Luận văn Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis

o bên ngoài. 10  Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử. 2.3. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và sự loạn khuẩn 2.3.1.Hệ vi sinh vật đƣờng ruột Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), ở ruột và dạ dày động vật khi mới sinh ra hoàn toàn không có vi khuẩn, sau vài giờ từ khi chúng sinh ra mới thấy có sự xuất hiện của một vài vi khuẩn và từ đó chúng bắt đầu sinh sản dần. Sau đó một vài vi khuẩn khác sẽ theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá, sống và sinh sôi nảy nở ở đó, chúng sẽ biến đổi ít nhiều nhưng cơ bản chúng vẫn tồn tại cho đến khi con vật chết. Thành phần, số lượng của vi sinh vật đường tiêu hoá phụ thuộc vào tuổi tác của gia súc, cách nuôi dưỡng, chăm sóc…ngoài ra còn có các điều kiện vật lí, hoá học của môi trường đường tiêu hóa. Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970) và nhiều tác giả khác, có thể chia hệ vi sinh vật đường tiêu hoá ra làm 2 nhóm:  Nhóm vi sinh vật tuỳ nghi Một số những vi sinh vật này là những vi sinh vật có hại, chúng thay đổi theo điều kiện thức ăn, môi trường, đường tiêu hoá, khả năng đề kháng của cơ thể…như: Samonella, Klebsiella, E. coli, Clostridium, Shigella, Staphylococus…. Đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm. Dưới những điều kiện môi trường thích hợp chúng phát triển, sản sinh độc tố xâm nhập phá vỡ tế bào đường ruột, gây tổn thương thành đường ruột nguy hại cho gia súc gia cầm.  Nhóm vi sinh vật bắt buộc Đây là những vi sinh vật chịu được độ pH thấp, chúng phát triển tốt trong đường ruột của gia súc, gia cầm và định cư vĩnh viễn ở đó. Đa số chúng có thể giúp cơ thể động vật tiêu hoá thức ăn tốt hơn nhờ vào hệ thống enzyme của chúng và giúp cơ thể phòng chống một số bệnh do vi sinh vật cơ hội gây ra. Nhóm vi sinh vật bắt buộc gồm có:  Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococus lactic (hiện nay gọi là Lactococus lactis), Bacillus subtilis, Bifidobacterium, Cellulosemonas…  Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bouladii… 11  Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor spp…  Protozoa: Entodinium, Diploinium… Ngoài ra, người ta cũng chia hệ vi sinh vật đường ruột ra làm 3 nhóm dựa vào số lượng của chúng có trong đường ruột như  Nhóm hệ phổ chính: chiếm tổng số trên 90% số lượng vi sinh vật đường ruột như: Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacterioides…  Nhóm hệ phổ vệ tinh chiếm dưới 10% bao gồm: nấm men, Clostridium, Proteus, Samonella…  Nhóm tuỳ nghi: chiếm 0,1% gồm: Clostridium, Samonella… (Tô Minh Châu, 2000) Hai nhóm vi sinh vật trên luôn ở trạng thái cân bằng động và cũng là điều kiện cần thiết bảo đảm cho sức khoẻ vật chủ. Cũng có thể hai nhóm vi khuẩn khác nhau tranh chấp cùng một chất dinh dưỡng có khối lượng rất ít trong ống tiêu hoá. Vi khuẩn nào đồng hoá chất dinh dưỡng này tốt thì sẽ loại trừ vi khuẩn kia. Một số vi khuẩn có thể làm thay đổi một số đặc điểm lí hoá của hệ thống tiêu hoá như: độ pH, tiềm năng oxy hoá khử, nồng độ các chất chuyển hoá làm cho một số vi sinh vật khác phát triển hoặc không phát triển được (Nguyễn Kiều Uyên Vi, 2004). 2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đƣờng ruột Giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn nhờ vào hệ enzyme. Đa số các vi khuẩn có lợi trong đường ruột tham gia vào quá trình tiêu hoá, phân giải tinh bột, đường, đạm và chất xơ thành những sản phẩm dễ hấp thu hơn. Nhóm này gồm những vi sinh vật sinh một số enzyme có khả năng phân huỷ các chất trên: amylase, protease, glucanase, cellulase… gồm các vi khuẩn Lactic, Bacillus subtilis, Isotrichs, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… Theo Nguyễn Thị Vân Hương (1990), bổ sung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm được hệ số chuyển biến thức ăn trên 1 kg tăng trọng, làm tăng sức kháng bệnh của gà làm giảm tỉ lệ chết, từ đó góp phần làm tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. Đối với thú trưởng thành tiêu hoá chủ yếu nhờ enzyme thì sự xuất hiện của vi sinh vật sản sinh enzyme cũng giúp thú tiêu hoá thức ăn tốt hơn. So với enzyme tổng 12 hợp, nguồn enzyme của các vi sinh vật tương đối lí tưởng, do có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn từ động vật và thực vật như:  Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh.  Nguồn nguyên liệu dễ nuôi cấy, dễ kiếm và rẻ tiền.  Các enzyme của vi sinh vật có hoạt tính cao. Ngoài ra, có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để đạt được hiệu quả cao trong sản xuất (Trần Thị Minh Chiến, 2002). 2.3.3. Sự loạn khuẩn Từ loạn khuẩn được Nissle đưa ra vào năm 1916. Ông cho rằng các vi khuẩn có trong ruột người và gia súc luôn ở thế quân bình để đảm bảo cho sự tiêu hoá bình thường của vật chủ. Thế quân bình này dựa vào 2 cơ chế: (1) Cùng tranh giành chất dinh dưỡng nào đó cần cho sự sinh trưởng của chúng. (2) Chúng có thể tiết ra chất có tính kháng đối với các vi khuẩn khác.  Các nguyên nhân gây loạn khuẩn: Theo Tô Minh Châu (2004) thì có 3 nguyên nhân:  Do kháng sinh có phổ rộng lâu ngày làm mất đi sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột.  Do yếu tố ngoại cảnh: thức ăn kém phẩm chất, thú bị stress, thay đổi thời tiết, vệ sinh kém…  Do yếu tố sinh lý của thú con: Sức đề kháng của cơ thể còn yếu…  Cơ chế của hiện tƣợng loạn khuẩn Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), khi cơ thể khoẻ mạnh, hai nhóm vi sinh vật bắt buộc và tuỳ nghi luôn ở thế cân bằng có lợi nhờ cơ chế cạnh tranh sinh học. Khi một trong hai hệ này mất cân bằng thì dễ gây ra sự rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột. Thông thường, hệ vi khuẩn tuỳ nghi lấn át hệ vi khuẩn bắt buộc. Dưới tác động của một vài điều kiện bất lợi nào đó, làm cho sức đề kháng của cơ thể giảm hoặc do dùng kháng sinh lâu ngày, trúng độc…làm cho hệ vi sinh vật đường ruột bị thay đổi về số lượng, về các dòng vi khuẩn cũng như vị trí cư trú của chúng. Từ đó, gây giảm độ tiêu hoá, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối hoạt động, gây ra quá trình thối rửa, phân giải các chất trong ruột sinh ra khí CO2, H2S, CH4… Những 13 chất này sẽ phá huỷ các phản ứng bình thường trong dạ dày, ruột phá hoại quá trình tạo men của thức ăn, gây ra những phản ứng trên ống tiêu hoá như: biểu mô niêm mạc bị phồng lên, rộp ra và tróc đi tạo điều kiện cho thuận lợi cho sự xâm nhập của những vi khuẩn gây hại. Do đó để ổn định hệ vi sinh vật có lợi, đồng thời giúp cho vật nuôi sớm trở lại trạng thái ban đầu thì việc bổ sung chế phẩm vi sinh vật có lợi cho đường ruột là một vấn đề rất thiết thực cần được quan tâm. 2.4. Giới thiệu chung về probiotic 2.4.1. Định nghĩa Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô tả những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được bắt nguồn từ nguồn gốc Hy Lạp với nghĩa “ tiền sự sống” (prolife) Năm 1989, Fuller định nghĩa probiotic như là thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó. Năm 1992, Havenar và cộng sự chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông mở rộng định nghĩa probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hoặc hỗn hợp các vi sinh vật sống mà chúng có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ. 2.4.2.Chức năng sinh học của probiotic  Trung hoà độc tố, khử độc và phân huỷ một số thuốc có độc tính cao.  Kích thích hệ thống miễn dịch.  Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột  Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme  Tổng hợp vitamine nhóm B và K ở manh tràng. 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis  Trong y học và chăn nuôi Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên (là các bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy. 14 Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang. Năm 1962,Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả. 1958 - 1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột. Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người. Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis. 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyên Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên nuôi cấy trên môi trường đậu tương, cua đồng…hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống từ 0,5 - 1g/kg thể trọng. Kết quả heo sau khi sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis tăng trọng nhanh. 1982 Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm coli_subtly (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt. Nghiên cứu của Baker, Braude và Kon (1925), Hauser (1957) khi bổ sung kháng sinh liều lượng thấp vào thức ăn thú nhận thấy: acid folic, acid patothenic, vitamin A, vitamin B12 tích tụ trong gan cao. Ngoài ra Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic…  Trong nông nghiệp Chế phẩm Bacillus subtilis được dùng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoetonia solani, Fusarium sp, Pyriculariaoryaze… và trong bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất thuộc bộ công nghiệp nặng Tp.HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ Bacillus subtilis để phòng trừ các loại nấm gây bệnh trên rau cải. 15 Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình Trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để phòng trừ nấm gây bệnh ở bắp Ostrinia furnacalis. 1940 Norio Kimura Yokohamo đã sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergilus flavus, Aspergillus paraciticus. Roman và các cộng sự đã nghiên cứu B. subtilis (ATCC_6633, ATCC_9372) làm giảm đi 40 - 50% aflatoxin trong dịch chứa aflatoxin trong vòng 20 ngày. 16 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh – Khoa Chăn nuôi Thú Y - Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM. Thời gian thực hiện: từ 3/2006 đến 7/2006. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Giống vi khuẩn Giống vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp từ phòng vi sinh khoa Chăn nuôi Thú y trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy  Môi trường giữ giống, đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar).  Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: TSB (Tripticase Soya Broth), Simmon Citrate, môi trường lên men các loại đường…  Các môi trường đều đươc vô trùng trước khi sử dụng. 3.2.3. Hoá chất  Hoá chất cơ bản: NaOH 1N, HCl 1%, NaCl,…  Hoá chất dùng khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn: dầu soi, xylen,…  Thuốc thử Kowac’s, Methyl-Red, …  Thuốc nhuộm Gram:  Thuốc nhuộm bào tử. 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ  Thiết bị Kính hiển vi, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, cân điện tử, nồi cách thuỷ, microwave…  Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lame, đũa thuỷ tinh, pipette, ống Durham, đầu tip vô trùng… 17 3.3. Nội dung nghiên cứu  Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn, tính chất nuôi cấy trên một số môi trường, thử đặc tính sinh hoá.  So sánh phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa và phương pháp đếm trên kính hiển vi.  Ảnh hưởng của hình thức và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn.  Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1.Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis  Quan sát đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis Vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi trong môi trường thạch nghiêng TSA . Sau 24 giờ đem nhuộm Gram và xem dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần (Xem phương pháp nhuộm Gram ở phần phụ lục).  Quan sát đặc điểm nhóm của Bacillus subtilis Phân phối 15ml môi trường TSA đã được hấp tiệt trùng vào đĩa petri vô trùng rồi để nguội. Hoà vi khuẩn vào nước muối sinh lí đã được hấp tiệt trùng, lấy 10 dịch pha loãng trang lên môi trường để tạo khuẩn lạc đơn của vi khuẩn Bacillus subtilis. Sau đó, gói đĩa petri và ủ ỏ nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Quan sát đặc điểm nuôi cấy của Bacillus subtilis trong môi trƣờng canh Môi trường TSB được phân phối 4 - 5 ml vào ống nghiệm vô trùng, đem hấp tiệt trùng và làm nguội. Cấy giống vi khuẩn vào môi trường và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Sau đó quan sát và xem sự thay đổi của môi trường nuôi cấy. 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn  Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi sinh vật trong cùng một loại môi trường nhưng khác nhau về thời gian và chế độ nuôi cấy (Nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc) thì cho lượng sinh khối khác nhau.  Mục đích Xác định số lượng vi khuẩn ở thời gian và chế độ nuôi cấy nào là phù hợp. 18 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 Thời gian Môi trường Nuôi cấy tĩnh Nuôi cấy lắc 24h 36h 48h  Cách làm Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 - 5 ml môi trường TSB đã được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút), đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, cấy vi khuẩn từ ống nghiệm vào bình tam giác chứa 50ml môi trường TSB với tỉ lệ 2%, nuôi cấy trong 2 chế độ khác nhau: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (lắc 15 phút, nghỉ 45 phút) ở điều kiện 37oC. Kiểm tra số lượng vi khuẩn sau thời gian 24, 36, 48 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tôi chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtiis thích hợp để tiếp tục khảo sát thi nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Khảo sát môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối  Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi khuẩn trong các loại môi trường khác nhau ở điều kiện nuôi cấy giống nhau (pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy) thì số lượng vi khuẩn sẽ khác nhau.  Mục đích Xác định môi trường nuôi cấy nào là thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. 19 Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào 4 loại môi trường khác nhau: TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men (với tỉ lệ 2%). Sau đó đem nuôi cấy ở chế độ đã được chọn ra từ thí nghiệm 1, đếm số lượng vi khuẩn sau 24, 36, 48 giờ nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tôi chọn được loại môi trường nuôi cấy thích hợp để tiếp tục khảo sát thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 Thời gian (giờ) Môi trường TSB TSB+1%Glucose TSB + 1%Cao nấm men TSB + 1%Glucose + 1%Cao nấm men 24 36 48 3.4.2.3. Khảo sát pH, môi trƣờng thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis  Nguyên tắc Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một độ pH khác nhau, vì vậy khi nuôi cấy vi khuẩn trong cùng một loại môi trường nhưng ở các độ pH khác nhau thì số lượng vi khuẩn phát triển sau cùng một khoảng thời gian là khác nhau. Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phòng 37oC Nhiệt độ phòng 37oC 24 36 48 20  Mục đích Xác định pH môi trường nuôi cấy thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 -5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào môi trường được chọn từ thí nghiệm 2 ở các pH khác nhau với tỉ lệ 2% và nuôi cấy ở chế độ nuôi cấy (1). Sau 48 giờ đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ thí nghiệm chúng tôi chọn ra pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp. 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ông giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn vào môi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp chúng tôi xử lí nhiệt độ. Xử lí ở 50oC và 70oC, đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (xem phần phụ lục) Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) Nhiệt độ 50 o C 70 o C 3 5 7 21 3.4.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 o C trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn vào môi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp chúng tôi xử lí pH. Đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5 Thời gian (giờ) pH 6 9 3 5 7 22 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis Sau khi tiêu bản vi khuẩn được nhuộm Gram và được quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy vi khuẩn Bacillus subtilis là :  Trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn và nhỏ.  Kích thước từ 0,5 - 0,8 µm x 1,5 -3 µm, hai đầu tròn, đôi khi nối thành chuỗi dài, có tạo bào tử không làm phình tế bào. Hình 4.1. Tế bào vi khuẩn B. subtilis dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần : www.answers.com/ topic/bacillus-1 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis Vi khuẩn được cấy trên môi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩn lạc: khuẩn lạc khô, có màu xám nhạt trắng, tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm, bám chặt vào môi trường thạch. Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA 23 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng canh Sau khi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis vào môi trường canh TSB, đem ủ ở 37oC:  Sau 12 giờ thì vi khuẩn làm đục môi trường.  Nuôi cấy đến 24 giờ thì thấy vi khuẩn tạo váng trển bề mặt của môi trường và làm cho môi trường ở phía dưới trong hơn. 4.1.3. Tính chất sinh hoá Bảng 4.1. Các phản ứng sinh hoá khác của Bacillus subtilis Thử nghiệm Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + Ghi chú: (-) là kết quả âm tính (+) là kết quả dương tính Qua bảng cho thấy kết quả khảo sát của chúng tôi phù hợp với tính chất sinh hoá của Bacillus subtilis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976). Ngoài ra chung tôi còn khảo sát thấy được rằng Bacillus subtilis có khả năng sử dụng các chất như: glucose, citrate, hợp chất chứa nitrogen và có khả năng di động. Tuy nhiên, Bacillus subtilis lại không có enzyme tryptophase để phân giải tryptophan tạo Indol. 24 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn Bacillus subtilis  Khả năng phân giải tinh bột Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng tinh bột bằng cách đo đường kính vòng phân giải trên môi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thu được kết quả đường kính vòng phân giải trung bình là 2,9 cm. Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng thạch tinh bột. 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, lắc) và thời gian nuôi cấy thích hợp Chúng tôi tiến hành:  Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường TSB ở hai chế độ nuôi cấy khác nhau: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ).  Đếm số lượng vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24giờ, 36giờ, 48 giờ bằng phương pháp đỗ đĩa (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. 25 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) Chế độ nuôi cấy Nuôi cấy lắc Nuôi cấy tĩnh 12 10,15 8,79 18 11,07 9,92 24 11,16 9,95 X 10,79 9,55 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) 0 2 4 6 8 10 12 12 18 24 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) Nuôi cấy lắc Nuôi cấy tĩnh Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng của chế độ và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn B. subtilis Qua kết quả ở bảng 4.1 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ nuôi cấy lắc là 10,79 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,17.1010) cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuôi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (số thực tế là 35,48.108). Kết quả xử lí thống kê cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuôi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P<0,05). Điều này có nghĩa là khi nuôi cấy lắc thì lượng oxy và chất dinh dưỡng sẽ phân bố đồng đều hơn trong môi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi 26 nuôi cấy tĩnh (vì Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nên khi cung cấp nhiều oxy hơn thì chúng sinh sản và phát triển mạnh hơn). Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuôi cấy (12 giờ, 18 giờ và 24 giờ) (với P<0,05). Qua bảng kết quả, khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuôi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ở các mức thời gian 12 giờ, 18 giờ (10,15; 11,07). Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chế độ nuôi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩn trong các loại môi trường nuôi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2. Khảo sát môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp Từ kết quả của thí nghiệm 1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy để xác định số lượng vi khuẩn trên 4 loại môi trường:  TSB.  TSB + 1% glucose.  TSB + 1% cao nấm men.  TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Ở điều kiện 37oC, nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) với tỉ lệ giống 2%. Đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa vào các thời điểm: 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2. Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) Môi trường TSB TSB + 1% glucose TSB+ 1% cao nấm men TSB+1% glucose+ 1% cao nấm men X 24 11,08 11,25 11,32 11,28 11,23 36 11,19 11,36 11,40 11,37 11,33 48 11,30 11,44 11,49 11,46 11,43 X 11,19 11,35 11,4 11,37 (Số lượng vi khuẩn /ml tính theo logarit) 27 0 2 4 6 8 10 12 14 24 36 48 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (Tính theo logarit) TSB TSB+1%glucose TSB+1%cao nấm men TSB+1%glucose+1%cao nấm men Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian và môi trƣờng nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.2 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn của môi trường TSB + 1% cao nấm men là 11,4 (giá trị logarit) (số thực tế là 25,19.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn của các môi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Và số lượng vi khuẩn trung bình ở thời gian nuôi cấy 48 giờ là 11,43 (giá trị logarit) (số thực tế 26,6.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn khi nuôi cấy ở các mức thời gian khác. Kết quả xử lí thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa 3 loại môi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Nhưng có sự khác biệt giữa môi trường TSB với 3 loại môi trường trên. Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) với (P<0,05). Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường TSB + 1% cao nấm men và thời gian nuôi cấy 48 giờ để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khảo sát pH, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy vi khuẩn thích Từ kết quả của các thí nghiệm 1 và 2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSB + 1% cao nấm men ở 2 mức pH (7 và 7,5) trong điều kiện 37oC, nuôi cấy lắc (15 phút lắc,45 phút nghỉ) với tỉ lệ cấy giống 2% (thí nghiệm lặp lại 2 lần). 28 Đếm số lượng vi khuẩn sau thời gian nuôi cấy bằng phương pháp đỗ đĩa. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.3 . Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đ