng trên đồng ruộng. Khi thời kỳ cây lúa ra hoa, tiến hành chọn các cây sinh trưởng khỏe, không sâu bệnh để tiến hành lai. 2.4.1.1. Chuẩn bị cây mẹ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 31 - Chọn cây: Chọn cây sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, chuyển cây vào chậu (đã được chuẩn bị trước), cột thẻ ghi tên giống vào cây. Chọn 2-3 bông/tổ hợp lai. Chọn bông đã trổ khỏi bẹ 50–60%. Cẩn thận tách bông được chọn ra khỏi các bông xung quanh, cắt bỏ các bông đã trổ. - Chọn cây lai: loại bỏ những hoa trên (chóp bông) và hoa dưới (gần cổ bông); chỉ giữ lại các hoa có chiều cao bao phấn ở khoảng ½ - ⅓ vỏ trấu (nhìn xuyên qua vỏ trấu). Mỗi bông giữ lại 15-20 hoa tốt, đúng thời điểm để lai. - Cắt vỏ trấu: cắt xiên vỏ trấu, bỏ từ ⅓ - ⅔ vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Không cắt quá thấp sẽ làm tổn thương nhụy cái. Nếu cắt quá cao sẽ khó khử đực và phấn sẽ khó rơi xuống nhụy cái. 2.4.1.2. Khử đực - Dùng mũi nhọn kẹp các túi phấn ra ngoài. Thao tác này phải làm rất cẩn thận để tránh thiệt hại đến nhụy cái (6 túi phấn phải được loại bỏ bao bông lúa) - Sau khi khử đực, bao bông lúa lại bằng bao giấy bóng mờ (trên bao giấy bóng mờ ghi ngày khử đực, tên người khử đực), để giữ bông cho chặt 2.4.1.3. Chọn cây bố - Chọn bông từ những cây đại diện, tốt, có nhiều hoa sẽ nở, hoa ở chóp bông đã tung phấn. Cắt bông lúa có độ dài thích hợp, cắt bỏ lá cờ. Cột các bông lúa cùng cây cha lại và gắn các thẻ ghi vào bó bông. Mang các bông từ ruộng vào nơi thụ phấn. - Đặt các bông vào chậu nước, nơi ít gió, dễ di chuyển. Sắp xếp các bông để rút bất cứ bông nào mà không ảnh hưởng đến bông khác 2.4.1.4. Thụ phấn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 32 - Quan sát kỹ các bông, khi nào túi phấn vươn ra khỏi vỏ trấu của cây cha phải thụ phấn ngay khi hoa nở, càng nhanh càng tốt, tận dụng thời gian thụ phấn nhiều nhất. - Lấy bao giấy ra khỏi bông cây mẹ (TL6), rút một bông của cây cha (FL478) đang nở rắc lên các bông cây mẹ đã khử đực. Bao bông cây mẹ lại sau khi thụ phấn. Xếp cạnh miệng bao, dùng kẹp giấy kẹp vào trục bông để giữ bông cho chặt (ghi rõ cây cha được thu phấn cho cây mẹ và ngày thụ phấn) 2.4.2. Phƣơng pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) Những chỉ thị di truyền liên kết chặt với các gen được sử dụng để chọn lọc các cá thể ngay ở giai đoạn sớm mà không phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Trong nghiên cứu này, đã tiến hành xây dựng mô hình sàng lọc trong các thế hệ chọn giống như sau: Bước 1: Lai tạo tổ hợp F1 - Các dòng bố mẹ được lựa chọn là cây nhận QTL/Saltol (TL6) sẽ được lai tạo với giống cho QTL/Saltol (FL478). - Khi hai giống lúa cùng trỗ bông, tiến hành thực hiện phép lai hữu tính, để tạo thế hệ F1. Bước 2: Tạo thế hệ BC1F1, - Các tổ hợp lai F1 được lai trở lại với giống nhận QTL/Saltol (TL6) để tạo quần thể BC1F1 - Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, liên kết chặt với QTL/Saltol để xác định các cá thể mang gen trong quần thể BC1F1 Bước 3: Tạo cây BC1F2, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 33 - Để tạo các cây BC1F2 , các cây BC1F1 tự thụ trong điều kiện nhà lưới. - Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định và chọn lọc các cá thể BC1F2 mang QTL/Saltol đồng hợp tử. - Đánh giá khả năng chịu mặn nhân tạo và khả năng sinh trưởng phát triển của các dòng chịu mặn được chọn tạo. Bước 4: Chọn lọc tạo dòng thuần năng suất và chịu mặn. - Chọn lọc và tạo thuần về các đặc điểm nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất các dòng mang locus gen Saltol chịu mặn trong các thế hệ BC1F3, BC1F4 , - Đánh giá các dòng mang locus gen chịu mặn Saltol trên đồng ruộng. Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp MABC TL6 FL478 X F1 X TL6 BC1F1 Chọn lọc cá thể mang gen bằng chỉ thị SSR  Tự thụ BC1F2 Chọn lọc cá thể mang gen Saltol đồng hợp tử bằng chỉ thị SSR BC1F3  Tự thụ BC1F4  Tự thụ Đánh giá các dòng mang gen chịu mặn Saltol trên đồng ruộng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 34 2.4.3. Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng Các thí nghiệm một nhân tố được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. - Bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng: o Cấy 1 dảnh, mật độ 45 khóm/m2 o Cây cách cây 15cm, hàng cách hàng 18cm o Bón phân, chăm sóc như đại trà. - Đánh giá các chỉ tiêu theo dõi về khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các dòng/giống lúa trên đồng ruộng theo phương pháp nghiên cứu của IRRI, 1980. Các chỉ tiêu theo dõi gồm có: o Thời gian sinh trưởng o Chiều cao cây: đo từ mặt đất đến chóp lá cao nhất theo từng lần lặp lại, đơn vị tính cm. o Chiều dài lá đòng: Đo từ cổ lá đến chóp lá o Độ thoát cổ bông o Chiều dài bông: đo từ cổ bông đến chóp bông lúa trước thu hoạch 3 ngày, đơn vị tính là cm. o Số gié/bông o Số bông/khóm o Tỷ lệ hạt chắc (%) = Số hạt chắc/tổng số hạt x 100 o Tỷ lệ hạt lép (%) = Số hạt lép/tổng số hạt x 100 2.4.4. Phƣơng pháp thử độ mặn nhân tạo * Thanh lọc mặn nhân tạo giai đoạn mạ bằng chậu và dung dịch Yoshida có muối theo phương pháp đề xuất của IRRI năm 1997. - Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida được thể hiện ở bảng 2.2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 35 Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976) Nguyên tố Hoá chất Lượng cần (g/2L dd mẹ) Macronutrient N Ammonium nitrate (NH4NO3) 365,6 P Sodium phosphate, monosasic monohydrate (NaH2PO4.H2O) 142,4 K Potassium sulfate (K2SO4) 285,6 Ca Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O) 469,4 Mg Magensium sulfate, 7- hydrate (MgSO4.7H2O) 1.296,0 Micronutrient Hoà tan làn lượt từng nhóm chất với 2L nước cất, sau đó thêm 200 ml H2SO4 cuối cùng lên thể tích đầy đủ. Mn Mangannuos chloride, 4-hydrate (MnCl2.4H2O) 6,000 Mo Ammonium molybdate, 4-hydrate [(NH4)6MoO24.4H2O] 0,296 Zn Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O) 0,140 B Boric acid (H3BO3) 3,736 Cu Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O) 0,124 Fe Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O) 30,800 C Citric acid, monohydrate (C6H8O7.H2O) 47,600 Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối, 3 lần nhắc lại với công thức EC= 12 dS/m(6g/l Nacl). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 36 - Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng được chọn tạo được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, có lặp lại trong điều kiện pH = 5, với công thức có bổ sung muối (NaCl) vào dung dịch Yoshida là 6‰. NaCl tương đương với độ dẫn điện EC=12dS/m. - Vật liệu nghiên cứu: o Sử dụng giống Pokkali (giống chịu mặn có nguồn gốc từ Ấn độ, làm đối chứng) o Giống IR29 (giống mẫn cảm có nguồn gốc từ IRRI) o Giống TL6 o Các dòng triển vọng - Trước khi tiến hành thử nghiệm khả năng chịu mặn, tiến hành xử lý hạt giống bằng cách đặt trong lò đối lưu ở 500C trong 3 ngày để phá ngủ cho giống tránh tác động ảnh hưởng của sự ngủ nghỉ đến khả năng nảy mầm của hạt. - Sau thời gian phá ngủ (3 ngày), tiến hành đem hạt đã khử trùng cho vào đĩa Petri với giấy thấm ẩm, đặc trong tủ thúc mầm ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ. - Khi hạt đã nảy mầm, tiến hành gieo hạt vào các hốc của phao cấy. Cây mạ con sinh trưởng, rễ có thể xuyên qua lớp lưới xuống dung dịch bên dưới. Để hạt có thể làm quen với môi trường, đồng thời tránh gây bất kỳ tổn hại nào đến hệ thống r