Luận văn Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.Coli DH5alpha

đƣợc tìm thấy ở E. coli EcoRV: enzyme thứ 5 đƣợc tìm thấy ở E. coli 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng này ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó. Loại 3: Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại II. 2.3.1.4 Các RE loại II Trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4 hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào. Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. 13 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn (a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đưôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2 Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 ligase. HaeIII 5’ GG CC 3’ 3’ GG CC 3’ 5’ GG + CC 3’ 3’ CC GG 5’ Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính. EcoRI không cắt DNA đƣợc methyl hoá DNA đƣợc methyl hoá Enzym cắt giới hạn EcoRI Enzym cắt giới hạn EcoRI DNA không đƣợc methyl hoá DNA không đƣợc methyl hoá Phân cắt Đầu dính 14 EcoRI 5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’ G AATTC 3’ 3’ C TTAA G 5’ Một số qui tắc cần chú ý khi thiết lập một phản ứng thủy giải bởi RE Mỗi RE hoạt động tối ƣu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về mặt dung dịch đệm. Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyên cáo của hãng sản xuất. Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thƣờng cơ bản khác nhau ở nồng độ NaCl. Do đó khi trong một phản ứng cần sử dụng nhiều RE: Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể đƣợc sử dụng đồng thời. Nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì DNA phải đƣợc cắt bởi RE hoạt động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl thấp trƣớc, sau đó thêm NaCl để đạt nồng độ cao hơn cần cho RE kia hoạt động và tiếp tục phản ứng thủy giải. RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cắt trở lại vào -200C. Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. Ứng dụng Việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử eukaryote. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh vật eukaryote. Các enzyme cắt giới hạn chủ yếu đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp tạo dòng với mục đích thu nhận một trình tự xác định với số lƣợng lớn. Ngoài ra, chúng còn đƣợc dùng vào việc lập bản đồ giới hạn (restriction map), vào việc phân tích so 15 sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kĩ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism – tính đa hình kích thƣớc của các trình tự). 2.3.2 Các enzym thông dụng khác 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzyme sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA. DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic. DNA polymerase I (từ E. coli) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzyme: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải), 3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’. Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’. 2.3.2.2 Taq polymerase Là một loại DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ một vi khuẩn suối nƣớc nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. 2.3.2.3 Terminal transferase Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng. Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert. 2.3.2.4 Các DNase Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp 16 các oligonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn2+ hay Mg 2+. Khi có Mn2+, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg2+, DNase tác động trên mỗi sợi DNA riêng lẻ. 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn2+ nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bằng cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973). 2.3.3 Các enzym nối DNA Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề. Sự hình thành liên kết này có thể đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E. coli DNA ligase hay T4 DNA ligase. 2.3.3.1 E. coli DNA ligase Enzym đƣợc ly trích từ E. coli xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu so le 5’ ACGG + TAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTA GCGGT 5’ E. coli DNA ligase 5’ ACGGTAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTAGCGGT 3’ 2.3.3.2 T4 DNA ligase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. coli. Enzyme này có cùng chức năng với ligase trích từ E. coli nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên là ligase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử. 17 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp Vi khuẩn là vật chủ lý tƣởng nhất cho việc đƣa DNA tái tổ hợp vào và biến chúng thành những nhà máy sản xuất ra những sản phẩm mà ta mong muốn. Những ƣu điểm cơ bản của vi khuẩn khi sử dụng chúng nhƣ những vật chủ để đƣa DNA tái tổ hợp vào nhƣ sau: - Vi khuẩn có khả năng biến nạp. Khả năng này đƣợc Federick Griffith đƣa ra từ năm 1928. Tuy nhiên khả năng này không phải tất cả vi khuẩn đều có mức độ nhƣ nhau. - Vi khuẩn là cơ thể đơn bào, chúng có khả năng sinh sản, phát triển và trao đổi chất rất mạnh. Do đó nếu đƣa DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn và chúng có khả năng biểu hiện đựoc tính trạng hợp lí mà ta mong muốn thì chỉ trong thời gian rất ngắn ta có thể thu nhận một lƣợng vật chấ lớn khổng lồ. - Vi khuẩn phát triển mạnh trong các nồi lên men. Do đó ta hoàn toàn có khả năng tự động hóa, cơ giới hóa quá trình sản xuất. Từ những ƣu điểm nổi bật trên mà các nhà khoa học đã nghiên cứu và đƣa ra những phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp hợp lý và rất dễ thực hiện. 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp Phƣơng pháp này có sự trợ giúp của CaCl2 kèm với làm sốc nhiệt để làm tăng khả năng biến nạp của vi khuẩn. Theo đó vi khuẩn chủ sẽ đƣợc trộn với DNA tái tổ hợp. Ngƣời ta cho vi khuẩn vào dung dịch CaCl2 lạnh và làm sốc nhiệt (nâng nhanh đến 420C trong 2 phút) sẽ làm tăng khả năng biến nạp lên nhiều lần. Đối với tế bào động vật ta có thể thực hiện phƣơng pháp biến nạp bằng cách hấp thụ DNA tái tổ hợp qua trung gian phosphate calcium. Đối với tế bào thực vật, ta cũng có khả năng tạo biến nạp. Tuy nhiên, việc đầu tiên là tạo tế bào trần (protoplast) thực vật bằng cách dùng enzyme cellulose phân hủy thành tế bào thực vật. Sau đó trộn tế bào trần này với DNA tái tổ hợp với sự có mặt của CaCl2 và polyethylenglycol. Tiếp theo ta lại nuôi tế bào trần trong môi trƣờng thích hợp để tái tạo lại thành tế bào nguyên thủy. Khi đó tế bào này mới phát triển thành cây trong những điều kiện tƣơng ứng. 18 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp Ta có thể sử dụng xung điện để tế bào thực vật hấp thụ DNA tái tổ hợp. Bằng phƣơng pháp này ta thu đƣợc hiệu quả biến nạp rất cao. 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh. Do đó, khi trải E. coli biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc. Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau: - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation. - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc). - Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc). Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích. Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGEM và các plasmid có nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E. coli chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-galactosidase E. coli (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal 19 (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kích hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: - Phƣơng pháp nhiệt độ cao - Phƣơng pháp Lythium - Phƣơng pháp SDS-kiềm 2. 5 Điện di (Electrophoresis) Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với ngƣời làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp. Phƣơng pháp này dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật này đƣợc tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thƣớc. 20 Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel đƣợc sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thƣờng dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel đƣợc đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di đƣợc thực hiện theo phƣơng nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ, tức là dƣới 1000 cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là: - Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dƣới 500 cặp base. Gel đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phƣơng của điện di là phƣơng thẳng đứng. Thực hiện nạp mẫu điện di Điện di đƣợc thực hiện bằng cách đƣa các mẫu nucleic acid đã đƣợc trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó đƣợc duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dƣới UV. 2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc 2.6.1 Ngoài nƣớc Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng pháp Calcium chloride. Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp N = A x10 n x OV/PV 21 N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl) Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau: 10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E. coli khác nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dịch TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày. 2.6.2 Trong nƣớc Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập phản ứng nối cho đoạn DNA trên với plasmid, thực hiện phản ứng PCR trên plasmid đã chèn. 22 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 14 tháng 02 năm 2006 đến ngày 14 tháng 08 năm 2006. Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid. Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1. Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986) 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MCS với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MCS là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự. pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MCS so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại. 23 Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) 3.2.3 Đoạn DNA Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là Đoạn DNA (900bp) của nấm Phytophthora trên cây địa lan Đoạn DNA (223bp) trong vùng Tef của nấm Trichorderma 3.3 Dụng cụ và hóa chất 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri lớn, nhỏ Ống nghiệm lớn, nhỏ Eppendorf: 1.5ml, 200μl Pipet : 0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl Đầu tip : xanh, vàng, trắng Lọ thủy tinh đƣng hóa chất Đầu lọc hóa chất : 0.22μm, 0.45μm Bình tam giác : 100ml, 200ml, 500ml Que trang thủy tinh 3.3.2 Các thiết bị máy móc Tủ cấy vô trùng (micro flow) Bồn ổn nhiệt (water bath) Máy ly tâm (Mikio 22) Tủ định ôn Máy lắc vi khuẩn Tủ 40C, - 200C, - 800C Tủ sấy dụng cụ Thiết bị điện di (Bio - Rad) Máy chụp gel (Bio - Rad) Lò vi sóng (Microway) Nồi hấp (Autoclave - Tomy) 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua ) Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillin) 24 Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar ) Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillin, X-gal, IPTG) 3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm Hóa chất để chuẩn bị tế bào khả nạp : CaCl2 100mM, glycerol 98%. Hóa chất biến nạp : Ampicillin 100μg/ml, X-gal 20mg/ml, IPTG 300mg/ml. Hóa chất ly trích plasmid Dung dịch I (50mM glucose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA) Dung dịch II (0,2N NaOH, 1% SDS, nƣớc cất) Dung dịch III (5M Potassium acetate, glacial acetic acid, nƣớc cất) Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1) Isopropanol, Ethanol 70 %, TE 1X (pH = 8) Hóa chất điện di và nhuộm: Loading dye, TAE 0.5X, Ethdium bromide 3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm Tên enzyme Trình tự nhận biết Buffer Mã hàng Nhà sản xuất BamHI G /GATCC B (10X) Cat. No. 220 612 Roche EcoRV GAT/ATG B (10X) Cat. No. 667 145 Roche HindIII A/AGCTT B (10X) Cat. No. 656 313 Roche DNA T4 ligase NEbuffer 10X Product No. 70005Y usb DNA fragment Klenow T4 reaction buffer Code number M0210S BioLabs 25 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Vi khuẩn E. coli sau khi xử lí CaCl2 sẽ làm cho màng tế bào trở nên khả nạp giúp cho DNA xâm nhập tế bào E.coli dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420C trong 45 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Một trong các tính trạng do các gen này qui định đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt nhữnng tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận DNA plasmid. Vi khuẩn Ecoli Xử lí CaCl2 Sốc nhiệt ở 420C trong 45 giây Cấy lên đĩa Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli 26 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra Vi khuẩn E. coli DH5α Khả nạp + CaCl2 Plasmid Bluescript II SK (+/-) Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt Chiết tách plasmid Tinh sạch Đoạn DNA Cắt plasmid bằng HindIII Blunt - end Tinh sạch Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng Chiết tách plasmid Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7 Blunt - end 27 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E. coli DH5α trên môi trƣờng LB Từ dòng vi khuẩn E. coli DH5α gốc hút 20µl dịch vi khuẩn sang ống nghiệm có chứa môi trƣờng LB lỏng. Đem nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút trong vòng 36-48h. Hút 1ml dịch vi khuẩn sau khi đã nuôi cấy vào ống eppendorf 1.5ml, thêm 150µl glycerol 98% vào và cất ống eppendorf vào tủ âm 70 để giữ giống. Dịch còn lại tiếp tục cấy sang các ống nghiệm để chuẩn bị tế bào khả nạp. 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp Bƣớc 1: Hút 20µl dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng. Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc trong vòng 3-4 giờ. Bƣớc 3: Chuyển ống nghiệm chứa vi khuẩn vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này đến khi hết dịch nuôi cấy. Bƣớc 6: Cho 1ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa. Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150µl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên. Thêm 20µ glycerol vào và trữ ở -700C. Khả nạp đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -700C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là