Luận văn Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật

tốt nhất, đồng thời cũng có hệ số tương đồng di truyền cao nhất (97%) được xếp vào cùng một nhóm [34]. Cây ăn quả cũng là một trong những thế mạnh của nông nghiệp Việt Nam. Tuy nhiên, chất lượng các giống cây khác nhau cũng như chất lượng của cùng một loại cây ở các vùng sinh thái khác nhau lại có sự khác biệt. Vì vậy, nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các giống cây trong cùng vùng sinh thái và giữa các giống cây khác nhau trong cùng một loài nhằm tìm ra loại cây và điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của chúng là vấn đề quan trọng. Trong lĩnh vực này, chúng ta đã đạt được một số kết quả như: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các giống nhãn trồng ở Việt Nam của tác giả Nguyễn Văn Thiết, Lê Thị Lan Oanh (2001) [33]; sử dụng kĩ thuật RAPD và AFLP để nghiên cứu quan hệ di truyền của 2 giống vải thiều và vải chua của Nguyễn Thị Dung và cs (2005) [9], sử dụng dấu chuẩn RAPD để nhận dạng 1 số giống chuối trồng ở Việt Nam (Nguyễn Xuân Thụ, Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Dung (1998)) [34], đánh giá đa dạng nguồn gen xoài Việt Nam (Mangifera) bằng kĩ thuật RAPD (Nguyễn Ngọc Huệ, Trần Danh Sửu, Trịnh Hồng Kiên (2005)) [16]. Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và DNA lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xây dựng vườn giống cây cóc hành, Nguyễn Việt Cường, Phạm Đức Tuấn (2007) đã tiến hành nghiên cứu 40 dòng cây trội cóc hành (Azadirachta excalsa) được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn ở 6 xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Ái thuộc tỉnh Ninh Thuận. Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên gồm OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 và 2 mồi lục lạp gồm rnH - trnK và atpB - rbcL. Kết quả, các dòng cóc hành được nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền thấp mặc dù các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 15 - cây trội được chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có khoảng cách về không gian khá xa. Có 6 cặp cóc hành có hệ số tương đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981 là cặp X32 và X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37. Các dòng cóc hành có quan hệ di truyền gần gũi cần loại khi xây dựng vườn giống là X11, X22, X35, X37, X43, X43, X50. Đây là kết quả nghiên cứu bước đầu về đa dạng di truyền (mới sử dụng 6 mồi RAPD và 2 mồi lục lạp) [7]. Dẻ là cây trồng rừng chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía bắc như Cao Bằng, Bắc Giang, Lào Cai, Sơn La… Hiện đã có một số công trình nghiên cứu về cây dẻ trên các phương diện khác nhau như: nghiên cứu thực trạng và giải pháp chủ yếu nhằm phát triển sản xuất hạt dẻ ở tỉnh Cao Bằng của Ngô Xuân Hoàng (2008) [14], nghiên cứu cơ sở phân loại họ dẻ - Fagaceae Durmort ở Việt Nam của Nguyễn Tiến Bân [4]. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có công trình nào nghiên cứu về việc nhân giống in vitro cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng và mối quan hệ di truyền giữa các giống dẻ bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 16 - Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Ba mẫu hạt dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng thu hoạch tại các địa điểm khác nhau của huyện Trùng Khánh - Cao Bằng vào tháng 9 - 10 năm 2008. Hạt dẻ thu tại Vân Nam - Trung Quốc tháng 11/2008 Hạt dẻ gai thu tại Yên Thế - Bắc Giang tháng 11/2008 A B 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Hình 2.1. Các mẫu lá dẻ được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử thu được từ 5 mẫu hạt dẻ A: Mặt trước lá B: Mặt sau lá 1. Dẻ Trung Quốc 2, 3, 4. Ba mẫu dẻ Trùng Khánh 5. Dẻ Bắc Giang 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 2.1.2.1. Hoá chất và thiết bị nuôi cấy mô Các dụng cụ và hoá chất cần thiết để thực hiện quá trình nuôi cấy do phòng Công nghệ tế bào, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp. * Dụng cụ Buồng cấy vô trùng (Bioiogical safety Cabinets) Nồi hấp khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy - Nhật Bản Cân điện tử của Đức Máy đo pH Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 17 - Tủ sấy Bình tam giác có kích thước từ 250ml - 500ml, pipet loại 1ml, dụng cụ nuôi cấy... * Hoá chất Hoá chất pha môi trường WPM gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng, kích thích sinh trưởng, đường sucrose, thạch agar, nước dừa.v.v. Thành phần hoá chất của môi trường WPM dành cho cây thân gỗ được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Thành phần cơ bản môi trường WPM (Lioyd và Mc Cown, 1980) STT Thành phần Nồng độ (mg/l) STT Thành phần Nồng độ (mg/l) WPM1 11 CoCl2.6H2O 8,6 1 KH2PO4 170 12 CuSO4.5H2O 0,25 2 K2SO4 990 13 Na2MoO4.2H2O 0,25 3 MgSO4.7H2O 370 WPM 4 4 NH4NO3 400 14 FeSO4.7H2O 27,8 WPM 2 15 Na2EDTA 37,3 5 CaCl2 96 WPM 5 6 Ca(NO3)2.4H2O 550 16 Glicin 2,0 WPM 3 17 Thiamine HCl 1,0 7 H3BO3 6,2 18 Pyridoxin HCl 0,5 8 KI 6,2 19 Nicotic acid 0,5 9 MnSO4.4H2O 22,3 20 Mio - inositol 100 10 ZnSO4.7H2O 8,6 21 Agar 8,5 g/l 22 Sucrose 20-30 g/l * Phƣơng pháp pha chất kích thích sinh trƣởng Chất kích thích sinh trưởng thường pha với một lượng ít vì các chất này khi ở dạng dung dịch khó bảo quản. Trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã sử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 18 - dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin (Kinetin và BAP) và chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (α - NAA). Các chất kích thích sinh trưởng này được pha với nồng độ như sau: 1. BAP (6 - Benzynaminopurne) C12H11N5 Sử dụng dung dịch NaOH 1N một lượng vừa đủ để làm tan BAP. Sau đó pha tới nồng độ 0,5mg/ml với nước cất. Sau khi pha, hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ 0oC - 5oC. 2. Kinetin (6 - Furfurylaminopurine) C10H9N2O Sử dụng dung dịch NaOH 1N một lượng vừa đủ để làm tan kinetin. Sau đó pha tới nồng độ 0,2mg/ml với nước cất. Sau khi pha, hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ 0oC - 5oC. 3. α - NAA (α - naphtyl axetic acid) C11H10O2 Làm tan NAA trong cồn tuyệt đối cùng với NaOH 1M. Sau đó pha tới nồng độ 0,5mg/ml với nước cất. Sau khi pha, hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ 0oC - 5oC. 2.1.2.2. Hoá chất và thiết bị thực hiện kỹ thuật RAPD * Thiết bị: Máy đo quang phổ Dio Array Spectrophotometer (Mỹ) Máy li tâm Avanti™30 Máy PCR - Thermal Cycler PTC 100. * Hoá chất Các mồi sử dụng trong phản ứng RAPD bao gồm 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phân tích RAPD genome của dẻ gai Bắc Giang, dẻ có nguồn gốc từ Vân Nam - Trung Quốc và 3 mẫu dẻ thu tại Trùng Khánh - Cao Bằng. Trình tự các mồi dài 10 nucleotid. Thông tin về trình tự các mồi được trình bày trong bảng 2.2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 19 - Bảng 2.2. Trình tự các nucleotid của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi DTN1 5’AACCGACGGG 3’ TN03 5’GGGAAGGACA 3’ DTN2 5’GAAACACCCC 3’ TN07 5’CCAGACCCTG 3’ OPM5 5’GCCACGGAGA 3’ DTN5 5’CGCTGTGCAG 3’ APR08 5’CTGCTGGGAC 3’ OPQ02 5’CCGCGTCTTG 3’ OCN6 5’GGGGGTCGTT 3’ DHN04 5’GGAAGCCAAC 3’ 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu nuôi cấy mô - tế bào 2.2.1.1. Phƣơng pháp pha môi trƣờng nuôi cấy - Nguyên tắc: Pha môi trường đặc với thành phần và nồng độ các chất phù hợp. Môi trường là WPM có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin, tất cả các hoá chất tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là agar để làm giá đỡ, yêu cầu không quá lỏng cũng không quá rắn để cấy mẫu được dễ dàng. Ngoài ra, chúng tôi còn bổ sung nước dừa vào môi trường để tăng nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây. Khử trùng môi trường theo phương pháp khử trùng Pasteur. Dụng cụ pha môi trường được rửa sạch, sấy khô. - Các bước tiến hành: Sau khi xác định được công thức cần pha, tính thể tích các hoá chất trong môi trường nuôi cấy. Ví dụ, môi trường nhân chồi dẻ có công thức WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + BAP 0,5mg/l + nước dừa 200ml/l, có thể tiến hành theo các bước sau: (1) Đong khoảng 650 ml nước cất đặt lên bếp điện đun sôi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 20 - (2) Dùng pipet hoặc ống đong lấy các dung dịch WPM với nồng độ WPM1: 20ml/l; WPM2: 20ml/l; WPM3: 5ml/l; WPM4: 5ml/l; WPM5: 5ml/l. Cho tất cả vào 1 cốc thuỷ tinh sạch. (3) Bổ sung 1ml BAP vào cốc dung dịch trên. (4) Cân 20g đường sucrose và 8,5g thạch agar. (5) Khi nước sôi, cho đường vào khuấy tan rồi đổ agar vào khuấy đều và đun sôi cho tan hết. (6) Bổ sung hoá chất đã chuẩn bị ở cốc thuỷ tinh. (7) Định lượng dung dịch trên bằng nước cất đến 1000 ml. Điều chỉnh pH bằng máy chuẩn pH sao cho pH đạt 5,7 - 5,8. (8) Chia đều vào các bình tam giác mỗi bình khoảng 75ml. Sau đó nút bông và đóng bằng nắp giấy đậy kín. (9) Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 120 - 121oC, thời gian 20 phút, áp suất 1 - 1,2atm. Sau khi khử trùng, để môi trường ổn định sau 1 - 2 ngày có thể sử dụng. 2.2.1.2. Phƣơng pháp khử trùng mẫu hạt dẻ và đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy * Mục đích: Thu được vật liệu sạch phục vụ cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo. * Các bƣớc tiến hành: Mẫu hạt nuôi cấy được làm sạch bằng cách: + Khử trùng hạt ngoài buồng nuôi cấy: Hạt đã được bóc hết 2 lớp vỏ cứng và vỏ gai được cắt bỏ bớt phần thịt hạt không chứa mầm. Rửa sạch bằng nước cất, sau đó rửa sạch bằng xà phòng và tráng lại bằng nước cất. + Khử trùng hạt trong buồng cây: Hạt được đưa vào môi trường nuôi cấy vô trùng, tiếp tục được khử trùng bằng javen và cồn với thời gian khác nhau. Chúng tôi sử dụng cồn 70o trong thời gian 2 phút, 5 phút, 7 phút, 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 21 - phút và javen 65% trong 20 phút và 25 phút. Sau đó, tráng lại hạt 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng. Thấm khô hạt bằng giấy thấm đã khử trùng. Mẫu hạt đã làm sạch được cấy vào các bình tam giác trong buồng cấy đã được khử trùng bằng tia cực tím. Công thức môi trường cấy gây được sử dụng là: WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l. Theo dõi tỉ lệ hạt nảy mầm tỉ lệ hạt nhiễm và chết sau 4 tuần. Những hạt nảy mầm được chăm sóc và theo dõi đến khi mầm dài 5cm - 7cm có thể chuyển sang môi trường nhân chồi. 2.2.1.3. Phƣơng pháp nhân chồi Mục đích: Thăm dò và xác định ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi. Cách tiến hành: Các chồi có kích thước từ 5cm - 7cm thu được trên môi trường cấy gây được chuyển sang môi trường nuôi cấy đối chứng (không bổ sung chất kích thích sinh trưởng, chỉ có WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200 ml/l) và môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l + kích thích sinh trưởng). Các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung vào môi trường với nồng độ như sau: BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,5mg/l), tổ hợp BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l) + kinetin (0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,3mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l), tổ hợp BAP (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l) + NAA (0,05mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l). Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về các chỉ tiêu: tỉ lệ mô tạo chồi, số chồi/mô, chiều cao và màu sắc chồi. Kết quả được phân tích trên phần mềm exel và đánh giá dựa trên số liệu thu được. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 22 - 2.2.1.4. Phƣơng pháp tạo cây hoàn chỉnh Các chồi có kích thước từ 5cm - 7cm được cắt thành các đoạn khoảng 2cm - 3cm và chuyển sang môi trường tạo rễ. Thành phần môi trường gồm có: WPM + đường sucrose 25g/l+ agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l+ α - NAA (0,05mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l). Theo dõi, thu thập số liệu và phân tích kết quả về các chỉ tiêu: tỉ lệ cây tạo rễ, số rễ/cây và kích thước rễ trong 8 tuần. 2.1.1.5. Phƣơng pháp đƣa cây ra ngoài môi trƣờng tự nhiên Đây là khâu cuối cùng của quy trình nhân giống bằng phương pháp in - vitro nhằm tìm giá thể tốt nhất cho cây dẻ để đưa chúng ra môi trường tự nhiên. Chúng tôi đã thử nghiệm trồng cây dẻ con trên 3 loại giá thể là đất, trấu hun, và hỗn hợp đất + trấu hun. Theo dõi và chăm sóc trong 8 tuần, thu thập số liệu và phân tích đánh giá kết quả. 2.1.1.6. Phƣơng pháp tính toán kết quả Sau khi tiến hành nuôi cấy và theo dõi kết quả, số liệu thu thập được được phân tích trên phần mềm exel của Chu Văn Mẫn [20] các giá trị thống kê về giá trị trung bình ( X ), sai số trung bình mẫu (mx)... 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kĩ thuật RAPD 2.2.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA Nguyên tắc: Tách được DNA ra khỏi các sản phẩm của tế bào và chiết xuất DNA đảm bảo giữ nguyên cấu trúc và độ tinh sạch. Tiến hành: Lá của 5 mẫu dẻ được thu thập, bảo quản lạnh ở - 85oC, tách chiết và tinh sạch DNA theo phương pháp của Doyle J.J có cải tiến [40], gồm các bước sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 23 - - Cân 200mg mẫu lá non cho vào ống eppendorf 2 ml. - Cho nitơ lỏng vào ống eppendorf có chứa mẫu lá. Nghiền bằng đũa thủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn. - Bổ sung 800µl đệm tách DNA, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ trong 60 phút ở 650C. - Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Bổ sung 800µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (24:1), đảo đều. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút để phân tách thành 2 pha, hút cẩn thận dịch nổi cho vào ống eppendorf mới. - Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1), đảo nhẹ. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi (hoặc vớt kết tủa DNA). - Rửa DNA hai lần bằng ethanol 80%. - Làm khô DNA bằng máy Speed - Vac hay ở nhiệt độ phòng. - Hoà tan DNA trong 300µl TE 1X. - Bổ sung 1µl RNase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 30 phút. - Thêm 10µl Sodium acetate 3M đảo nhẹ. - Bổ sung 2,5 thể tích ethanol tuyệt đối, đảo nhẹ để ở - 200C ít nhất 1 giờ. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi. - Rửa DNA hai lần bằng ethanol 80%. - Hoà tan DNA trong 300µl TE 1X, giữ ở -200C đến khi sử dụng. DNA sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, xác định hàm lượng trên máy đo quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10 ng/μl. 2.2.2.2. Phản ứng PCR - RAPD Mỗi ống phản ứng PCR có 25μl dung dịch chứa 1X đệm PCR; 2,5mM MgCl2; 100μl 4 dNTPs; 200nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymerase và 10ng DNA khuôn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 24 - Phản ứng PCR - RAPD thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt: Bước 1: 94oC trong 3 phút; Bước 2: 92oC trong 1 phút; Bước 3: 35oC trong 1 phút; Bước 3: 72oC trong 1 phút, từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì; Bước 5: 72oC trong 10 phút; Bước 6: giữ ở 4oC. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel. 2.2.2.3. Phân tích số liệu Phân tích số liệu theo quy ước: 1 = phân đoạn đa hình xuất hiện và 0 = phân đoạn đa hình không xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên. Xác định hệ số di truyền giống nhau theo phương pháp của Nei Và Li (1979) - hệ số Jacar [41]. cba a Sij   2 2 Trong đó: Sij: Hệ số giống nhau giữa 2 cá thể a: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở cả 2 cá thể i và j b: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j c: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở j và không xuất hiện ở i Phân tích đánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo 3 phương pháp: SM, Dice and Jaccard và 4 phương pháp phân nhóm UPGMA (phân tích các nhóm phân tử không cùng trọng lượng), WPGMA (phân tích các nhóm phân tử có cùng trọng lượng), liên kết hoàn toàn (complete linkage), liên kết đơn lẻ (single linkage). Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị phân tích của giá trị tương quan kiểu hình cao nhất trong chương trình NTSYS 2.1. Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi cặp mồi xác định theo công thức: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 25 - PICi = 1 - ∑P1 2 Trong đó: Pi là tần số của alen i của kiểu gen được kiểm tra Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 26 - Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá mối quan hệ di truyền giữa một số mẫu dẻ bằng kĩ thuật RAPD 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA từ lá các mẫu dẻ DNA được tách chiết và tinh sạch. Sau đó, kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm lượng thông qua máy đo quang phổ hấp thụ ở các bước sóng 260nm và 280nm. Đồng thời, các mẫu DNA cũng được điện di trên gel agarose 0,8% để đánh giá độ tinh sạch và chất lượng DNA. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.1 và hình 3.1. Bảng 3.1. Hàm lượng và độ tinh sạch DNA của 5 mẫu dẻ nghiên cứu Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu dẻ trên gel agarose 0,8% Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, DNA được tách từ các mẫu lá dẻ có hàm lượng dao động từ 798,8µg/ml đến 1143,7µg/ml, băng vạch sắc nét, không bị đứt gãy. Độ tinh sạch thể hiện ở tỉ lệ OD260/OD280 đạt từ 1,79 - Tên mẫu Hàm lượng DNA (μg/ml) Tỉ số OD 260/280 TK1 789,8 1,87 TK2 852,5 1,83 TK3 1143,7 1,92 BG 954,3 1,79 TQ 887,5 1,86 TK1 TK2 TK3 BG TQ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 27 - 1,92. Như vậy, chất lượng DNA đảm bảo tiêu chuẩn để tiến hành các phản ứng PCR - RAPD. 3.1.2. Kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR - RAPD Sau khi tách chiết, tinh sạch và pha về nồng độ chuẩn cho các phản ứng PCR, DNA của 5 mẫu dẻ đã được phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC, khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây. Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8% để phân tích tính đa hình DNA của 5 mẫu dẻ nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên có kí hiệu là DTN1, DTN2, OPM5, APR08, OCN6, TN03, TN07, DTN5, OPQ02, DHN04 để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu dẻ. Bảng 3.2. Đa hình về phân đoạn DNA được nhân bản của 10 mồi ngẫu nhiên Tên mồi Số phân đoạn DNA Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình % phân đoạn đa hình DTN1 6 2 4 33,3 DTN2 7 5 2 71,4 OPM5 5 2 3 40,0 PR08 5 2 3 40,0 OCN6 4 3 1 75,0 TN03 6 0 6 0,0 TN07 3 0 3 0,0 DTN5 3 0 3 0,0 OPQ02 2 0 2 0,0 DHN04 5 0 5 0,0 Tổng số 46 14 32 30,4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 28 - Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu dẻ khác nhau trong cùng 1 mồi. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2. Như vậy, tổng số phân đoạn DNA của 5 mẫu lá dẻ khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 46 phân đoạn. Trong đó, chỉ có 14 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 30,4%) và không cho đa hình là 32 phân đoạn (chiếm 69,6%). Trong số 10 mồi nghiên cứu, có tới 5 mồi không cho tính đa hình các phân đoạn DNA. Mức độ đa hình của các mồi dao động từ 33,3% - 75,0% (mồi OCN6 cho tính đa hình cao nhất và thấp nhất là mồi DTN1). Năm mồi còn lại là TN03, TN07, DTN5, OPQ02 và DHN04 không cho tính đa hình (0%). Giá trị PIC được sử dụng khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Số liệu bảng 3.3 phù hợp với tỉ lệ đa hình của các phân đoạn DNA được nhân bản (bảng 3.2). Cụ thể, giá trị PIC của các mồi TN03, TN07, DTN5, OPQ02 và DHN04 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi OCN6 là 0,57 (đa hình cao nhất). Tuy nhiên, giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỉ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn cho biết số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ (bảng 3.3). Bảng 3.3: Hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC) của 5 mẫu dẻ STT Tên mồi Giá trị PIC STT Tên mồi Giá trị PIC 1 DTN1 0,32 6 TN03 0,00 2 DTN2 0,34 7 TN07 0,00 3 OPM5 0,38 8 DTN5 0,00 4 APR08 0,36 9 OPQ02 0,00 5 OCN6 0,57 10 DHN04 0,00 Với 10 mồi ngẫu nhiên được sử dụng cho 5 mẫu dẻ khác nhau cho thấy, có 5 mồi thể hiện sự sai khác về các phân đoạn DNA được nhân bản, 5 mồi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 29 - còn lại không có sự sai khác về các phân đoạn DNA được nhân bản giữa các đối tượng nghiên cứu. Giá trị PIC dao động từ 0,32 đến 0,57. Như vậy, với 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu đã đưa ra được sự khác nhau về độ tương đồng các phân đoạn DNA của 5 mẫu dẻ phân bố ở các khu vực địa lý khác nhau là Trùng Khánh - Cao Bằng, Yên Thế - Bắc Giang và Vân Nam - Trung Quốc. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% của 4 mồi DTN1, DTN2, OPM5 và TN03 được thể hiện dưới đây: Mồi TN03: Trong phạm vi vùng phân tích, thu được tổng số 30 phân đoạn DNA với kích thước nằm trong khoảng 200bp - 2000bp, (mỗi mẫu dẻ nghiên cứu đều thu được 6 phân đoạn DNA). Các phân đoạn DNA được nhân bản của các mẫu dẻ có kích thước hoàn toàn giống nhau (hình 3.2A). Như vậy, sử dụng mồi TN03 không phát hiện được sự sai khác về các phân đoạn DNA đa hình được nhân bản. TK1TK2 TK3 BG TQ M TK1 TK2 TK3 BG TQ M TN03 DTN2 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi TN03 và DTN2 ←1000bp ←250bp ←250bp ←1000bp ←500bp ←20000bp ←500bp A B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 30 - Mồi DTN2: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với mồi DTN2 thu được tổng số phân đoạn DNA của 5 mẫu dẻ là 27 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA thu được dao động trong khoảng 200bp - 1000bp. Trong đó, xuất hiện 5 phân đoạn DNA khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu. Cụ thể, ở kích thước khoảng 600bp, mẫu dẻ BG có phân đoạn DNA được nhân bản các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn này. Ngược lại, ở kích thước khoảng 200bp và 750bp, bốn mẫu còn lại đều có phân đoạn DNA xuất hiện, trong khi đó mẫu dẻ BG không xuất hiện các phân đoạn DNA có kích thước trên (hình 3.2B). Mồi DTN1: Trên phạm vi vùng phân tích thu được 22 phân đoạn DNA (thuộc 6 phân đoạn). Kích thước các phân đoạn dao động trong khoảng 250bp - 1500bp. Trong số 6 phân đoạn xuất hiện trên bảng điện di, có 4 phân đoạn hoàn toàn giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng kích thước 750bp - 1500bp. Mẫu dẻ Bắc Giang có 2 phân đoạn DNA được nhân bản với kích thước khoảng 250bp và 500bp nhưng các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn này (hình 3.3A). TK1 TK2 TK3 BG TQ M TK1 TK2 TK3 BG TQ M DTN1 OPM05 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi DTN1 và OPM5 ←250bp ←500bp ←1500bp ←1000bp ←250bp A B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 31 - Mồi OPM5: Tổng số có 5 phân đoạn DNA xuất hiện và có hai phân đoạn DNA thể hiện sai khác giữa các mẫu nghiên cứu. Kích thước các phân đoạn được nhân bản dao động từ 200bp - 1000bp. Ở kích thước 200bp và 1000bp, mẫu Bắc Giang tiếp tục xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản. Tuy nhiên, bốn mẫu còn lại không thu được hai phân đoạn này. Ở phạm vi kích thước 500bp - 800bp, cả 5 mẫu đều nhân được 3 phân đoạn DNA như nhau (hình 3.3B). Như vậy, điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% đã khẳng định sự khác biệt về phân đoạn DNA được nhân bản của mẫu dẻ Bắc Giang so với bốn mẫu dẻ ở Trùng Khánh và Trung Quốc. 3.1.3. Mối quan hệ di truyền của các mẫu dẻ nghiên cứu Các số liệu PCR - RAPD được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu dẻ nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây. Để kiểm tra phương pháp phân nhóm, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị tương quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ số di truyền giống nhau (phương pháp của Jaccard, của Nei & Li, của Sokal) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ) (bảng 3.4). Biểu đồ hình cây được thiết lập dựa trên giá trị tương quan cao nhất với các giá trị khi r  0,9: tương quan rất chặt, r = 0,8 - 0,9: tương quan chặt, r = 0,7 - 0,8: tương quan tương đối chặt, r  0,7: tương quan không chặt. Bảng 3.4 cho thấy, với ba cách tính hệ số di truyền giống nhau và bốn kiểu phân nhóm phản ánh mối tương quan kiểu hình của 5 mẫu dẻ dao động rất chặt 0,99878 - 0,99943. Trong đó, giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn nhất 0,99943 khi tính theo hệ số di truyển Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Vì vậy, sơ đồ hình cây được thiết lập theo hệ số di truyền giống nhau Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - 32 - Bảng 3.4. Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tương đồng Phương pháp Kiểu phân nhóm UPGMA WPGMA Liên kết hoàn toàn Liên kết đơn lẻ SM 0,99911 0,99911 0,99911 0,99911 Dice 0,99879 0,99879 0,99879 0,99878 Jaccard 0,99943 0,99910 0,99910 0,99909 Kết quả bảng 3.5 cho thấy, 3 mẫu dẻ TK1, TK2 và TK3 thu ở các khu vực khác nhau ở huyện Trùng Khánh - Cao Bằng có mức độ tương đồng đạt 100% khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Điều này cho thấy, các mẫu dẻ TK có độ thuần và độ đồng nhất rất cao. Bảng 3.5. Hệ số tương đồng giữa các mẫu dẻ ng