Luận văn Đánh giá tác động của chế phẩm viên nén từ nhân hạt Neem (Azadirachta Indica A.Juss) lên ngài gạo (Corcyra Cephalonica St.)

chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng không trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng yên (pha tỉnh). Pha tỉnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thông thƣờng là dung môi phân cực, pha động thƣờng là nƣớc hoặc dung môi hữu cơ. Đôi khi pha tĩnh là những chất lỏng ít phân cực lúc đó pha động phải là dung môi phân cực hơn. 2.7.2. Những yếu tố ảnh hƣởng * Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu. * Nguồn cung cấp (điện, khí, nƣớc, hoá chất). * Môi trƣờng (gây nhiễm thêm hoặc mất mẫu, gây ảnh hƣởng sức khoẻ, gây nhiễm bẩn môi trƣờng xung quanh). 2.7.3. Ứng dụng Phƣơng pháp HPLC có khả năng tách các hợp chất đặc thù nhƣ: * Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tƣợng nghiên cứu y học , sinh học. * Các hợp chất tự nhiên không bền. * Các hợp chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ. Ngoài ra phƣơng pháp HPLC còn có những ƣu điểm hơn sắc kí cổ điển nhƣ tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng đƣợc nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector không phá huỷ mẫu. Do có nhiều tính năng ƣu việt nên đƣợc ứng dụng phổ biến trong các lĩnh vực: tách các acid nucleic, tách các dƣợc phẩm, tách các steroid, tách các vitamin, tách các chất bảo quản thực phẩm, tách chất bảo vệ thực vật…. 2.7.4. Các bộ phận chính của máy HPLC . 2.222 2.8. Sơ lƣợc về một số chất phụ gia và bảo quản 2.8.1. Các chất chống oxy hoá giúp tăng cƣờng bảo quản (Antioxydant) Các chất chống oxy hóa phải đảm bảo các điều kiện sau: * Không độc. * Có hoạt tính cao ở nồng độ thấp (0,01 – 0,02 %). * Nằm ở bề mặt phân cách, có tính kỵ nƣớc khá mạnh, tiếp xúc với không khí. * Ổn định với các điều kiện chế biến. Pha độ ng Hệ thố ng chuyể n dung môi Hệ thố ng bơ m mẫ u Cộ t Detector Chuẩ n bị mẫ u Hệ thố ng xử lý dữ liệ u Một số antioxydant quan trọng : BHT, BHA, tocopherol, axit ascorbic… Trong đó BHT, BHA là những chất chống oxy hoá đƣợc sử dụng phổ biến nhất. BHT (butylated hydroxytoluen) có công thức phân tử 2,6 – di – tert – butyl – 4 – methylphenol), là tinh thể màu trắng với mùi khó ngửi, không hoà tan trong nƣớc và propylene glycol nhƣng hòa tan tốt trong cồn. BHT đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân chống oxy hóa, do đó nó đƣợc dùng trong công tác bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm, nguyên liệu đóng gói, nói chung là những sản phẩm có chứa mỡ hoặc dầu. Ngoài BHT, BHA (butylated hydroxyanisole) cũng có chức năng nhƣ BHT. BHT và BHA đƣợc biết là an toàn cho ngƣời và động vật sử dụng. 2.8.2. Các chất hấp phụ Những chất hấp phụ thƣờng đƣợc sử dụng là bột talc, cám gạo, silicagel, than hoạt tính… 2.8.2.1. Talc Talc là 1 loại khoáng sản, có tên là hydrated magnesium sheet silicate với công thức hoá học Mg3Si4O10(OH)2. Một tấm talc gồm hàng ngàn phiến cơ bản chồng lên nhau, phiến cơ bản là sự kết hợp của 1 lớp magnesium-oxygen/hydroxyl octahedra kẹp giữa 2 lớp siliconoxygen tetrahedra, mặt ngoài chính của phiến cơ bản này không chứa nhóm hydroxyl hoặc iôn hoạt động, điều này giải thích cho tính kỵ nƣớc và tính trơ của talc. Có nhiều loại talc, tất cả chúng đều mềm, dẹt, kỵ nƣớc, trơ về mặt hóa học. Trên thực tế talc không hòa tan trong nƣớc, tan yếu trong axit và kiềm, không gây nổ hay gây cháy. Mặc dù rất ít hoạt động về mặt hoá học nhƣng talc lại có một ái lực lớn với các chất hữu cơ. Công dụng của talc: Talc là một phần quan trọng trong cuộc sống hằng ngày, đá lát đƣờng đi, tạp chí chúng ta đọc, sợi polyme, sơn… là một trong những sản phẩm làm từ talc. * Trong nông nghiệp và thực phẩm, talc là tác nhân chống đóng bánh hiệu quả, chống dính trong thực phẩm (kẹo gum), giúp đánh bóng gạo, trong quá trình sản xuất dầu oliu, làm tăng sản lƣợng và sự trong của dầu. * Trong công nghệ sản xuất giấy, làm láng bề mặt giấy. * Sản phẩm chăm sóc cơ thể, do tính mềm và trơ, talc đƣợc dùng nhƣ phấn xoa cơ thể, ngày nay nó đóng vai trò quan trọng trong sản xuất mỹ phẩm, phấn hồng, phấn mắt, xà bông… Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Chế tạo và thử nghiệm chế phẩm dạng viên nén để phòng trị ngài gạo với hoạt chất chính trích từ hạt neem trồng tại Việt Nam, bao gồm các giai đoạn nghiên cứu nhƣ sau: * Hoàn thiện kỹ thuật ép dầu hạt neem và chiết xuất hoạt chất trong bánh dầu neem bằng ethanol. * Định lƣợng ba hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu: azadirachtin, salannin, nimbin. * Tạo chế phẩm dạng viên nén và thử nghiệm chế phẩm trên ngài gạo trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Kỹ thuật ép dầu từ nhân hạt neem và chiết xuất hoạt chất sinh học từ bánh dầu neem Hạt neem thu tại tỉnh Ninh Thuận đƣợc rửa cồn 98o sau đó sấy khô ở nhiệt độ 45 – 50oC. Sau đó sử dụng máy tách vỏ để thu nhân hạt. Nhân hạt neem đƣợc ép dầu bằng máy ép chuyên dụng hiệu Komet của Đức (công suất 10 kg hạt/ giờ). Ƣu điểm của máy là giữ nhiệt độ trong quá trình ép chỉ từ 35 – 40oC. Dầu neem sau khi ép đƣợc giữ ở nhiệt độ 5 – 10oC tránh ánh sáng, thêm chất bảo quản BHT 3 % và tween 5 % tạo thành chế phẩm dầu neem thô, kí hiệu là DN (dầu neem). Bánh dầu neem (phần bã còn lại sau khi ép dầu) đƣợc ngâm với ethanol 98o để tách các hoạt chất còn lại theo tỉ lệ 1: 4 (bánh dầu : ethanol). Sau 24 giờ, dịch chiết thô đƣợc loại dung môi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 60oC. Thu nhận dịch chiết và bảo quản nhƣ dầu neem, gọi là chế phẩm dịch chiết bánh dầu, kí hiệu - DCBD Hình 3.1. Quy trình ép dầu và chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt neem Hạ t neem Tách vỏ V ỏ Nhân hạ t neem Ép dầ u Bánh dầ u Ngâm bánh dầ u Bã neem Cồ n 98 o Dị ch chiế t neem thô Cô quay chân không Cồ n thu hồ i Dị ch chiế t neem (DCBD) Dầ u neem (DN) Cồ n 980 Sấ y 45-500 C Khuấ y, lắ ng, lọ c Chấ t bả o quả n, nhũ hoá Chấ t bả o quả n, nhũ hoá 3.2.2. Định lƣợng các hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu neem Theo schneider và Elmer (1987) việc định lƣơng azadirachtin, nimbin và salannin đƣợc tiến hành nhƣ sau: Mẫu sau khi qua lọc (lỗ lọc = 0,45 µm) đƣợc cho vào ống đựng mẫu có thể tích 1,5 ml, sau đó đựng vào khay đựng mẫu trong máy HPLC (hiệu Hewlett Packard 1090, series 1 – liquid chromatography) và Tiến hành chạy mẫu với các thông số sau: - Lƣợng mẫu bơm vào cột: 0,5 µl. - Cột bảo vệ: BondapakTM C18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 20 mm. - Cột phân tích: BondapakTM C18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 300 mm. - Dung môi rửa cột: CH3CN:H2O (55 – 45); tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút. - Detector DAD, Bƣớc sóng 220 nm. Để xây dựng đƣờng chuẩn của hoạt chất chính cần phân tích, sử dụng azadirachtin chuẩn của công ty Sigma (USA), nimbin và salannin chuẩn của công ty Trifolio GmbH (Germany). Kết quả đƣờng chuẩn nhƣ sau: - Azadirachtin: y = 3,72 x + 34,58; Hệ số tƣơng quan R = 1. - Nimbin: y = 14,49 x + 170,5; Hệ số tƣơng quan R = 0,998. - Salannin: y = 12,634 x + 73,83; Hệ số tƣơng quan R = 1. Trong đó: y - diện tích pick, x - nồng độ hoạt chất (ppm). Định lƣợng hoạt chất trong mẫu thử đƣợc tính tự động nhờ phần mềm chemstation hãng Aligent-technology cho kết quả nồng độ hoạt chất (ppm) có trong mẫu thử. a b c d Hình 3.2. Một số máy móc, trang thiết bị a. Máy tách vỏ b. Máy cô quay chân không c. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao d. Máy ép dầu hạt neem (komet - Đức) 3.2.3. Tạo chế phẩm dạng viên nén với hoạt chất chính là dầu neem và dịch chiết bánh dầu. Chế phẩm đƣợc tạo thành trên cơ sở phối trộn dầu neem và dịch chiết bánh dầu với chất hấp phụ thích hợp, có bổ sung chất chống oxy hoá. Sau đó đùng khuôn để tạo hình chế phẩm. Tiến hành khảo sát từng bƣớc để chọn lựa loại nguyên vật liệu và nồng độ thích hợp của chúng trong chế phẩm. Chất hấp phụ: sử dụng bột talc, cám gạo, silicagel, và than hoạt tính. Từng chất hấp phụ đƣợc trộn riêng với dầu neem và dịch chiết bánh dầu (nồng độ 5 %). Sau khi ép tạo hình, các chế phẩm thô này đƣợc dùng để xử lý ngài gạo (đƣợc trình bày chi tiết ở mục 2.6.3. phần tổng quan tài liệu). Dựa vào kết quả ấu trùng chết sau 48 giờ, khả năng pha trộn và tạo hình để tạo ra chất hấp phụ thích hợp. Chất hỗ trợ thăng hoa: sử dụng tinh dầu thông, tinh dầu tràm và tinh dầu bạc hà – là những thƣơng phẩm dễ dàng mua ở thị trƣờng. Tinh dầu đƣợc chọn chủ yếu dựa vào kết quả khảo sát sự hao hụt của chúng trong 24 giờ với cùng thể tích ban đầu (10 ml), cùng điều kiện thí nghiệm ( cốc thủy tinh 50 ml, nhiệt độ phòng) và khả năng dẫn dụ ngài gạo lên trên bề mặt. Thí nghiệm xác định nồng độ tinh dầu thích hợp đƣợc tiến hành trong phạm vi từ 0,25 - 0,5 - 1,0 - 2,0 – 4,0 (%) cũng dựa vào khẳ năng dẫn dụ của chúng đối với ngài gạo. Chất bảo quản: Sử dụng chất BHT (butylhydroxi toluene) ở nồng độ 3 %. Hoạt chất chính: dầu neem 10 % phối hợp với dịch chiết bánh dầu ở bốn nồng độ 5 – 10 – 15 – 20 % trên cùng nền chất hấp phụ, tinh dầu, chất bảo quản đã xác định trƣớc đó, tạo thành bốn công thức chế phẩm. Hình 3.3. Quá trình tạo chế phẩm viên nén 3.2.4. Phƣơng pháp nhân nuôi ngài gạo trong phòng thí nghiệm Ngài gạo đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm trong môi trƣờng nhân tạo với thức ăn chính là cám gạo, ở điều kiện nhiệt độ phòng, ẩm độ 75 – 85 %. Sau khi vũ hoá, những con thành trùng (bƣớm) đực và cái đƣợc cho nhốt riêng trong lồng có lƣới đậy để đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và quét trứng thu đƣợc lên một thau cám khác để tạo điều kiện chu trứng nở. Tiến hành bổ sung cám thƣờng xuyên để ấu trùng có đủ dinh dƣỡng, tăng khả năng vào nhộng. Hình 3.4. Nhân nuôi ngài gạo trong phòng thí nghiệm 3.2.5. Thử nghiệm sinh học: đánh giá một số tác động cơ bản của 4 chế phẩm đối với ngài gạo. 3.2.5.1. Vật liệu - Ấu trùng ngài gạo ( tuổi 3) nhân nuôi ở phòng thí nghiệm, trong môi trƣờng cám gạo. - Lọ nhựa loại 1 lít và gạo sạch. - Ống bắt cặp và thu trứng. - Giấy đẻ trứng, chổi cọ, kẹp gắp, lọ ủ trứng. - Chế phẩm neem viên nén. 3.2.5.2. Phƣơng pháp tiến hành Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong các lọ nhựa thể tích 1 lít chứa 400 g gạo sạch và 20 ấu trùng ngài gạo. Sau khi đặt chế phẩm lên trên bề mặt gạo, đậy kín lọ để thuốc tác dụng. Sau 3 ngày, mở nắp lọ và đếm số ấu trùng chết. Thí nghiệm đƣợc theo dõi mỗi ngày để thu nhận số ấu trùng chết thêm và đánh giá sự sinh trƣởng của nhóm đối tƣợng bị xử lý. Số ấu trùng ngài gạo sống sót sau đợt xử lý sẽ đƣợc tiếp tục nuôi dƣỡng trong điều kiện bình thƣờng để theo dõi các tác động lâu dài và đa dạng của chế phẩm neem đối với chúng. 3.2.6. Phƣơng pháp đánh giá kết quả Đếm tổng số ấu trùng chết sau 3 ngày và 7 ngày xử lý các chế phẩm, từ đó tính ra tỉ lệ chết của từng nghiệm thức, làm cơ sở để tính LD50 của các chế phẩm. Số ấu trùng còn sống sót sau đợt xử lý sẽ đƣợc theo dõi mỗi ngày để ghi nhận một số chỉ tiêu sinh học nhƣ sau: * Tỷ lệ thành trùng tạo thành và tỷ lệ thành trùng biến dạng. * Số lƣợng trứng và tỷ lệ trứng nở của các thành trùng có bề ngoài bình thƣờng và dị dạng theo cách tiến hành nhƣ sau: - Các thành trùng đực và cái có hình dạng bình thƣờng trong cùng một nghiệm thức sẽ đƣợc phối cặp trong các ống nghiệm có đặt sẵn băng giấy để thu trứng. Tổng số trứng sau khi đếm sẽ đƣợc ủ trong lọ thủy tinh ( loại 15 ml) có chứa gạo để theo dõi số lƣợng ấu trùng nở. - Thành trùng cái biến dạng và thành trùng đực có hình dạng bình thƣờng trong cùng một nghiệm thức cũng sẽ đƣợc phối cặp với nhau và cũng thực hiện các bƣớc giống nhƣ trên. 3.2.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm có 20 nghiệm thức (4 loại chế phẩm × 5 nồng độ xử lý) đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức có chứa 20 ngài gạo tuổi 3. Bốn chế phẩm là NV1, NV2, NV3, NV4. Năm nồng độ xử lý là: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 g/ dm3. 3.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu của các nghiệm thức đƣợc phân tích biến lƣợng ANOVA (Analysis of variance) và phân hạng theo trắc nghiệm Duncan, thao tác trên phần mềm statgraphic 7.0. Độ độc của chế phẩm (LC50, LD50) đƣợc tính theo phƣơng pháp phân tích probit. a b c d e Hình 3.5. Quá trình tiến hành thí nghiệm a,b. Bố trí thí nghiệm c. Đếm sâu chết sau thí nghiệm d. Bắt cặp ngài gạo e. Quá trình ủ trứng Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Hiệu suất thu nhận dầu neem bằng phƣơng pháp ép nguội Kết quả sử dụng máy Komet (Đức) để ép nguội nhân hạt neem (ẩm độ 14,8 %) với tốc độ 10 kg nhân/ giờ, chúng tôi thu đƣợc dầu neem màu vàng nâu với hiệu suất 30 %. Ƣu điểm của máy này là khống chế đƣợc nhiệt độ 35 - 40oC trong quá trình ép, vì vậy không ảnh hƣởng đến tính ổn định của các thành phần hoạt chất có trong dầu. Ngoài ra, khi ép còn trích ra đƣợc nhiều limonoid và hợp chất sulfur có trong nhân hạt, góp phần làm tăng hoạt tính kháng khuẩn và côn trùng của dầu neem. Nhìn chung, phƣơng pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém, năng suất tƣơng đối cao và có khả năng đáp ứng yêu cầu của sản xuất lớn. 4.2 Kết quả định lƣợng một số hoạt chất chính trong các chế phẩm neem thô Bảng 4.1. Hàm lƣợng (ppm) của một số hoạt chất trong dầu neem và dịch chiết bánh dầu Hoạt chất Chế phẩm neem thô Dầu neem Dịch chiết bánh dầu Azadirachtin Nimbin Salannin 930,69 262,58 1027,48 7703,61 841,09 3214,56 Tổng số 2220,75 11759,26 Theo Seeni và ctv (1993), hàm lƣợng hoạt chất trong cây neem phụ thuộc chủ yếu vào giống và điều kiện sinh trƣởng của cây. Ngoài ra, những yếu tố khác nhƣ tuổi cây, điều kiện địa lý nơi trồng ( trong đó quan trọng nhất là điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng), thời điểm thu hoạch quả, kỹ thuật sơ chế, bảo quản nguyên liệu và kỹ thuật chiết xuất, ly trích cũng đóng vai trò quan trọng đối với hoạt chất. Kết quả phân tích cho thấy hàm lƣợng azadirachtin trong dầu neem Việt Nam thu đƣợc từ phƣơng pháp ép nguội là 930,69 ppm, cao hơn nhiều so với phƣơng pháp chiết xuất bằng dung môi hữu cơ. Theo Vũ Đăng Khánh (2003), dầu neem Ấn Độ và Việt Nam đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chiết xuất bột nhân hạt neem trong hexan có hàm lƣợng azadirachtin thấp, tƣơng ứng là 90 ppm và 100 ppm. Tuy nhiên, do là chất phân cực mạnh nên azadirachtin chỉ tan tốt trong dung môi phân cực nhƣ ethanol, vì vậy trong dịch chiết bánh dầu, kết quả hàm lƣợng azadirachtin lên đến 7703,61 ppm. Hàm lƣợng nimbin và salannin trong dịch chiết bánh dầu cũng cao hơn trong dầu neem, tƣơng ứng là 841,09 và 3214,56 ppm trong dịch chiết bánh dầu; 262,58 và 1027,48 ppm trong dầu neem. Tổng cộng 3 thành phần hoạt chất chính thì dịch chiết bánh dầu chứa 11759,26 ppm, dầu neem chứa 2220,75 ppm. 4.3.Tạo chế phẩm viên nén 4.3.1. Chất hấp phụ Mục tiêu là tìm kiếm các nguyên liệu ít độc, không phản ứng hóa học với chất bị hấp phụ và phức chất tạo thành sẽ giải phóng từ từ các chất bị hấp phụ mà không làm thay đổi hoạt tính của chúng. Ngoài ra còn ƣu tiên chọn loại vật liệu có giá rẻ và dễ ép thành viên. Dựa vào kết quả thí nghiệm sàng lọc trên nhiều loại vật liệu tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới (Lê Thị Thanh Phƣợng, 2005), chúng tôi chỉ tập trung khảo sát hai loại nguyên liệu là bột talc và cám gạo. Các nguyên liệu trên đƣợc trộn với dầu neem và dịch chiết bánh dầu riêng rẽ hoặc phối hợp ở nồng độ 10 %, bổ sung tinh dầu thông 1 % để hỗ trợ thăng hoa. Sau khi phối trộn, xử lí ngài gạo ở liều 2 g/ dm3. Kết quả trình bày ở bảng 4.2. Nhìn chung, sự kết hợp giữa dầu neem (DN) và dịch chiết bánh dầu (DCBD) trên 3 loại nguyên liệu đều mang lại hiệu quả gây chết ngài gạo cao hơn so với từng chế phẩm riêng lẽ. Trên nền bột talc, hỗn hợp DN – DCBD cho tỉ lệ chết ấu trùng cao nhất là 81,2 %, nhiều hơn 32,3 % so với DN 10 % và nhiều hơn 12,7 % so với DCBD 10 %. Trên nền cám gạo, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 63,5 %, nhiều hơn 39 % so với DN và nhiều hơn 22,8 % so với DCBD. Tƣơng tự, trên nền talc – cám, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 71,6 %, nhiều hơn 33,1 % so với DN và 19,7 % so với DCBD. Bảng 4.2. Tỉ lệ (%) ấu trùng chết sau 3 ngày Nguyên liệu Chế phẩm neem thô (10 %) DN DCBD DN - DCBD Bột talc 48,9 a 68,5 a 81,2 a Cám gạo 24,5 c 40,7 c 63,5 c Talc: Cám (5:5) 38,5 b 51,9 b 71,6 b * Các trị số trong một cột có cùng kí tự không khác biệt về thống kê ở p < 0,05 (trắc nghiệm Duncan) Mặt khác, DN 10 % kết hợp với DCBD 10 % trên nền bột talc gây chết 81,2 % ấu trùng, khác biệt có ý nghĩa so với 2 nghiệm thức cám gạo và hỗn hợp talc-cám (tƣơng ứng là 63,5 và 71,6 %). DCBD 10 % trên nền bột talc cho tỉ lệ chết của ấu trùng (68,5 %) cao hơn DCBD 10 % trên nền cám gạo (40,7 %) và hỗn hợp talc – cám (51,9 %). Tƣơng tự, DN 10 % trên nền bột talc cũng cho tỉ lệ chết của ấu trùng (48,9 %) cao hơn so với trên nền cám gạo và hỗn hợp talc - cám (tƣơng ứng là 24,5 % và 38,5 %). Tóm lại, các chế phẩm neem thô đều có hiệu lực gây chết ngài gạo mạnh nhất trên nền bột talc, kế đến là trên nền talc - cám, còn trên nền cám gạo cho tỉ lệ chết ấu trùng thấp nhất. Ở đây chúng ta có thể giải thích nhƣ sau: talc có cấu trúc xốp, dễ hấp phụ và nhả hấp phụ nên nâng cao hiệu quả của thí nghiệm xông hơi, còn cám gạo có lẫn nhiều tinh bột, khi gặp nƣớc sẽ trƣơng nở, không xốp, khó nhả hấp phụ, do đó cản trở khẳ năng bay hơi của các hoạt chất. 4.3.2. Hoạt chất chính Theo Võ Quang Long (2005), cho thấy DN và DCBD đều ức chế ngài gạo theo các phƣơng thức khác nhau từ đó hƣớng đến việc nên phối hợp cả DN và DCBD trong chế phẩm viên nén sao cho đạt hiệu quả cao, dễ thao tác và bảo quản. Kết quả nghiên cứu trƣớc cho thấy khả năng thăng hoa của DN rất thấp, nhƣng ngoài bản thân là hoạt chất chính, DN còn góp phần bảo vệ chế phẩm trƣớc tác động ánh sáng. Từ những kết quả trên chúng tôi tiến hành tạo và thử nghiệm 4 công thức chế phẩm viên nén từ neem (kí hiệu NV1, NV2, NV3, NV4) với DCBD tƣơng ứng là 5 – 10 – 15 – 20 %, kết hợp trên nền bột talc, DN 10 % , dầu thông 1 % và BHT 3 %. Các chế phẩm xử lý ngài gạo theo phƣơng thức xông trong lọ nhựa (mục 3.2.4.2./ phần nội dung phƣơng pháp). Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày ở mục 4.4. 4.4. Thử nghiệm chế phẩm 4.4.1. Tác động gây chết của các chế phẩm đối với ngài gạo Quá trình tiến hành thử nghiệm 4 chế phẩm đƣợc phối trộn bởi DN, DCBD, bột talc và dầu thông trên ngài gạo ở những liều xử lý khác nhau, bằng cách đặt chế phẩm vào trong lọ nhựa có sẵn 20 ấu trùng ngài gạo, bịt kín lọ và tiến hành xông trong vòng 3 ngày, sau đó mở nắp và ghi nhận kết quả sâu chết. Ở những nghiệm thức xử lý, nhận thấy sâu chết ở các tỉ lệ khác nhau, nằm rãi rác bên trong lớp gạo và cả trên bề mặt gạo. Ngoài tác dụng hỗ trợ thăng hoa, tinh dầu thông 1 % trong công thức chế phẩm còn có khả năng thu hút ấu trùng ngài gạo ra khỏi tổ của nó và bò lên bề mặt, vì vậy góp phần nâng cao khả năng thâm nhập của chế phẩm vào côn trùng. Ở các lô đối chứng, không hề có hiện tƣợng sâu chết sau 3 ngày đóng kín nắp lọ. Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ chết của ấu trùng sau 3 ngày, chúng tôi thu đƣợc kết quả ở bảng 4.3 Nhận xét: kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho thấy tất cả các chế phẩm từ NV1 cho đến NV4 đều có khả năng gây chết cho ấu trùng sau 3 ngày xử lý ở các tỷ lệ khác nhau, tuy nhiên tác động này còn phụ thuộc vào nồng độ xử lý của chế phẩm. Ở đây ta nhận thấy, chế phẩm NV1 ở liều xử lý 0,5 g/ dm3 có hiệu lực gây chết ngài gạo thấp nhất (25,5 %), còn chế phẩm NV4 ở liều xử lý 2,5 g/ dm3 có hiệu lực cao nhất (85,3 %). Trong cùng một chế phẩm, khi tăng liều xử lý thì tỉ lệ chết của ấu trùng sau 3 ngày xử lý cũng tăng lên. Cụ thể, khi liều xử lý tăng từ 0,5 g đến 2,5 g thì hiệu lực gây chết của các chế phẩm NV1, NV2, NV3 và NV4 tăng tƣơng ứng từ 25,5 % đến 47,7 %; từ 35,8 đến 64,5 %; từ 40,2 % đến 80,7 % và từ 48,2 đến 85,3 %. Trong cùng một liều xử lý, chế phẩm NV4 với 20 % dịch chiết bánh dầu cho tỉ lệ chết ấu trùng là cao nhất, kế đến là chế phẩm NV3, NV2, còn NV1 cho tỉ lệ chết ấu trùng là thấp nhất. Chẳng hạn với liều xử lý 2,5 g; chế phẩm NV4 gây chết 85,3 % ấu trùng (cao nhất), NV3 gây chết 80,7 % ấu trùng, NV2: 64,5 %, còn NV1 chỉ gây chết 47,7 % ấu trùng (thấp nhất). Nhƣ vậy nồng độ dịch chiết bánh dầu khác nhau giữa các chế phẩm ảnh hƣởng đáng kể tới kết quả thí nghiệm. Khi ta tăng nồng độ dịch chiết bánh dầu thì tỷ lệ chết của ấu trùng cũng tăng theo. Nồng độ dịch chiết bánh dầu trong chế phẩm tăng kết hợp với liều xử lý của chế phẩm tăng cho kết quả tỷ lệ chết ấu trùng cũng tăng theo. Bảng 4.3. Tỉ lệ chết (%) của ấu trùng 3 ngày sau xử lý STT Chế phẩm Liều xử lý (g) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1 NV 1 25,5 29,3 35,3 41,5 47,7 2 NV 2 35,8 40,5 48,6 56,8 64,5 3 NV 3 40,2 47,7 56,5 68,8 80,7 4 NV 4 48,2 56,8 67,6 75,4 85,3 Trên cơ sở tỷ lệ chết (%) ấu trùng thu đƣợc sau 3 ngày theo dõi, chúng tôi tiến hành phân tích Probit bằng phần mềm Excel để xác định LD50 và độ độc tƣơng đối của các chế phẩm thử nghiệm, thu đƣợc kết quả ở bảng 4.4. Qua phân tích probit cho thấy LD50 ở thời điểm sau 3 ngày xử lý của các chế phẩm là 3,5818 g/ dm3; 1,3452 g/ dm3; 0,8959 g/ dm3 và 0,634 g/ dm3 tƣơng ứng với NV1, NV2, NV3 và NV4. Nhƣ vậy LD50 của NV1 > NV2 > NV3 > NV4. Gi á tr ị LD50 tỷ lệ nghịch với độc tính của chế phẩm, tức LD50 càng nhỏ thì độc tính của chế phẩm càng cao. Nhƣ vậy, độc tính của chế phẩm NV4 là cao nhất (gấp 5,65 lần chế phẩm NV1), kế đến là NV3 (gấp 3,99 lần NV1), tiếp đến là NV2 (gấp 2,66 lần NV1), còn chế phẩm NV1 có độc tính thấp nhất. Bảng 4.4. Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (Giá trị LD50 ở thời điểm 3 ngày sau xử lý) Stt Chế phẩm Phƣơng trình tƣơng quan Hệ số tƣơng quan P LD50 (g/ dm 3 ) Độc tính tƣơng đối 1 NV1 Y = 3,6891 + 0,8435 X 0,9593 0,0097 3,5818 1 2 NV2 y = 3,8781 + 0,9939 X 0,9417 0,0167 1,3452 2,66 3 NV3 Y = 3,5726 + 1,4984 0,9315 0,0212 0,8959 3,99 4 NV4 Y = 3,8098 + 1,4838 X 0,9538 0,0118 0,6340 5,65 a b c d Hình 4.1. Kết quả 3 ngày sau xử lý chế phẩm a. Đối chứng b, c, d. Sâu chết ở những lô có xử lý chế phẩm Sau khi xử lý xông hơi trong 3 ngày, các lọ thí nghiệm đƣợc thông thoáng và tiếp tục nuôi dƣỡng để theo dõi tỷ lệ ấu trùng chết thêm ở những ngày sau đó. Tỷ lệ chết tích lũy ở ngày thứ 7 sau xử lý đƣợc ghi nhận ở bảng 4.5 nhƣ sau: Bảng 4.5. Tỉ lệ chết (%) của ấu trùng 7 ngày sau xử lý STT Chế phẩm Liều xử lý (g) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1 NV 1 42,2 47,7 56,7 65,5 73,2 2 NV 2 58,7 67,7 75,5 78,7 85,3 3 NV 3 76,7 83,3 86,0 93,3 96,7 4 NV 4 76,7 80,2 86,8 93,3 95,5 Sau 7 ngày xử lý, nhận thấy tỷ lệ sâu chết là rất cao, ngoại trừ chế phẩm NV1 ở liều xử lý 0,5 g và 1,0 g cho tỷ lệ sâu chết không cao, tƣơng ứng l à 42,2 % và 47,7 %. Tất cả các nghiệm thức còn lại đều cho tỷ lệ sâu chết trên 50 %, trong đó chế phẩm NV4 ở liều xử lý 2,5 g gây chết ấu trùng nhiều nhất, lên đến 95,5 %. Trong cùng một chế phẩm, khi ta tăng liều xử lý lên thì tỷ lệ chết của ấu trùng sau 7 ngày xử lý cũng tăng lên. Ví dụ, khi tăng liều xử lý từ 0,5 g lên 2,5 g thì hiệu lực gây chết ấu trùng của các chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4 tăng tƣơng ứng từ 42,2 % đến 73,2 %; 58,7 đến 85,3 %; 76,7 đến 96,7 %; 76,7 đến 95,5 %. Trong cùng một liều xử lý, chế phẩm NV4 với 20 % dịch chiết bánh dầu cho tỷ lệ chết ấu trùng là cao nhất, kế đến là chế phẩm NV3, NV2, còn NV1 cho tỷ lệ chết ấu trùng là thấp nhất. Ví dụ với liều xử lý 2,5 g, chế phẩm NV4 gây chết 95,5 % ấu trùng sau 7 ngày xử lý, NV3 cho tỷ lệ chết 96,7 %, NV2: 85,3 %, NV1: 73,2 %. Bảng 4.6. Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (Giá trị LD50 ở thời điểm 7 ngày sau xử lý) STT Chế phẩm Phƣơng trình tƣơng quan Hệ số tƣơng quan P LD50 (g/ dm 3 ) Độc tính tƣơng đối 1 NV 1 Y = 3,9121 + 1,1431 X 0,9523 0,0123 0,8948 1 2 NV 2 Y = 4,3861 + 1,1274 X 0,9795 0,0035 0,3503 2,55 3 NV 3 Y= 4,5693 + 1,4878 X 0,9312 0,0213 0,1948 4,59 4 NV 4 Y = 4,6161 + 1,3992 X 0,9330 0,0205 0,1881 4,76 Qua phân tích Probit đã tính đƣợc giá trị LD50 của các chế phẩm ở thời điểm 7 ngày sau xử lý là 0,8948 g/dm3; 0,3503 g/dm3; 0,1948 g/dm3 v à 0,1881 g/dm3, tƣơng ứng với NV1, NV2, NV3 v à NV4. Nhƣ vậy LD50 của NV1 > NV2 > NV3 > NV4. Qua đó cũng cho thấy độc tính của 2 chế phẩm NV3 và NV4 là cao nhất, gấp 4,59 – 4,76 lần so với chế phẩm NV1, kế đến là chế phẩm NV2 (cao gấp 2,55 lần chế phẩm NV1), còn chế phẩm NV1 có độc tính thấp nhất. Mặt khác khi so sánh giữa bảng 4.3 và 4.5 ta thấy LC50 của mỗi chế phẩm ở thời điểm 3 ngày cao hơn rất nhiều so với ở thời điểm 7 ngày. Cụ thể: đối với các chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4, LD50 (g/ dm 3) ở thời điểm 3 ngày tƣơng ứng là 3,5818; 1,3452; 1,3452; 0,8959; 0,634,