Luận văn Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium SP lên sự phát sinh cơ quan ở cây lúa (Ozyra sativa L) nuôi cấy In Vitro

019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l NAA, bổ sung nồng độ 2,4-D thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 1) Mẫu cấy: mô sẹo có diện tích bằng nhau. Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mô sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 3.3.3.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ BAP/ NAA thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 2) Mẫu cấy: mô sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn 34 NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy chồi(%) = (số cây nảy chồi / tổng số cây)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu 3.3.3.7 Thí nghiệm 7 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo. Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA thich hợp (kết quả từ thí nghiệm 4) Mẫu cấy: mô sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu: tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100 số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu 3.3.3.8 Thí nghiệm 8 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20. 35 Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng. Mẫu cấy: mô sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mô sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mô sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 36 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần nuôi cấy Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) BAP (mg/l) NAA (mg/l) Kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần 1.1 0 0,5 1 0,91 c 1.2 1 0,5 1 0,63 a 1.3 2 0,5 1 0,78 b 1.4 3 0,5 1 0,71 ab * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0,91 0,63 0,78 0,71 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 ,9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 Nghiệm thức cm Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau 37 Sau 4 tuần nuôi cấy, theo bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức (1.1) có kích thƣớc mô sẹo lớn nhất và có sự khác biệt rõ rệt so với các nghiệm thức còn lại. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Bên cạnh đó các mẫu mô sẹo của nghiệm thức (1.1) có mô phát triển tốt, xốp, mô sẹo sinh phôi và có xuất hiện chồi, còn các mẫu mô sẹo của các nghiệm thức còn lại tuy có phát triển về kích thƣớc nhƣng mô sẹo chuyển sang màu vàng nâu và cứng, ít có khả năng tái sinh cây. Theo tác giả Đoàn Thị Phƣơng Thuỳ [6], các dòng lúa khác nhau có các đặc tính di truyền khác nhau vì vậy nhu cầu chất điều hòa tăng trƣởng thực vật cho sự hình thành và tăng trƣởng mô sẹo là khác nhau. Có lẽ, nồng độ auxin ngoại sinh trong nghiệm thức (1.1) là thích hợp, không cần bổ sung thêm 2,4-D vào môi trƣờng, mô sẹo của giống lúa VĐ20 vẫn tăng trƣởng và phát triển tốt hơn so với các nghiệm thức khác. Qua bảng 4.1, nghiệm thức (1.1) cho kết quả tốt nhất, do đó nghiệm thức này đƣợc chọn sử dụng cho thí nghiệm 4. Hình 4.1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy (1.1) 1 cm 38 Hình 4.2: Các mô sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuôi cấy 4.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo Nghiệm thức BAP (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 2 tuần 3 tuần 2.1 1 0,1 41,66 ab 58,33 ab 2.2 1 0,5 50 ab 66,66 ab 2.3 1 1 58,33 ab 58,33 ab 2.4 2 0,1 33,33 a 33,33 a 2.5 2 0,5 33,33 a 50,33 ab 2.6 2 1 66,66 b 75 b * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 1 cm (1.1) (1.2) (1.3) (1.4) 39 0 10 20 30 40 50 60 70 80 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghiệm thức Tỷ lệ (%) tuần 2 tuần 3 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Nhìn chung tỷ lệ tái sinh chồi khá cao. Theo kết quả thống kê, tỷ lệ tái sinh chồi của các nghiệm thức đều tăng chỉ có ở 2 nghiệm thức (2.3) và (2.4) là không tăng, và nghiệm thức (2.6) có tỷ lệ tái sinh cao nhất. Sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05). Từ kết quả bảng cho thấy, tỷ lệ nồng độ giữa BAP và NAA quá cao sẽ gây ức chế sự tái sinh chồi, nhƣ nghiệm thức (2.4) mô sẹo không những tái sinh chồi ít mà một số mẫu bị đen không phát triển, do đó việc kết hợp thích hợp tỷ lệ nồng độ BAP và NAA sẽ giúp mô sẹo tái sinh tốt. 40 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mô sẹo Nghiệm thức BAP (mg/l) NAA (mg/l) Số chồi trên mẫu 2 tuần 3 tuần 2.1 1 0,1 1.16 ab 1,33 ab 2.2 1 0,5 1,75 ab 2,08 b 2.3 1 1 1,91 b 2,41 b 2.4 2 0,1 0,66 a 0,66 a 2.5 2 0,5 1,66 ab 2,16 b 2.6 2 1 1,91 b 2,5 b * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghiệm thức Số ch ồi tuần 2 tuần 3 Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian 41 Số chồi hình thành ở mỗi nghiệm thức đều tăng theo thời gian. chỉ có nghiệm thức (2.4) số chồi hình thành rất ít và không tăng (2,66). Ở nghiệm thức (2.3) mặc dù tỷ lệ tái sinh ở tuần thứ 3 không tăng so với tuần thứ 2 (bảng 4.2), nhƣng số chồi lại tăng rõ rệt, có thể ở tỷ lệ nồng độ này ức chế sự tái sinh chồi nhƣng không ảnh hƣởng đến sự hình thành và phát triển của mẫu đã tái sinh. Sau 3 tuần, ở các nghiệm thức (2.2); (2.3); (2.5), (2.6) số chồi hình thành có sự khác biệt so với các nghiệm thức còn lại và so với tuần thứ 2. Sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Tỷ lệ Cyt/Aux có ảnh hƣởng rất quan trọng, nó quyết định chiều hƣớng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [6], do đó với tỷ lệ Cyt/Aux trong môi trƣờng thích hợp sẽ kích thích sự tạo chồi của mô sẹo. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây: hoạt động của một chất điều hoà tăng trƣởng phụ thuộc vào: - Sự cân bằng giữa các chất điều hoà tăng trƣởng thực vật trong mô đích. - Loại mô đích và trạng thái sinh lý của mô đích. [3] Qua 2 bảng 4.2 và 4.3 cho thấy nghiệm thức (2.6) cho tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành cao nhất nên ta sẽ sử dụng kết quả nghiệm thức này cho thí nghiệm 6. 42 Hình 4.3: Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy Hình 4.4: Các mẫu mô tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuôi cấy 1 cm (2.1) (2.2) (2.3) (2.5) (2.4) (2.6) 1 cm 43 4.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ hình thành Nghiệm thức NAA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh rễ (%) sau 2 tuần Số rễ trên mẫu sau 2 tuần 3.1 0,5 58,33 a 2,08 a 3.2 1 91,66 a 4,16 a 3.3 1,5 83,33 a 4,25 a 3.4 2 83,33 a 2,66 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0 20 40 60 80 100 3.1 3.2 3.3 3.4 Nghiệm thức tỷ lệ (% ) 0 1 2 3 4 5 số rễ tỷ lệ rễ số rễ Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần 44 Theo bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ tái sinh rễ rất cao, 3 nghiệm thức (3.2), (3.3), (3.4) có sự khác biệt rõ ràng so với nghiệm thức (3.1), sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Nhƣ vậy nồng độ NAA cao sẽ kích thích sự tái sinh rễ tốt hơn. Ở nghiệm thức (3.4) có tỷ lệ tái sinh rễ rất cao (83.33%) nhƣng số rễ trên mẫu lại thấp, có thể ở nồng độ này kích thích sự tái sinh rễ từ mô sẹo nhƣng lại hạn chế sự phát triển rễ từ mẫu tái sinh. Sau 4 tuần nuôi cấy ở 3 nghiệm thức (3.1), (3.2), (3.3), một số mô sẹo xuất hiện chồi, còn nghiệm thức (3.4) không có chồi xuất hiện, có thể do nồng độ NAA cao đã ức chế sự tạo chồi của mô sẹo. Hai nghiệm thức (3.2), (3.3) đều có tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ trên mẫu cao, không có sự khác biệt về mặt thống kê, nhƣng ở nghiệm thức (3.3) rễ phát triển nhiều và tốt hơn. Nên ta chọn kết quả của nghiệm thức (3.3) sử dụng cho thí nghiệm 7. Hình 4.5: Mô sẹo tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy 1 cm 45 Hình 4.6: Các mẫu mô tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuôi cấy 4.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên mô sẹo của giống lúa VĐ 20” Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa Nghiệm thức Vml dung dịch vi khuẩn Tỷ lệ tạo sẹo (%) 4.1 0 85,33 b 4.2 0,5 79,33 b 4.3 1 84,66 b 4.4 1,5 62,33 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 1 cm (3.1) (3.2) (3.3) (3.4) 46 85,33 79,33 84,66 62,33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 4.1 4.2 4.3 4.4 Nghiệm thức tỷ lệ( % ) Đồ thị 4.5: Tỷ lệ tạo mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần Nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn (4.2), (4.3) không có sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê sinh học. Trong nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn có lẽ nồng độ hormone do chủng 1019 tổng hợp không ảnh hƣởng nhiều đến tỷ lệ cân bằng Cyt/Aux trong môi trƣờng nuôi cấy nên quá trình tạo mô sẹo vẫn xảy ra, tuy nhiên tùy vào nồng độ khuẩn bổ sung mà cho tỷ lệ khác nhau. Nghiệm thức (4.2) cho tỷ lệ cao nhất và thấp nhất là nghiệm thức (4.4). Vì vậy, chủng 1019 không có ảnh hƣởng đến khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20 so với đối chứng trên môi trƣờng: MS + 2mg/l 2,4-D, và nồng độ khuẩn thích hợp cho mội trƣờng tạo sẹo trong các nghiệm thức có bổ sung khuẩn là 1ml. Theo tác giả [9], Methylobacterium sp. hạn chế sự hình thành mô sẹo ở Chrysanthemum sp. và ức chế sự hình thành mô sẹo ở mô phiến lá, lóng thân ở Nicotiana tabacum; nhƣ vậy vi khuẩn có ảnh hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mô sẹo ở các loại mô hay các loài nuôi cấy khác nhau. 47 (a) (b) Hình 4.7: Sự tạo mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) có bổ sung 1ml dung dịch khuẩn, (b) không có bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuôi cấy 4.5 Thí nghiệm 5: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Dựa vào kết quả thí nghiệm 1, mẫu đối chứng: môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA và 1 mg/l BAP. Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến đƣờng kính mô sẹo Nghiệm thức V dung dịch khuẩn (ml) Đƣờng kính mô sẹo (cm) 3 tuần 4 tuần 5.1(Đ/chứng) 0 0,53b 0,66c 5.2 0,5 0,27 a 0,31 b 5.3 1 0,25 a 0,26 a 5.4 1,5 0,25 a 0,25 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 48 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 3 tuần 4 tuần kí ch th ướ c( cm ) 5.1(đ/c) 5.2 5.3 5.4 Đồ thị 4.6: Kích thƣớc mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Qua bảng 4.6, ta thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa nghiệm thức đối chứng với các nghiệm thức bổ sung khuẩn. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Trong các nghiệm thức đối chứng, sự phát triển của mô sẹo tỷ lệ nghịch với thể tích dung dịch khuẩn bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy, nồng độ khuẩn càng cao càng ức chế sự phát triển của mô sẹo. Ở nghiệm thức (5.2) mô sẹo có gia tăng về kích thƣớc nhƣng không đáng kể, bên cạnh đó một số mô sẹo có sự xuất hiện chồi và rễ nhƣng không nhiều. Mặc dù, chủng 1019 không ảnh hƣởng đến sự hình thành mô sẹo của giống lúa VĐ20 nhƣng nồng độ hormone mà khuẩn tổng hợp lại ảnh hƣởng đến nồng độ auxin có trong môi trƣờng tăng sinh ức chế mô sẹo tăng trƣởng và phát triển so với mẫu đối chứng. Đối với sự tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20, môi trƣờng tốt nhất là môi trƣờng đối chứng không bổ sung khuẩn (1mg/l BAP + 0,5mg/l NAA). 49 Hình 4.8: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) không bổ sung khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy Hình 4.9: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (5.4) 1 cm (5.1) (5.2) (b) (a) 1 cm 50 4.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20” Dựa vào kết quả thí nghiệm 2, mẫu đối chứng: môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l BAP và 1mg/l NAA. Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành từ mô sẹo Nghiệm thức V dung dịch khuẩn (ml) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Số chồi trên mẫu 2 tuần 3 tuần 2 tuần 3 tuần 6.1(Đ/C) 0 66,66c 75c 1,66b 2,5c 6.2 0,5 16,66 b 41,66 b 0,25 a 0,58 b 6.3 1 0 a 0 a 0 a 0 a 6.4 1,5 0 a 0 a 0 a 0 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 66,66 75 16,66 41,66 0 00 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 3 tuần 4 tuần tỷ lệ (% ) 6.1(đ/c) 6.2 6.3 6.4 Đồ thị 4.7: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian 51 1,66 0,25 0,58 0 00 0 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3 tuần 4 tuần Số ch ồi 6.1(đ/c) 6.2 6.3 6.4 Đồ thị 4.8: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Theo kết quả có sự khác biệt rõ rệt giữa nghiệm thức đối chứng với các nghiệm thức có bổ sung khuẩn ở tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành từ mô sẹo. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Tỷ lệ tái sinh và số chồi hình thành ở các nghiệm thức có bổ sung khuẩn là rất thấp, ở nồng độ khuẩn cao (6.3), (6.4) không có khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. Nhƣ vậy, trên môi trƣờng thích hợp cho mô sẹo tái sinh chồi, chủng 1019 bổ sung vào môi trƣờng đã làm thay đổi tỷ lệ các chất điều hoà tăng trƣởng thực vật, làm thay đổi chiều hƣớng biệt hóa của mô, ức chế sự tái sinh và hình thành chồi của mô. Tuy nhiên đối với Nicotiana tabacum và Saintpaulia ionantha thì chủng 1019 lại cho kết quả ngƣợc lại, ở nghiệm thức có bổ sung khuẩn cho tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành cao hơn đối chứng, chứng tỏ ngoài vai trò tác động của Methylobacterium sp. thì bản chất của mô và loài thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro [9]. Đối với sự tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20, môi trƣờng tốt nhất là môi trƣờng đối chứng không bổ sung khuẩn (2mg/l BAP + 1mg/l NAA). 52 Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.2). Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.4) 1 cm 1 cm 53 4.7 Thí nghiệm 7: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo” Dựa vào kết quả thí nghiệm 3, mẫu đối chứng: môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA. Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ trên mẫu Nghiệm thức V dung dịch khuẩn (ml) Tỷ lệ tái sinh rễ (%) sau 2 tuần Số rễ trên mẫu sau 2 tuần 7.1 (Đ/C) 0 83,33b 4b 7.2 0,5 91,66 b 6,33 c 7.3 1 16,66 a 1 a 7.4 1,5 0 a 0 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0 20 40 60 80 100 7.1(đ/c) 7.2 7.3 7.4 Nghiệm thức tỷ lệ (% ) 0 1 2 3 4 5 6 7 số rễ tỷ lệ rễ số rễ Đồ thị 4.9: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần 54 Qua bảng 4.8 cho thấy sự khác biệt giữa nghiệm thức có bổ sung khuẩn (7.2) với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức có bổ sung khuẩn (7.3), (7.4), sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Nghiệm thức có bổ sung khuẩn (7.2) có tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ hình thành từ mẫu tái sinh rất cao (91.66%), chứng tỏ rằng chủng 1019 có tác động tích cực đến khả năng tái sinh và phát triển rễ của mô sẹo. Tuy nhiên khi tăng thể tích khuẩn bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy thì các tác động này giảm hẳn, có thể do nồng độ khuẩn quá cao ảnh hƣởng không tốt đến khả năng tái sinh và phát triển của mô sẹo. Theo các nghiên cứu của M. Maliti (2000), một số chủng Methylobacterium có khả năng kích thích sự phát triển rễ cũng nhƣ kích thích sự sinh trƣởng rễ ở cây lúa nuôi cấy in vitro, điều này chứng tỏ Methylobacterium có tác động tích cực đến chiều hƣớng biệt hoá rễ của lúa [46]. Bên cạnh đó, theo tác giả [9] Methylobacterium sp. còn tăng cƣờng quá trình thành lập rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp.. Đối với khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo, trong các nghiệm thức bổ sung khuẩn thì nghiệm thức (7.2) là môi trƣờng tốt nhất. Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.2) 1 cm 55 Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.4) 4.8 Thí nghiệm 8: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy Nghiệm thức Vml dung dịch khuẩn Số chồi trên mẫu Số rễ trên mẫu Đƣờng kính mô sẹo (cm) 8.1(Đ/C) 0 1,08c 5,41 b 0,71 b 8.2 0,5 0,83 b 5,5 b 0,68 b 8.3 1 0 a 6.25 c 0,75 b 8.4 1,5 0 a 0,35 a 0,33 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 1 cm 56 0 1 2 3 4 5 6 7 8.1 8.2 8.3 8.4 Nghiệm thức 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 kí ch th ướ c( cm ) số chồi số rễ kích thước sẹo Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thƣớc mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 4 tuần Qua bảng 4.9 cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê sinh học (P<0,05) giữa các nghiệm thức có bổ sung khuẩn với nghiệm thức đối chứng và giữa các nghiệm thức có bổ sung khuẩn với nhau. Số chồi trên mẫu ở nghiệm thức bổ sung là nhiều nhất, nghiệm thức (8.2) cũng có chồi hình thành nhƣng số lƣợng rất ít, các nghiệm thức còn lại mẫu không tái sinh chồi, nhƣ vậy chủng 1019 ức chế sự tái sinh chồi từ mô sẹo. Nhƣng bên cạnh đó, khuẩn lại kích thích sự tạo rễ ở nghiệm thức (8.3), số rễ hình thành ở nghiệm thức này nhiều hơn so với nghiệm thức đối chứng (sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học, P>0,05), tuy nhiên rễ ở nghiệm thức đối chứng mọc dài và chắc hơn so với rễ cúa các nghiệm thức có bổ sung khuẩn. Ở thí nghiệm 4, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rõ ràng về sự phát triển kích thƣớc mô sẹo, nhƣng ở thí nghiệm này không có sự khác biệt về mặt thống kê sinh học giữa các nghiệm thức. Do đó, có thể trên môi trƣờng nuôi cấy không có bổ sung các chất sinh trƣởng thƣc vật thì chủng 1019 không ảnh hƣởng đến sự phát triển mô sẹo. Các mô sẹo ở nghiệm thức 57 đối chứng ở dạng chắc, màu nâu vàng, có khả năng tái sinh, còn các mẫu mô sẹo ở các nghiệm thức có bổ sung khuẩn có dạng xốp. Nhƣ vậy tuy không ảnh hƣởng đến kích thƣớc của mô sẹo nhƣng Methylobacterium sp. ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất, làm thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo. (a) (b) (c) (d) Hình 4.14: Sự tăng sinh mô sẹo ở thí nghiệm 8 trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone: (a) không có bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c) bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy. 1 cm 1 cm 1 cm 1 cm 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ các kết quả trên, chúng tôi có một số kết luận nhƣ sau: - Chủng 1019 có tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo. Chứng tỏ chủng khuẩn có tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hóa của tế bào mô sẹo, ảnh hƣởng đến sự phát sinh cơ quan của sẹo. Tuy không có sự khác biệt rõ với đối chứng nhƣng chứng tỏ khuẩn có khả năng tổng hợp một lƣợng cytokinin cho sự phát triển rễ của mô sẹo, ảnh hƣởng đến tỷ lệ auxin/cytokinin có trong môi trƣờng dẫn đến sự thay đổi của mẫu so với đối chứng. - Chủng 1019 có ảnh hƣởng đến quá trình phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20 , chiều hƣớng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mô cấy và loài thực vật. - Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hoàn toàn mô sẹo, không thấy đƣợc sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo. Nhƣ vậy, chủng 1019 có khả năng ảnh hƣởng đến chiều hƣớng phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20, nhƣng khuẩn chỉ có khả năng kích thích sự tái sinh rễ từ mô sẹo nhƣng lại ức chế khả năng tái sinh chồi- sự tái sinh chồi là chiều hƣớng biệt hoá quan trọng nhất, đƣợc áp dụng nhiều trong các phƣơng pháp chọn lọc giống, phƣơng pháp chuyển gen… trên cây lúa. Do đó ta có thể kết luận rằng chủng 1019 không có tác động tích cực lên sự phát sinh cơ quan của cây lúa. Tuy nhiên từ những kết quả mà các tác giả [9], [46] đã đạt đƣợc bằng việc sử dụng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên thực vật, chúng ta có thể tin tƣởng rằng Methylobacterium sp. sẽ là một loài vi sinh vật tiềm năng tạo ra các cây giống in vitro có phẩm chất tốt, góp phần làm tăng hiệu quả trong sản xuất nông nghiệp. 59 5.2 Đề nghị Trong phạm vi đề tài này, do thời gian tiến hành có hạn chúng tôi chỉ đạt đƣợc một số kết quả nhất định về sự phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20 dƣới sự tác động của Methylobacterium sp. trong điều kiện nuôi cấy in vitro, chƣa khảo sát đƣợc khả năng sống sót cũng nhƣ phát triển của các mẫu nhiễm khuẩn tái sinh trong giai đoạn vƣờn ƣơm để xác định rõ hơn nữa ảnh hƣởng của Methylobacterium sp. lên giống lúa này. Vì thế chúng tôi có những đề nghị để củng cố thêm kết quả mà đề tài đạt đƣợc và hƣớng phát triển trong tƣơng lai: - Khảo sát ảnh hƣởng của Methylobacterium sp. lên sự tăng trƣởng của giống lúa VĐ20 trong giai đoạn vƣờn ƣơm. - Khảo sát ảnh hƣởng của các chủng Methylobacterium khác lên các giống lúa khác nhau để xác định chính xác hơn khả năng ảnh hƣởng của khuẩn lên cây lúa. - Bên cạnh đó khảo sát ảnh hƣởng của các chủng Methylobacterium khác nhau lên các đối tƣợng thực vật khác nhau để xác định chủng mạnh nhất và đối tƣợng mà khuẩn có tác động tốt nhất. - Phân tích xác định rõ khả năng tổng hợp và hàm lƣợng các vitamine, enzyme, chất kích thích tăng trƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. để tìm hiểu rõ cơ chế tƣơng tá