Luận văn Khảo sát các đặc điểm hóa sinh, hóa lý và phân tích chất lượng mùi thơm của gạo Nàng thơm chợ Đào bằng phương pháp SPME-GC

C trong thời kỳ chín) sẽ có khả năng lƣu giữ mùi thơm lâu hơn (Juliano, 1972; Mann, 1987) [36, 43]. 2.5.2. Nơi gieo trồng Địa điểm gieo trồng ảnh hƣởng đến chất lƣợng mùi thơm của cơm gạo thông qua thành phần dinh dƣỡng đất cung cấp cho cây và tƣơng tác giữa các chất dinh dƣỡng bay hơi trong đất với các hợp chất thơm bay hơi có trong gạo. Theo Singh và ctv (1998) [56], có thể xảy ra sự khác biệt đáng kể về mùi thơm trong gạo đƣợc trồng trên 2 thửa ruộng kề nhau thậm chí ngay cả khi 2 ruộng trồng cùng một loại hạt giống. Theo ý kiến của ngƣời nông dân, gạo đƣợc trồng trên đất nhẹ và chân ruộng cao thuận lợi cho quá trình hình thành mùi thơm của lúa. Lúa có mùi thơm hơn khi trồng trên chân đất pha sét, có bờ bao và đƣợc cung cấp nƣớc đầy đủ (Singh và ctv, 1997) [55]. Tuy nhiên, gạo sẽ thơm hơn nếu độ ẩm của đất gieo trồng giảm trong thời kỳ hạt chín (theo Sarkarung và ctv, 2000) [51]. Yoshihashi và ctv (2004) [75] cho rằng hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline không chỉ bị ảnh hƣởng bởi yếu tố di truyền mà còn chịu tác động của các điều kiện ngoại cảnh: điều kiện sinh thái, cách gieo trồng. Do các điều kiện sinh thái nhƣ nƣớc tƣới, chất dinh dƣỡng trong đất ở các vùng khác nhau thì khác nhau nên hàm lƣợng 2 – AP trong gạo thơm giữa các vùng sẽ có sự khác biệt. Hàm lƣợng 2 – AP ở những vùng chủ động tƣới tiêu thấp hơn so với vùng lúa nƣớc trời. 2.5.3. Phân bón Phân đạm Việc bón phân đạm sẽ tạo ảnh hƣởng bất lợi đối với chất lƣợng mùi thơm. Lƣợng phân đạm trong đất thấp sẽ gia tăng hàm lƣợng chất thơm trong hạt gạo (Suwanarit và ctv, 1996) [61]. Bón phân thúc làm tăng hàm lƣợng protein, nhƣng lại giảm mùi vị của cơm gạo. Bón phân đạm ở giai đoạn phân hóa đòng có thể không tạo nên sự thay đổi hàm lƣợng protein, nhƣng vẫn làm giảm mùi vị của cơm (Singh, 1997) [55]. Phân kali Phân kali có ảnh hƣởng tích cực đến chất lƣợng xay xát và hƣơng vị của cơm gạo. Nếu bón nhiều kali sẽ làm tăng mùi thơm và góp phần làm gạo sáng hơn, nhƣng độ mềm cơm giảm (Suwanrit và ctv, 1997b) [62]. Nguyên tố đa lƣợng S Việc bổ sung lƣu huỳnh vào đất thiếu lƣu huỳnh sẽ góp phần tăng chất lƣợng mùi thơm của cơm gạo. Tuy nhiên, nếu lạm dụng quá mức sẽ gây tác dụng ngƣợc đến mùi vị của cơm gạo (Singh và ctv, 2000) [57]. 2.5.4. Tập quán gieo trồng Các tập quán gieo trồng nhƣ phƣơng pháp chuẩn bị đất, cách gieo trồng, thời gian cấy và thời vụ thu hoạch có ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng và hàm lƣợng chất thơm của gạo thơm (Canellas và ctv, 1997) [22]. Theo Singh và ctv (1998) [56], gạo sẽ cho chất lƣợng mùi thơm cao hơn khi xạ thẳng. Bên cạnh đó, thời vụ thu hoạch cũng ảnh hƣởng đến tính thơm của gạo. Nếu thu hoạch muộn sẽ làm giảm mùi vị của cơm gạo. Nguyên nhân của ảnh hƣởng này là do hiện tƣợng thoái hóa hoặc thay đổi các thành phần trong hạt dƣới tác động của nhiệt độ, độ ẩm, côn trùng và vi sinh vật gây hại (Rahim và ctv, 1995) [48]. 2.5.5. Cách bảo quản và xay xát Ở hầu hết các quốc gia, gạo thƣờng đƣợc bảo quản và vận chuyển ở dạng chƣa xay xát. Theo Daniels và ctv (1997) [25], bảo quản gạo trong điều kiện ẩm ƣớt trƣớc khi đem phơi khô sẽ ảnh hƣởng xấu đến đặc tính và mùi vị của cơm gạo. Mặc dù chƣa có phƣơng pháp cụ thể nào để đánh giá ảnh hƣởng của việc xay xát đối với tính thơm của gạo đặc sản, nhƣng chắc chắn rằng việc xay xát có ảnh hƣởng mạnh mẽ đối với hàm lƣợng chất thơm. Theo các nông dân ở Tapovan (VP), chà xát gạo theo phƣơng pháp thủ công sẽ lƣu giữ đƣợc mùi thơm và chất lƣợng hạt gạo hơn so với việc sử dụng máy xay xát (Singh và ctv, 2000) [57]. Năm 2004, Wongpornchai và ctv [70] đã công bố cách xử lý sau thu hoạch tốt nhất là sấy hoặc phơi ở nhiệt độ 300C – 400C. Hơn nữa, thời gian lƣu trữ ngắn sẽ đảm bảo chất lƣợng mùi thơm tốt hơn so với bảo quản trong thời gian dài. Bảng 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến việc hình thành và lƣu giữ mùi thơm trong gạo thơm (nguồn Singh và ctv, 2000) [57] Các yêu tố góp phần gia tăng chất lƣợng mùi thơm Các yếu tố làm suy giảm chất lƣợng mùi thơm Thời tiết mát mẻ trong thời kỳ ra hoa và hạt chín Bón phân với liều lƣợng thích hợp Đất màu mỡ Gieo hạt trực tiếp Đất nhẹ, chân ruộng cao Nhiệt độ tăng cao trong thời kỳ ra hoa và hạt chín Phân bón chứa lƣợng urê quá cao Đất nghèo dinh dƣỡng Trồng lúa theo hình thức gieo xạ Đất nặng Độ ẩm trong đất thấp trong giai đoạn hạt chín Xay xát thủ công Thu hoạch muộn Sử dụng máy móc trong giai đoạn xay xát lúa 2.6. PHƢƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME) 2.6.1. Nguyên tắc [33] SPME là 1 phƣơng pháp chiết xuất không cần sử dụng dung môi, đƣợc phát minh bởi Pawliszyn và cộng sự từ năm 1989. Phƣơng pháp này dựa trên cơ chế hấp phụ các chất hữu cơ cần phân tích từ pha nƣớc hoặc pha khí lên sợi silica đƣợc phủ các chất hấp phụ thích hợp nhƣ polydimethylsiloxan (PDMS), PDMS/DVB (divinyl benzen), polyacrylat…thông qua tác động phân chia giữa những chất đƣợc hấp phụ và hỗn hợp mẫu. Quá trình hấp phụ diễn ra khi nhúng sợi chiết vào mẫu lỏng hay khi phơi sợi chiết ra môi trƣờng phía trên mẫu lỏng hay rắn. Các hợp chất bám trên sợi silica sẽ đƣợc giải hấp phụ trực tiếp vào buồng hóa hơi của thiết bị sắc ký khí. 2.6.2. Đặc điểm [33] Kỹ thuật này kết hợp các giai đoạn chuẩn bị mẫu, chiết xuất, cô cạn mẫu thành 1 bƣớc đơn giản, không cần sử dụng dung môi. Các chất cần phân tích sẽ đƣợc chiết xuất và làm giàu trực tiếp vào sợi chiết. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm thời gian chuẩn bị mẫu và lƣợng dung môi sử dụng, và có thể cải thiện đƣợc giới hạn dò. Thuận lợi chính của phƣơng pháp là khả năng phân tích tốt, đơn giản, giá thành thấp. Sản phẩm thu đƣợc từ phƣơng pháp SPME tƣơng đối sạch và cô đặc, khả năng ứng dụng MS cao. Kỹ thuật SPME thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với GC và GC/MS. Kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng thành công trong việc phân tích nhiều thành phần khác nhau, đặc biệt, trong quá trình chiết xuất những thành phần hữu cơ bay hơi có trong những mẫu phân tích môi trƣờng, sinh học, thực phẩm, dƣợc phẩm. Sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME có thể đƣợc đƣa trực tiếp vào hệ thống HPLC và LC/MS để phân tích những thành phần bay hơi kém hay không bền nhiệt không thể thực hiện trên thiết bị GC hay GC/MS. Thời gian chiết xuất phụ thuộc vào các yếu tố: loại sợi chiết sử dụng, kích thƣớc mẫu, bề dày lớp polymer. Sử dụng sợi chiết có lớp polymer càng dày thì thời gian chiết xuất càng dài, nhƣng hệ số lặp lại càng cao. Thời gian chiết xuất không phụ thuộc nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu. Thông thƣờng, lớp film có bề dày mỏng nhất ở mức độ có thể chấp nhận đƣợc thƣờng đƣợc sử dụng để giảm thời gian chiết xuất. 2.6.3. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME [33] Hình 2.6. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME Sợi chiết đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SPME là một đoạn sợi quang học có chứa silica biến tính, ngắn và mỏng (dài khoảng 1 cm, đƣờng kính ngoài cỡ 0,11 mm), đƣợc bao phủ bên ngoài bởi một lớp polyme mỏng (ví dụ polydimethylsiloxane) (hình 2.6). Sợi chiết này khá ổn định cả ở nhiệt độ cao và có cấu tạo hóa học tƣơng nhƣ phía bên trong của cột mao quản silica biến tính sử dụng trong phƣơng pháp sắc ký khí. Sợi chiết đƣợc gắn với một cần kim loại, tất cả đƣợc đặt trong ống kim loại bảo vệ. Để thuận tiện khi sử dụng, toàn bộ hệ sợi chiết và các bộ phận phụ trợ đƣợc bố trí theo kiểu xyranh (hình 2.7). Hình 2.7. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME Nhiều loại pha tĩnh tẩm cho sợi chiết đƣợc nghiên cứu với mục đích chiết các nhóm chất khác nhau. Giống nhƣ qui tắc khi lựa chọn cột sắc ký khí “các chất giống nhau dễ hòa tan trong nhau”, pha tĩnh tẩm sợi chiết cũng đƣợc lựa chọn trên cơ sở độ chọn lọc đối với các chất cần phân tích đã định và khả năng bay hơi của những chất này. Các pha tĩnh không phân cực (ví dụ: polymethylsiloxan) lƣu giữ hydrocacbon rất tốt. Ngƣợc lại, pha tĩnh phân cực (nhƣ polyacrylat và cacbowax) lại chiết đƣợc các hợp chất phân cực nhƣ phenol, acid cacboxylic rất hiệu quả. Ái lực của pha tĩnh đối với chất cần phân tích có tính chất quyết định trong việc lấy mẫu theo SPME vì cả nền mẫu và pha tĩnh đều cạnh tranh trong tƣơng tác với chất phân tích. Ví dụ, một pha tĩnh đƣợc lựa chọn để chiết các chất phân cực ra khỏi nƣớc phải có ái lực với chất phân tích mạnh hơn ái lực của nƣớc với chất đó thì mới có thể thực hiện đƣợc quá trình chiết theo yêu cầu. 2.6.4. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật vi chiết xuất trên pha rắn [33] Kỹ thuật chiết SPME gồm 2 giai đoạn: (1) phân bố chất phân tích giữa mẫu và pha tĩnh của sợi chiết, (2) chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp từ pha tĩnh của sợi chiết và chuyển vào thiết bị phân tích. Hình 2.8. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nƣớc chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích đƣợc đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có septum. Khi lấy mẫu, ống kim loại bảo vệ chứa sợi chiết SPME đâm xuyên qua septum, sau đó pittông sẽ đẩy sợi chiết lộ ra khỏi ống kim loại bảo vệ. Sợi chiết đƣợc nhúng vào mẫu lỏng hoặc nằm trong không gian hơi phía trên pha mẫu (headspace) (hình 2.8). Chất phân tích đƣợc chiết từ mẫu vào pha tĩnh của sợi chiết. Sau thời gian hấp phụ, sợi chiết đƣợc kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra khỏi lọ đựng mẫu. Sau đó ống bảo vệ chứa sợi chiết đƣợc đƣa vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng cao áp, pittông lại đẩy sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ. Lúc này, sợi chiết tiếp xúc với môi trƣờng nhiệt độ cao trong bộ phận bơm mẫu của GC, các chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp nhiệt và chuyển vào cột sắc ký khí. Trong HPLC, dung môi đƣợc sử dụng để giải hấp chất phân tích khỏi sợi chiết. Sau các quá trình giải hấp này, sợi chiết lại đƣợc kéo vào lòng ống bảo vệ và rút ra khỏi bộ phận bơm mẫu. 2.6.5. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline [32] Grimm và ctv (2001) đã ứng dụng kỹ thuật SPME để khảo sát qui trình phân tích hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo thơm. Theo họ, lƣợng 2 – AP thu đƣợc sẽ tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ từ 60oC lên 85oC. Ngƣợc lại, hàm lƣợng chất chuẩn 2,4,6 – trimethylpyridine sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lƣợng 2 – AP khi chiết xuất mẫu ở 80°C và 85°C, do đó, 80°C đƣợc xem là điểm nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết suất. Khoảng thời gian từ 10 – 15 phút đủ để thu nhận hầu hết các chất bay hơi, trong khi những thành phần ít bay hơi hơn nhƣ acid hữu cơ hay ester phải tốn hàng giờ mới có thể thu nhận đƣợc. Sau khi so sánh lƣợng 2 – AP thu đƣơc sau khoảng thời gian hấp phụ là 10, 15, 20 phút, họ đã rút ra kết luận thời gian chiết xuất mẫu phù hợp nhất là 15 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc thêm nƣớc vào mẫu gạo sẽ giúp tăng hàm lƣợng 2 – AP thu nhận đƣợc, đồng thời giảm đƣợc yêu cầu phải nghiền mẫu, góp phần đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu. Lƣợng nƣớc cất tối ƣu sử dụng cho quá trình chiết suất là 200 µl. Để xác định lƣợng 2 – AP hấp thu, diện tích peak đƣợc chuyển thành khối lƣợng bằng cách dựng đƣờng chuẩn dựa trên chuẩn 2 – AP pha loãng trong CHCl3. Theo kết quả nghiên cứu của Casey và ctv (2001), hàm lƣợng 2 – AP trung bình thu đƣợc trong mẫu gạo Jasmine khi phân tích bằng phƣơng pháp SPME là 2,2 ng trong 0,75 g gạo, tƣơng đƣơng với 2,9 ppb. Phƣơng pháp SPME phù hợp cho việc so sánh mối tƣơng quan về nồng độ 2 – AP giữa các mẫu gạo khác nhau. Nhìn chung, trong tất cả các trƣờng hợp, phƣơng pháp SPME có thể phân biệt giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng. Cấu tử 2 – AP đƣợc phân tách ở 5 phút 42 giây, và chỉ chiếm 1 lƣợng nhỏ trong tổng số các chất bay hơi, nhƣng lƣợng này đủ để chiếm ƣu thế trong thành phần chất thơm có trong cơm gạo. 2.7. SẮC KÝ KHÍ (Gas Chromatography - GC) [10] 2.7.1. Nguyên tắc Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong gạo thơm sẽ bị hấp thụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau nên có thời gian lƣu khác nhau. Trên cơ sở khác nhau về thời gian lƣu này mà ngƣời ta có thể định tính và định lƣợng cấu tử cần nghiên cứu. 2.7.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí Hình 2.9. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector. Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả . Trên sắc đồ nhận đƣợc, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là peak. Thời gian lƣu của peak là đại lƣợng đặc trƣng (định tính) cho chất cần tách. Còn diện tích của peak là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu. 2.7.2.1. Detector Hình 2.10. Sơ đồ cấu tạo hình học của detector ion hóa ngọn lửa Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lƣợng không điện (trong trƣờng hợp này là nồng độ của các chất đƣợc tách khỏi cột sắc ký) thành đại lƣợng điện. Ngày nay, đã có gần 30 loại detector khác nhau. Trong đó, 3 loại detector phổ biến nhất là: detector dẫn nhiệt (TCD), detector ion hóa ngọn lửa (FID) và detector cộng kết điện tử (ECD). Detector FID (hình 2.10) là một trong những detector có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trƣờng khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tƣơng ứng. Các ion tạo thành đƣợc chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa. Dòng ion đó đƣợc giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (108 – 1012 Ω) và độ giảm hiệu điện thế này đƣợc khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số lƣợng ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu tố sau: Cấu trúc hình học của detector Tỉ lệ thành phần hydro/không khí Nhiệt độ của ngọn lửa Cấu trúc của các phân tử mẫu cần xác định Các hợp chất hữu cơ đƣợc đốt cháy bằng ngọn lửa hydro – không khí tạo thành các ion. Khí mang từ cột sẽ đƣợc trộn trƣớc với hydro và đốt cháy bằng ngọn lửa ở buồng đốt. Một điện cực hình trụ đƣợc đặt cách vài milimet phía trên ngọn lửa để thu thập các ion sinh ra. Dòng ion này sẽ đƣợc đo bằng cách đặt một hiệu điện thế giữa đầu phun của ngọn lửa và điện cực hình trụ. Để hạn chế đến mức tối đa sự tái kết hợp của các ion, phải đặt điện thế chọn lọc vào vùng bão hòa (vùng mà khi tăng điện thế sẽ không làm tăng dòng ion). Các tín hiệu tạo thành sẽ đƣợc khuếch đại bằng bộ khuếch điện tử rồi qua bộ xử lý và ghi tín hiệu. Detector FID sử dụng thích hợp nhất đối với các hợp chất chứa cacbon. 2.7.2.2. Cột mao quản Sắc ký khí mao quản là một hình thái đặc biệt của phƣơng pháp sắc ký khí, đƣợc đặc trƣng bởi năng suất tách và hiệu suất phân giải rất cao. Sở dĩ nhƣ vậy là nhờ việc sử dụng các cột mao quản hở với chiều dài khá lớn (25m, 50m, 100m,...). Cột mao quản (hình 2.11) là loại cột tách với đƣờng kính nhỏ hơn 1mm và thành trong của cột đƣợc tẩm pha tĩnh. Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đƣa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất rất cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (về độ chênh lệch áp suất), các cấu tử sẽ tƣơng tác với pha tĩnh bám trên thành cột và đƣợc pha tĩnh lƣu giữ lại với mức độ khác nhau,… Hình 2.11. Cột mao quản 2.8. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) [10] Sắc ký khối phổ là một loại sắc ký đặc biệt, vì sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần đƣợc lần lƣợt cho vào buồng MS để thực hiện việc ghi phổ của từng cấu phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này đƣợc so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thƣ viện của máy tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so sánh, thƣ viện phổ khối lƣợng cần phải có nhiều phổ chuẩn. Độ tƣơng hợp giữa phổ MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính tƣơng đối tùy thuộc phần mềm phụ trách việc so sánh, thƣờng thì độ tƣơng hợp càng lớn thì xác suất định danh càng cao. Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lƣợng có tính quyết định rất lớn đến độ chính xác của kết quả định danh. Đầu dò phổ khối lƣợng có độ nhạy cao, khoảng 10-6 – 10-9 g, do đó có thể xác định đƣợc những cấu phần có hàm lƣợng thấp mà các phƣơng pháp khác không thể thực hiện đƣợc. Sắc ký khối phổ có khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh, lƣợng mẫu sử dụng ít. 2.9. PHƢƠNG PHÁP KJELDAHL [5] Nguyên tắc Trƣớc tiên mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra nhƣ sau: 2H2SO4 = 2H2O + 2SO2↑ + O2 Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dƣới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amin, carbon và hidro của acid amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ đƣợc giải phóng dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg…chuyển thành dạng oxid: P2O5, K2O, CaO, MgO… Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH: (NH4)2SO4 + 2NaOH = NaSO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay ra cùng với nƣớc sang bình hứng, bình hứng chứa H3BO3 2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH  Thời gian: từ 4/2006 – 8/2006.  Địa điểm lấy mẫu: Bảng 3.1. Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm Địa Điểm Loại mẫu Số Lƣợng Mẫu Các chợ bán sỉ và lẻ trên địa bàn TP. HCM Mẫu gạo 12 Các siêu thị trên địa bàn TP. HCM Mẫu gạo 5 Viện khoa học nông nghiệp miền Nam (IAS) Mẫu lúa 31 Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long Mẫu lúa 15 Siêu thị Carrefour (Pháp) Mẫu gạo 3 Tổng cộng 66  Địa điểm tiến hành thí nghiệm: trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ  Vật liệu: gạo và lúa Nàng Thơm Chợ Đào.  Hóa chất sử dụng: Hóa chất dùng trong phân tích hàm lƣợng chất thơm: ethanol (Merck), acetone (Merck), methanol (Merck), 2,4,6-collidine (2,4,6-trimethyl pyridine) (Sigma). Hóa chất dùng trong phân tích protein: K2SO4, CuSO4, H2SO4 đđ, H3BO3 4%, chỉ thị màu, parafin, NaOH 32%, HCl 0,25N (Trung Quốc).  Dụng cụ và thiết bị: Tủ mát, Darling (Việt Nam). Tủ lạnh, Hitachi (Japan). Máy bóc vỏ trấu, khoa Cơ Khí Công Nghệ trƣờng đại học Nông Lâm. Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức). Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ). Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies (Mỹ). Kim SPME (SupelcoTM SPME fiber holder) – Bellefonte, PA (Mỹ). Máy nhiệt từ, Ikamag (Đức). Máy Scan, Epson Perfection 1260. Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc). Tủ sấy, Memmert (Đức). Hệ thống phân tích đạm tự động, Gerhardt (Đức). Kìm đóng nắp, Mỹ. Micropippet loại 10 – 100 μl, đầu típ 100 μl, cá từ, nắp nhôm. Lọ bi 10ml, Agilent (Mỹ). Bình tam giác 250 ml (Trung Quốc). 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Khảo sát đặc điểm hóa lý của gạo Nàng Thơm Chợ Đào.  Phân tích hàm lƣợng protein có trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào.  Xác định nồng độ chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo NTCĐ. 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các mẫu gạo và mẫu lúa sau khi thu thập về đƣợc trữ trong tủ mát 6oC cho đến khi tiến hành phân tích. Mẫu lúa đƣợc bóc vỏ trấu để dùng cho phân tích các thành phần chất thơm và đƣợc chà xát để xác định các đặc điểm hóa lý và hóa sinh. 3.4.1. Khảo sát đặc điểm hóa lý của gạo Nàng Thơm Chợ Đào (theo Singh và ctv, 2000) [57] 3.4.1.1. Hình dạng hạt gạo Chọn ngẫu nhiên 10 hạt gạo còn nguyên vẹn, đo kích thƣớc hạt gạo bằng phần mềm SigmaScan Pro5. Dựa trên kích thƣớc hạt gạo, xác định tỉ lệ dài/rộng của hạt gạo. Chọn ngẫu nhiên một lƣợng lớn hạt gạo (hạt còn nguyên và hạt bị gãy vỡ), đo kích thƣớc hạt gạo bằng phần mềm SigmaScan Pro5. Dựa trên kích thƣớc hạt gạo, xác định tỉ lệ gạo nguyên. 3.4.1.2. Xác định tỉ lệ bạc bụng Chọn ngẫu nhiên 25 hạt gạo còn nguyên vẹn, đo diện tích bạc bụng bằng phần mềm SigmaScan Pro5. Quá trình khảo sát các đặc điểm hóa lý đƣợc thực hiện 3 lần ở mỗi mẫu gạo. 3.4.2. Phân tích hàm lƣợng protein tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl Hình 3.1 Hệ thống phân tích đạm tự động Mẫu gạo Loại bỏ tạp, cho mẫu vào các túi giấy và sấy khô mẫu ở 80°C cho đến khi trọng lƣợng không đổi Vô cơ hóa mẫu: cân 0,5 g mẫu cho vào ống vô cơ hóa mẫu Thêm vào 5 g hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4 (10:1) Dùng pipet hút 15 ml H2SO4 đậm đặc (d = 1,84) cho vào ống vô cơ hóa mẫu + 5 giọt parafin Lắp các ống vô cơ hóa mẫu có chứa mẫu, xúc tác và H2SO4 vào bộ đốt và chạy theo qui trình vô cơ hóa mẫu sau: - Bƣớc 1: 30°C  80°C trong 15 phút - Bƣớc 2: 80°C  120°C trong 10 phút - Bƣớc 3: 120°C  250°C trong 10 phút - Bƣớc 4: 250°C  400°C trong 2 giờ Thời gian làm mát: 15 phút Tắt bộ đốt mẫu và tiến hành chƣng cất mẫu: lắp ống vô cơ hóa mẫu vào bô chƣng cất, và lắp bình hứng chứa 20 ml H3BO3 4% + 1 giọt hỗn hợp chỉ thị thị màu. Khởi động máy cất, bổ sung thêm 50 ml nƣớc cất 2 lần và 80 ml NaOH 32%, khi NH3 đã đƣợc cất hoàn toàn, hạ bình hứng xuống, dùng tia nƣớc cất nhỏ tráng sạch acid dính đầu ống làm lạnh ... Sơ đồ 3.1. Qui trình phân tích hàm lƣợng protein trong gạo Trong đó: VHCl: thể tích HCl dùng để chuẩn độ (ml) Pmẫu: khối lƣợng mẫu dùng trong phân tích (g)  Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần. Hình 3.1. Hệ thống phân tích đạm tự động 3.4.3. Chiết xuất hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [49, 47] Qui trình thực hiện Sơ đồ 3.2. Qui trình phân tích hợp chất bay Hình 3.2. Hệ thống máy nhiệt từ hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME Thuyết minh qui trình Cân 1,5 ± 0,1g gạo (hoặc lúa đã bóc vỏ trấu) cho vào lọ bi 10 ml, thêm 200 μl nƣớc khử ion và cá từ vào lọ, đậy nắp. Cho vào bộ giữ nhiệt của máy khuấy từ đã đƣợc thiết lập ở nhiệt độ 80 0C, 250 vòng/phút trong 5 phút. Đây là giai đoạn ủ để các chất bay hơi trong gạo và phần không khí có trong lọ đạt đƣợc pha cân bằng trƣớc khi tiến hành chiết xuất. Sau 5 phút, nhúng sợi chiết vào lọ bi. Đây chính là giai đoạn chiết xuất các chất bay hơi có trong gạo. Giai đoạn hấp phụ này kéo dài trong 15 phút ở 800C. Trong giai đoạn này các chất bay hơi trong gạo sẽ đƣợc hấp phụ vào sợi chiết. Sau khi kết thúc giai đoạn chiết xuất, bơm mẫu vào máy GC để bắt đầu giai đoạn phân tích các cấu tử bay hơi có trong gạo. Hình 3.3. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME (DVB/CAR/PDMS) Cân 1,5 g gạo Ủ ở 800C trong 5 phút Nhúng sợi chiết vào lọ bi trong 15 phút ở 800C Bơm mẫu vào máy GC 3.4.4. Định tính và định lƣợng hợp chất thơm 2 – AP trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào bằng GC và GC/MS 2 – acetyl – 1 – pyrroline đƣợc định danh bằng hệ thống máy GC/MS và định lƣợng trên GC. Chƣơng trình nhiệt và các thông số thực nghiệm đƣợc điều chỉnh trên GC, các thông số này đƣợc tối ƣu hóa và áp dụng trên GC/MS. 3.4.4.1. Trên sắc ký khí (GC)  Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng  Cột Model No: Agilent 19091J – 113 HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane, 30m x 320 μm x 0,5 μm Tốc độ dòng: 1,9ml/phút  Nhiệt độ lò: 40oC  Detector FID: 2500C Dòng H2: 30ml/phút Dòng không khí: 300ml/phút Dòng N2: 30ml/phút  Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. 3.4.4.2. Trên sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)  Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng  Cột Agilent 19091J – 413 HP-5, 0,25 mm x 30 m x 0,25 m.  Nhiệt độ lò: 40oC  Đầu dò MS: 250oC  Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban Hình 3.3 Máy sắc ký khí ghép khối ph Hình 3.5 s c í é i phổ Hình 3.4. Máy sắc ký khí đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. 3.4.5. Xác định hệ số phản hồi (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [49, 47] 3.4.5.1. Xác định hệ số phản hồi theo chất ngoại chuẩn collidine Do hợp chất 2 – AP rất khó tổng hợp, lại không bền nên không đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng. Nếu muốn sử dụng hợp chất 2 – AP để dựng đƣờng chuẩn thì phải tự tổng hợp. Do điều kiện phòng thí nghiệm chƣa đủ để tổng hợp tại chỗ hợp chất 2 – AP nên chúng tôi đã sử dụng collidine nhƣ một chất ngoại chuẩn thay thế. Chuẩn bị 7 dung dịch collidine có nồng độ 0,01 mg/ml. Bơm lần lƣợt 1,2 μl mỗi dun