Luận văn Hoạt tính của protease kim loại (mmp - 2, mmp-9) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật

cắt bỏ đoạn đại tràng. Hội chứng FAP chiếm khoảng 1% trong UTĐTT [68]. Hội chứng Lynch (Hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) hay còn gọi UTĐTT không polyp di truyền: chiếm khoảng 3% đến 5% số ca mắc UTĐTT và thường mắc ung thư khi còn trẻ. Từ những biến đổi trong gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, hoặc EPCAM dẫn đến tăng nguy cơ phát triển hội chứng Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 6 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Lynch. Những người mắc hội chứng này cũng có thể có khối u, nhưng họ chỉ có một lượng nhỏ và không đến hàng trăm như trong hội chứng FAP. Nguy cơ UTĐTT ở những người bị tình trạng này có thể lên đến 80% [68]. Chủng tộc hay sắc tộc: một số nhóm chủng tộc như người Mỹ gốc Phi, người Do Thái gốc Đông Âu (Ashkenazi Do Thái) có nguy cơ UTĐTT cao hơn. Trong số những người Do Thái Ashkenazi, một số đột biến gen đã được tìm thấy dẫn đến tăng nguy cơ UTĐTT [35, 11]. 1.1.3. Phân loại ung thư đại trực tràng Việc xác định giai đoạn của ung thư có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp và tối ưu nhất cho bệnh nhân. Đồng thời, phân giai đoạn cụ thể cũng thuận lợi cho việc nghiên cứu, trao đổi thông tin giữa các trung tâm điều trị, so sánh và đánh giá các phương pháp điều trị với nhau. Hiện nay, hệ thống phân giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trên thế giới cho UTĐTT là hệ thống phân loại theo khối u, hạch lympho, di căn (Tumor-Node- Metastasis hay còn gọi là TNM); hệ thống Dukes và hệ thống phân loại theo mô bệnh học. Hệ thống phân giai đoạn TNM đã được Ủy ban ung thư Hoa kỳ (American Joint Committee on Cancer, AJCC) và Hiệp hội phòng chống ung thư quốc tế (Union for International Cancer Control, UICC) thông qua từ năm 1974 và được sửa đổi theo các ấn bản mới hơn. Hệ thống phân loại này được áp dụng theo hệ thống phân loại AJCC phiên bản thứ 7 cho UTĐTT cụ thể như sau [4]: T cho biết về kích cỡ, mức độ xâm lấn vào thành ruột của khối u nguyên phát: - Tx: Không có mô tả do không đầy đủ thông tin; - Tis: Khối u tại chỗ, khối u chỉ ảnh hưởng đến lớp niêm mạc; - T1: Khối u đã phát triển và xâm lấn đến lớp hạ niêm mạc; Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 7 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm - T2: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp hạ niêm mạc và xâm lấn đến lớp đệm cơ; - T3: Khối u đã phát triển xuyên qua lớp đệm cơ và xâm lấn đến các lớp ngoài cùng của đại tràng nhưng chưa xuyên thủng qua thanh mạc, khối u chưa xâm lấn đến các cơ quan và mô lân cận; - T4a: Khối u đã phát triển xuyên qua thanh mạc; - T4b: Khối u đã phát triển xuyên qua thành đại tràng, dính chặt hoặc xâm lấn các mô và cơ quan lân cận. N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch bạch huyết: - Nx: Không có mô tả về liên quan đến hạch bạch huyết; - N0: Không có tế bào ung thư ở các hạch bạch huyết kề cận; - N1a: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 1 hạch bạch huyết kề cận; - N1b: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 2-3 hạch bạch huyết kề cận; - N1c: Tìm thấy các tập hợp tế bào ung thư nhỏ ở vùng mỡ gần các hạch bạch huyết nhưng chưa có ở các hạch bạch huyết; - N2a: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 4 đến 6 hạch bạch huyết kề cận; - N2b: Tìm thấy tế bào ung thư trong 7 hạch bạch huyết kề cận trở lên. M cho biết mức độ di căn của khối u: - M0: Không có tế bào di căn xa; - M1a: tế bào ung thư đã di căn đến cơ quan ở xa hoặc một nhóm hạch bạch huyết ở xa; Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 8 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm - M1b: tế bào ung thư đã di căn đến ít nhất 1 cơ quan xa trở lên hoặc một nhóm các hạch bạch huyết ở xa, hoặc đã di căn đến các phần phúc mạc ở xa. Hệ thống phân loại Dukes: Được bác sĩ Cuthbert Dukes người Anh phát minh ra vào năm 1932 và chỉ dành riêng cho UTĐTT. Duke A: ung thư xâm lấn tới lớp cơ bị giới hạn ở thành trực tràng, chưa di căn hạch. Duke B: ung thư xâm lấn thanh mạc đến tổ chức xung quanh, chưa di căn hạch. Duke C: Có di căn hạch. Duke D: Có di căn xa. Ngoài cách phân giai đoạn theo TNM, UTĐTT còn được phân thành 5 giai đoạn, gồm: giai đoạn 0, I, II, III và IV. - Giai đoạn 0: khối u chỉ được tìm thấy ở lớp niêm mạc trong cùng của đại tràng hoặc trực tràng. - Giai đoạn I: khối u đã phát triển vào thành trong của đại tràng hoặc trực tràng. Khối u chưa phát triển vượt qua thành. - Giai đoạn II: khối u phát triển sâu hơn vào trong hoặc xuyên qua thành đại tràng hoặc trực tràng. Các tế bào ung thư có thể đã xâm lấn các mô lân cận nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết. - Giai đoạn III: tế bào ung thư đã di căn đến các hạch bạch huyết vùng lận cận nhưng chưa đến các bộ phận khác của cơ thể. - Giai đoạn IV: Tế bào ung thư đã lây lan sang các bộ phận khác của cơ thể, như gan hoặc phổi, Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sau 5 năm được thể hiện ở bảng 1.1 Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 9 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Bảng 1.1. Các giai đoạn của UTĐTT và tỷ lệ sống sót sau 5 năm [4, 69] Giai đoạn TNM Duke Tỷ lệ sống sau 5 năm 0 TisN0M0 - I T1N0M0 T N M A 87-92% IIA T3 0 0 B 80-87% IIB T4aN0M0 49-63% IIC T4bN0M0 IIIA T1,2N1/1cM0 T N M C 84-89% IIIB T3,4a 1/1cM0 T N M 69-71% IIIC T4b 2a 0 T N M 53-58% IVA M1a D 11-12% IVB M1b 1.1.4. Ảnh hưởng sau phẫu thuật Phẫu thuật là một phương pháp điều trị cơ bản không bị nhờn, cho phép loại bỏ các tổ chức ung thư. Nếu như bệnh được chẩn đoán ở giai đoạn sớm và xác định được vị trí khu trú của tổ chức u thì phẫu thuật có thể loại bỏ tổ chức u triệt để. Tuy nhiên, những biến chứng không mong muốn vẫn tồn tại do phẫu thuật như tụ máu, chảy máu, nhiễm trùng tại ví trí phẫu thuật, bên cạnh đó, thuốc dùng trong quá trình gây mê và các thuốc giảm đau sau phẫu thuật cũng có những ảnh hưởng nhất định với bệnh nhân sau phẫu thuật [69]. Từ đó, dẫn đến các quá trình của cơ thể như hồi phục tổn thương, stress oxi-hóa [14, 46]. 1.2. Tổng quan về các MMP 1.2.1. Matrix Metalloproteinases Matrix Metalloproteinases (MMP) là một họ các enzyme có 1 nhân kim loại kẽm tham gia xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide nội phân tử giúp phân giải các chất nền ngoại bào (extracellular matrix, ECM) qua đó làm yếu đi các liên kết giữa tế bào - tế bào; tế bào - ECM [20]. Cho đến nay, các nhà khoa học đã tìm được 25 loại MMP khác nhau, trong đó, 24 loại cũng được tìm thấy trong cơ thể Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 10 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm con người, chúng được nhận dạng dựa vào các vùng chức năng cơ bản của các MMP và cơ chất của chúng (bảng 1.2) [33] Bảng 1.2. Bảng phân loại các thành viên trong họ MMP theo cơ chất chính [33] Nhóm Tên Cơ chất Các Archetypal MMP Collagenases: MMP-1, -8, -13 ECM: collagens, gelatin, fibronectin, aggrecan Non-ECM: pro-iL-1β, pro-iL-8, pro-TNF, MMP khác, PAi, IGFBP Stromelysins: MMP-3, -10 ECM: collagens, gelatin, elastin, fbronectin, laminin, aggrecan Non-ECM: pro-iL-1β, các MMP, liên kết MMP/ TIMP, fibrinogen, plasminogen, antithrombin III, iGFBP Các loại khác: MMP-12, -19, -20, -27 ECM: collagen IV, gelatin, elastin, fibronectin, laminin Non-ECM: fibrin, plasminogen, myelin basic protein Matrilysins MMP-7, -26 ECM: collagen IV, gelatin, elastin, fibronectin, laminin, integrins, Non-ECM: các MMP khác, liên kết MMP/TIMP, fibrinogen, plasminogen. Gelatinases MMP-2, -9 ECM: collagens, gelatin, elastin, fibronectin, Non-ECM: pro-iL-1β, plasminogen, các MMP khác Furin – Hoạt hóa các MMP Tiết: MMP-11, -21, -28 ECM: collagen IV, gelatin, laminin, fibronectin Non-ECM: casein, IGFBP Xuyên màng loại 1: MMP-14, -15, -16, -24 ECM: collagens, gelatin, elastin, laminin, vitronectin Non-ECM: các MMP khác GPI-anchored: MMP-17, -25 Chưa biết Xuyên màng loại 2: MMP-23A, -23B Chưa biết Chú giải: ECM: chất nên ngoài bào, pro-IL: dạng tiền hoạt động của interleukin (proform of interleukin), pro-TNF: dạng tiền hoạt động của yếu tố hoại tử u (proform of tumor necrosis factor), PAI: ức chế nhân tố hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator inhibitor), IGFBP: protein kết hợp với yếu tố sinh trưởng tương tự insulin (insulin-like growth factor-binding protein), TIMP: Chất ức chế của MMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinase) Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 11 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Hình 1.2. Cấu trúc các vùng của MMP [18] Mặc dù có một vài khác biệt giữa các MMP nhưng về cấu trúc protein lại tương đồng khá nhiều (hình 1.2). Nhìn chung, tại đầu N của chúng đều chứa một đoạn ngắn peptide tín hiệu giúp xác định điểm đến trong quá trình bài tiết, nhưng chuỗi peptide tín hiệu sẽ được loại bỏ khi phân tử đi qua lưới nội chất. Các phần tiếp theo của các phân tử MMP gồm một vùng propeptide với khoảng 80 axit amin có chứa 1 motif bảo thủ PRCGXPD được biết đến như Switch - cysteine với vai trò khóa trung tâm hoạt động của phân tử và giữ cho chúng ở dạng tiền hoạt động. Phần tiếp theo của các MMP là vùng hoạt động gồm một chuỗi có 160-170 axit amin cuộn thành hình khối cầu có chứa trình tự bảo thủ khác là HEXXHXXGXXH và 2 phân tử kẽm tạo thành trung tâm hoạt động cho các enzyme. Hầu hết các MMP (trừ MMP-7, -23 và -26) đều có 1 vùng bản lề (hinge) với bản chất là 1 chuỗi chứa 10- 30 axit amin với chức năng làm cầu nối cho vùng hoạt động với đầu C của các MMP – vùng giống hemopexin. Vùng này có khoảng 200 axit amin được xem như vùng gắn chất ức chế của các MMP (các TIMP) [43]. Bên cạnh đó, đối với các loại Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 12 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm MMP màng (Membrane-type MMP, MT-MMP) có thể có thêm vùng bám màng glycosylphosphatidylinositol (GPI) gồm MMP-17 và -25 còn được gọi tương ứng là MT4- và MT6-MMP hoặc xuyên màng loại I với MMP-14, -15, -16, và -24, còn được gọi tương ứng là MT-1, -2, -3, và -5-MMP [52]. Ngoài các thành phần phổ biến nói trên, một số MMP có chứa một vài phần độc đáo khác. Ví dụ như fibronectin II giống như chèn vào trong vùng xúc tác chỉ được được tìm thấy trong MMP-2 và -9. Hay vùng bản lề của MMP-9 chứa 64 axit amin bị O-glycosyl hóa. Hơn nữa, trong phân tử MMP-23, các peptide tín hiệu được thay thế bởi vùng xuyên màng loại II, trong khi đó vùng giống hemopexin được thay thế bằng một đoạn giàu cysteine và tạo thành một vùng giống với immunoglobulin. Cuối cùng, tất cả các MMP GPI và MMP tiết (MMP-11, -21 và - 28) đều có một motif R(X/R)KR giữa vùng tiền hoạt động và hoạt động. Trình tự này được nhận diện và cắt bỏ bởi furin, các proteinase serine nội bào, trong đó loại bỏ các vùng pro từ các phân tử MMP và dẫn đến kích hoạt nó [18]. (hình 1.2) 1.2.2. Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP) Các loại enzyme MMP đều được tiết ra dưới dạng tiền hoạt động hay còn gọi là zymogen hay là pro-MMP. Do đó, chúng cần phải được hoạt hóa trước khi thực hiện chức năng phân cắt chất nền ngoại bào. Trong cơ thể, các MMP được hoạt hóa từ dạng tiền hoạt động sang hoạt động nhờ các endoproteinase. Sự hoạt hóa các MMP có thể được thực hiện bởi nhiều enzyme khác nhau trong chất nền ngoại bào như protease nhóm cysteine, serine và aspartate hoặc MMP khác. Ngoài ra, quá trình hoạt hóa nhiều loại MMP cũng được xử lý ngay trong tế bào bởi furin, các subtilisin như serine proteinase, ở lưới nội chất và thể Golgi. Mặt khác, các MMP có thể được hoạt hóa bởi tác nhân vật lý và hóa học như amino phenylmercuric acetate (APMA), sodium dedocyl sunfate (SDS), pH thấp hay xử lý bằng nhiệt [33]. Quá trình hoạt hóa MMP như sau: vùng pro-peptide của các MMP có cystein ở vị trí 73 tạo ổn định cho dạng pro-enzyme không hoạt động. Trong vùng xúc tác, Zn2+ được liên kết với cystein ở vị trí 73. Khi liên kết này còn nguyên, MMP không Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 13 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm hoạt động. Các MMP hoạt động khi liên kết Zn2+ với cystein bị phá vỡ. Cơ chế này được đề cập như là “sự chuyển đổi cystein”. Một phân tử nước đi vào liên kết với ion Zn2+ thay thế cystein sau khi phân ly khiến enzyme chuyển thành dạng hoạt động. Sau đó, vùng pro-peptide của các MMP được loại bỏ bằng cách tự cắt hay nhờ protease khác, quá trình này làm giảm 8-10 kDa của phân tử để trở thành dạng hoàn chỉnh như hình 1.3 [55]. Pro-MMP không hoạt tính Pro-MMP có hoạt tính Dạng hoạt động MMPs Hình 1.3. Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP [55] Trong kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE), dạng pro-MMP vẫn có hoạt tính như dạng hoạt động vì SDS đã phá vỡ liên kết Cystein-Zn làm cho phân tử MMP lộ ra trung tâm hoạt động mặc dù đoạn pro-peptide không bị loại bỏ do không có các endoproteinase để cắt bỏ đoạn pro [44]. 1.2.3. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase Các MMP đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm suy thoái chất nền ngoại bào được biết đến như hàng rào bảo vệ tế bào khỏi vi sinh vật, các MMP có khả năng tái cấu trúc collagen, gelatin, elastin và casein. Ngoài ra, chúng còn tham gia phân tách thụ thể bề mặt tế bào, giải phóng các phối tử của chết theo chu trình và bất hoạt chemokine/cytokine. Trong ung thư, Các MMP đóng vai trò quan trọng trong các quá trình tăng sinh, xâm lấn, biệt hóa, chết theo chu trình, hình thành mạch và bảo vệ vật chủ (bảng 1.3) [51]. Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 14 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Bảng 1.3. Chức năng của một số MMP [20] MMP Hoạt động Ảnh hưởng Sự xâm lấn của tế bào ung thư MT1-MMP, MMP2, MMP9 và nhiều loại khác Phân giải protein Làm suy giảm hàng rào bảo vệ vật lý Tăng sinh tế bào ung thư MMP-1, -2, -3, -7, -9, - 11, -19. Phân cắt IGF-BP Tăng sinh tế bào MMP-3, -7 Phát tán các phối tử bám màng của EGFR (HB-EGF, TGF-a và amphiregulin) MMP-2, -9, -14 Hoạt hóa TGF-β MMP-7 (CD44) Phát tán của HB-EGF Chết theo chương trình MMP-7 Phân cắt phối tử Fas Ngăn chặn apoptosis Nhiều loại MMP (bao gồm cả MMP-2 và -9) Gián tiếp hoạt hóa của Akt thông qua hoạt hóa EGFR và IGFR Sinh mạch của khối u Nhiều loại MMP (bao gồm MMP-2, -9 MMP- 3, -10, -11 MMP-1, -8, - 13) Thủy phân COL-IV, perlecan; giải phóng VEGF và bFGF Tăng sự hình thành mạch Thủy phân COL-IV, COL-XVIII, perlecan; tạo ra tumstatin, endostatin, angiostatin và endorepellin Giảm sự sinh mạch Kết dính, di cư và chuyển hóa biểu mô thành trung mô của tế bào MMP-2 Phân hủy COL IV, hình thành các peptide lạ Thúc đẩy xâm lấn MT1-MMP Phân hủy laminin-5 Cảm ứng của EMT di chuyển tế bào Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 15 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm MMP-2, -3, -9, -13, -14 Biểu hiện quá mức, liên quan đến EMT Cảm ứng mạnh mẽ của EMT MMP-1, -7 Giải phóng E-cadherin Xâm lấn tế bào MMP-28 Kích hoạt phân giải protein của TGF-β Giám sát miễn dịch MMP-9 Phát tán của thụ thể α-interleukin- 2 của tế bào lympho T Ngăn chặn gia tăng tế bào lympho T MMP-9, -2, -14 Giải phóng TGF-b đã hoạt hóa Ngăn chặn phản ứng của tế bào lympho T chống lại tế bào ung thư MMP-7, -11, -1, -8, -3 Giải phóng các chất ức chế a1- proteinase Giảm độ nhạy cảm của tế bào ung thư với tế bào giết NK MMP-7, -8 Phân cắt chemokine α và β Ảnh hưởng đến bạch cầu và liên quan đến xâm lấn Chú giải: EGFR: Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor), EMT: quá trình chuyển dạng trung - biểu mô (epithelial-mesenchymal transitions), TGF: nhân tố sinh trưởng chuyển hóa (Transforming growth factor), HB-EGF: yếu tố tăng trưởng thượng bì có gắn heparin (Heparin-binding EGF-like growth factor) Theo Gialeli và cộng sự (cs): MMP-2 và MMP-9 có mặt trong tất cả các vai trò của MMP trong ung thư như: xâm lấn, tăng sinh, chết theo chu trình, sinh mạch, giám sát miễn dịch và chuyển dạng tế bào. Qua đó, thấy được sự đa dạng về vai trò của MMP-2 và MMP-9 trong các quá trình thúc đẩy tiến triển của khối u [20]. Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 16 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm 1.3. Tình hình nghiên cứu MMP trong ung thư đại trực tràng Tình hình nghiên cứu trên thế giới Với sự đa dạng và phong phú về số con đường mà các MMP tham gia vào, các nhà nghiên cứu đã và đang tìm kiếm sự biểu hiện khác biệt của các MMP trong các bệnh ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công bố về kết quả nghiên cứu các MMP ở bệnh nhân ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng. Với mục tiêu nghiên cứu so sánh ý nghĩa lâm sàng của MMP-9 trong huyết thanh với TIMP-1 trong chẩn đoán UTĐTT và sự khác biệt giữa polyp thường với mô UTĐTT, Mroczko và cs đã sử dụng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) để định lượng MMP-9 và TIMP-1 trong huyết thanh của 75 bệnh nhân UTĐTT, 35 polyp thường và 70 người khỏe mạnh. Bên cạnh đó, nồng độ kháng nguyên ung thư CEA và CA 19-9 được định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme vi hạt (microparticle enzyme immunoassay). Qua đó, cho thấy mức độ biểu hiện của MMP-9 trong huyết thanh của bệnh nhân UTĐTT cao hơn rõ rệt với nhóm khỏe mạnh. Bên cạnh đó, mức độ biểu hiện TIMP-1 cũng cao hơn ở mô ung thư so với polyp tuyến. Ngoài ra, TIMP-1 cũng có liên quan với một số đặc điểm bệnh học lâm sàng như hạch di căn, di căn xa, giai đoạn khối u (T), tình trạng của bệnh nhân (còn sống và đã chết), tình trạng của khối u (đã cắt bỏ, chưa cắt bỏ). Kết quả nghiên cứu này cũng cho rằng: TIMP-1 và MMP-9 khi kết hợp với nhau trong chẩn đoán sẽ cho độ nhạy cao hơn các chỉ thị sinh học CEA và CA19-9 [41]. Daniele và cs đã tiến hành nghiên cứu trên 50 bệnh nhân ung thư vú và 34 người khỏe mạnh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trên mẫu mô và điện di hoạt tính enzyme với mẫu huyết thanh. Kết quả thu được cho thấy: các gelatinase biểu hiện cao rõ rệt trong bệnh nhân ung thư vú di căn so với không di căn và nhóm chứng trên cả mẫu mô và huyết thanh. Thêm vào đó, kết quả nghiên cứu cho rằng: MMP-9 Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 17 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm có tương quan với CA 15.3 và độ mô học. Kết quả này gợi ý rằng: MMP-2 và MMP9 như dấu hiệu của sự phát triển, xâm lấn và di căn ở ung thư vú [13]. Công bố năm 1999 của Adachi và cs dựa trên 83 mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT, trong đó 5 mẫu mô được lấy từ bệnh nhân đã di căn sang gan. Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch và điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide có bổ sung casein, kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy: có 46% mẫu mô trong 83 mẫu và hơn 10% tế bào ung thư được nhuộm dương tính với MMP-7 và sự biểu hiện tăng của MMP-7 có liên quan với sự có mặt của hạch di căn và di căn xa (p<0,05). Thêm vào đó, kết quả điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide có bổ sung casein cho thấy sự biểu hiện của MMP-7 có liên quan đến sự xâm lấn và di căn của khối u (p<0,001) [3]. Shiozawa và cs đã cho thấy sự biểu hiện của enzyme MMP-1 ở bệnh nhân UTĐTT. Mẫu nghiên cứu gồm: 20 bệnh nhân có khối u tuyến và 142 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến. Kết quả nghiên cứu cho thấy MMP-1 không biểu hiện trong 20 mẫu khối u tuyến nhưng lại biểu hiện trong 108/142 mẫu ung thư biểu mô tuyến (76,1%). Cùng với phân tích đặc điểm bệnh học, nhóm nghiên cứu đã nhận định mức độ xâm lấn, bộc lộ hạch lympho và di căn tăng lên theo mức độ biểu hiện của MMP-1 [53]. Leeman và cs đã tiến hành nghiên cứu về MMP-13 trên 249 mẫu UTĐTT được cố định bằng formalin và đúc với parafin bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Mặt khác, nhóm tác giả còn dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có bổ sung cơ chất gelatin đối với 10 bệnh nhân thuộc giai đoạn Duke C và mẫu mô bình thường. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng 91% số mẫu có MMP-13 được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào ung thư. Đồng thời, nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ giữa kết quả nhuộm hóa mô MMP-13 cao với khả năng sống sót thấp của bệnh nhân [36]. Waas và cs đã tiến hành nghiên cứu trên 73 cặp mẫu (mô u và mô thường) và 33 mẫu mô lân cận u lấy từ bệnh nhân UTĐTT bằng phương pháp điện di và phân Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 18 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm tích hoạt tính sử dụng phương pháp huỳnh quang. Kết quả cho thấy, tại mô u mức độ hoạt động của cả dạng hoạt động và tiền hoạt động của MMP-2 và -9 cao hơn so với mô thường. Thêm vào đó, tỷ lệ giữa dạng hoạt động và tiền hoàn động của MMP-2 và -9 cũng có sự khác biệt trong từng loại mô (mô u, lân cận u và thường). Ngoài ra, MMP-2 và proMMP-2 có tương quan nghịch với giai đoạn bệnh, khối u chưa có với có di căn xa. Đối với proMMP-9, mức độ hoạt động chỉ phụ thuộc vào vị trí khối u. Từ đó, nhóm tác giả cho rằng có sự khác biệt giữa vai trò của MMP-2 và -9 trong sự phát triển của khối u [60]. Bằng các kỹ thuật phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), hóa mô miễn dịch và định lượng bằng ELISA, Tutton và cs công bố kết quả phân tích 48 mẫu mô u và 13 polyp thường. Cùng với đó là sự phân tích nồng độ MMP-2 và -9 trong mẫu huyết tương từ các bệnh nhân trên và thêm 36 bệnh nhân khác bằng phương pháp ELISA tại 2 thời điểm trước và sau phẫu thuật từ 6-12 tháng. Kết quả phân tích ELISA trên mẫu mô u và polyp thường cho thấy: MMP-2 và -9 biểu hiện tăng đáng kể trong mô u. Đối với mẫu huyết tương, MMP-2 và -9 biểu hiện cao hơn ở trong mẫu máu trước mổ. Từ những kết quả trên, nhóm nghiên cứu kết luận rằng mức độ biểu hiện của các enzyme MMP-2 và MMP-9 có tiềm năng là chỉ thị cho giai đoạn bệnh UTĐTT [57]. Groblewska và cs công bố kết quả nghiên cứu trên mẫu mô và mẫu huyết thanh lấy từ 72 bệnh nhân UTĐTT và 68 người bình thường. Hàm lượng MMP-2 và chất ức chế MMP-2 (TIMP-2) trong huyết thanh được định lượng bằng kỹ thuật ELISA. Bên cạnh đó, mức độ biểu hiện của MMP-2 và TIMP-2 trong các tế bào ung thư, tế bào viêm khe và tế bào lân cận niêm mạc ĐTT bình thường được xác định bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Kết quả cho thấy, nồng độ MMP-2 và TIMP-2 trong huyết thanh của nhóm người bệnh thấp hơn trong nhóm người bình thường nhưng tỷ lệ phản ứng miễn dịch của MMP-2 và TIMP-2 trong những tế bào ung thư, tế bào viêm lại cao hơn trong nhóm tế bào bình thường. Kết Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 19 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm quả này gợi ý rằng MMP-2 và TIMP-2 có liên quan đến quá trình xâm lấn và di căn của UTĐTT [25]. Dragutinović và cs công bố kết quả phân tích 32 bệnh nhân UTĐTT và 11 ca u lành làm đối chứng. Bằng phương pháp phân tích hóa mô miễn dịch và điện di hoạt tính enzyme cho thấy: mức độ biểu hiện của MMP-2 và MMP-9 trong huyết thanh của bệnh nhân UTĐTT có tỷ lệ cao hơn đáng kể so với ở trong huyết thanh của nhóm chứng [16]. Như vậy, các phương pháp tiếp cận các MMP trong UTĐTT thường sử dụng: hóa mô miễn dịch, điện di hoạt tính enzyme, ELISA và RT-PCR. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã công bố nghiên cứu đa hình nucleotide đoạn điều khiển của gen MMP-2 ở một số bệnh nhân ung thư vòm mũi họng (UTVMH). Kết quả nghiên cứu trên mẫu sinh thiết của 9 bệnh nhân UTVMH và 3 người khỏe mạnh đã chỉ ra rằng ngoài biến đổi C1306T đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen, còn thấy xuất hiện 4 biến đổi khác như: T1235C, T1339C, T1440C, T1456C chưa được công bố trên bất kì tài liệu nào. Nhóm nghiên cứu này nhận định rằng đây có thể là một trong những đa hình trên promoter của gen MMP- 2 của bệnh nhân UTVMH ở Việt Nam dẫn đến sự thay đổi mức độ biểu hiện của gen MMP-2, một trong những yếu tố liên quan đến sự xâm lấn và di căn của ung thư [2]. Phan Thị Phi Phi và cs đã tiến hành nghiên cứu xác định sự biểu hiện MMP- 2 và TIMP-2 bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch trên 83 mẫu sinh thiết của bệnh nhân UTVMH, đồng thời tìm hiểu mối liên quan về mức độ biểu hiện của các protein này với đặc điểm bệnh học lâm sàng, thời gian sống sót và tỷ lệ tử vong trong UTVMH. Kết quả nghiên cứu cho thấy: có 86,7% các trường hợp có biểu hiện MMP-2, trong đó, 22,9% MMP-2 biểu hiện tăng ở bệnh nhân UTVMH. Đồng thời, có 85,5% các trường hợp có biểu hiện TIMP-2 và 16,7% trường hợp biểu hiện mức độ mạnh. Số liệu phân tích thống kê cho thấy, biểu hiện tăng của MMP-2 và TIMP- Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 20 Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm 2 có liên quan đến việc tăng di căn hạch cổ, giai đoạn lâm sàng, tăng tỷ lệ tử vong và giảm thời gian sống trong UTVMH (p < 0,05), tuy nhiên, chưa tìm thấy mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của MMP-2 và TIMP-2 tại mô sinh thiết ở các giai đoạn T khác nhau. Kết quả này cho thấy sự tăng mức độ biểu hiện của MMP-2 và TIMP-2 có thể coi là yếu tố tiên lượng xấu trong UTVMH [1]. Tô Vân Anh và cs đã công bố nghiên cứu đa hình promotor -1306C>T của MMP-2 trên 120 bệnh nhâ