Luận văn Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh

rằng 4 loài Methylobacteria là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA. Trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào. PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen. Trong nghiên cứu khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA. Ba chủng tạo IAA đã tích lũy phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24], [26], [71]. Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường. Con đường đầu tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation) của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT), được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Con đường thứ hai của quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như 20 cơ chế hoạt động ở thực vật bậc cao. Sự tạo cytokinins bởi vi khuẩn PPFMs đã được Koenig và ctv (2001), kiểm tra. Tất cả các chủng kiểm tra điều tạo được cytokinins ở mức độ đủ đáp ứng và phát hiện được. Lượng cytokinins quan sát được là 15,2 và 19,6ng/mg. Bốn chủng Methylobacterium khác nhau hiện diện trên bề mặt lá và một chủng của Methylobacterium extorquens đều có khả năng tạo cytokinin trans-zeatin với mức độ thấp và tiết vào trong môi trường nuôi cấy [32], [33], [35], [39], [40], [57], [58]. Trong những nghiên cứu về những hợp chất để tạo nên hương dâu tây (Fragaria ananassa) cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium cần thiết cho quá trình tổng hợp tiền chất của 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và 2,5-dimethyl-4- methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran). Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với vi khuẩn PPFM thì hàm lượng DMHF là 5g/860,5g mô tươi và 11g/357,97g ở mesifuran, không gram ở mẫu đối chứng. Sự gia tăng hàm lượng của DMHF và mesifuran là do vi khuẩn PPFM có khả năng oxy hóa 1,2-propanediol thành lactaldehyde. Vì lactaldehyde được tạo ra từ vi khuẩn được sử dụng bởi những tế bào dâu tây trong quá trình sinh tổng hợp hai furanones trên [100]. 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium Ngoài khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng tăng trưởng của thực vật Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB (Poly- -Hydroxybutyrate). Khả năng này hiện diện ở nhiều vi sinh vật prokaryote bao gồm cả vi khuẩn Methylotrophic có khả năng tích lũy PHB nội bào như một dạng của nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Hàm lượng PHB tạo ra phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và con đường biến dưỡng của vi sinh vật. Vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình serine để khử formaldehyde có thể tích lũy PHB khoảng 80% trọng lượng khô. Trong khi đó, vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình Calvin-Benson- Bassham để khử C1 có thể tích lũy PHB khoảng 20% trọng lượng khô. Và ở vi khuẩn sử dụng methanol bắt buộc sử dụng chu trình ribulose monophosphate để khử hợp chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện. Trong một nghiên cứu khác của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng. Trong nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện 21 giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65]. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng vi khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất 25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2. Trong khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine 4-Nitro-2,4- Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – hexahydro-1,3,5- trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine trong điều kiện hiếu khí. Methylotrophic đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89]. Hình 2.4: Sự nhiễm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên cây dương Poplar (P. deltoides _ nigra DN34) trong nuôi cấy mô [88]. Trong lĩnh vực thực phẩm vi khuẩn Methylobacterium cũng có thể góp phần quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn 22 nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo ra các sản phẩm có gia trị như protein đơn bào, - carotene, vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [27], [90]. Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng vi khuẩn PPFM có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm, Tuy nhiên, không phải tất cả các loài Methylobacterium đều có lợi mà một loài Methylobacterium sp. mới phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người như Methylobacterium mesophilicum sống ở thực vật có khả năng gây dị ứng, sốt. Methylobacterium podarium tồn tại trong miệng có thể gây bệnh hôi miệng và cũng có thể gây bệnh hoa chân (foot flora) [11], [12], [83], [101]. 2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 2.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống. Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, đặc diểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng, và đặc điểm sinh thái. Phương pháp này được Ferdinad Cohn thực hiện lần đầu tiên năm 1987. Mặc dù đây là phương pháp không chính xác nhưng phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh vật. - Đặc điểm hình thái bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động, … - Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ thích hợp,… Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các khóa phân loại (bảng sinh hoá). Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97]. 23 Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium [41] Chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Methylamine + + + + + + + – – + – + + + - Trimethylanine – – – + – – – – – + – – – – + Acetate + + + + + + + + – + + + + + + Citrate – – – – – – + + + – + + + + + + + + – + + Glutamate – – + + – – + + + + + + + + + + + + – + + Glucose + – – – – – + + + – + + – – – + + – – – + Arabinose – – – – – – + + + – + + – – – – – – – + + Fructose + + – + + + + – – + – + – + + + + – + – + Betaine + – + – + – + + – + – nd + + + Tartrate v – – V – – – v Serbacate – – – – – + v + + Ethanol + + + + + V + v + nutrient agar v + + + + + – + + Methane – v – – – – – – chú thích: 1: M.suomiense; 2: M. lusitanum; 3: M. extorquens; 4: M. organophilum; 5: M. rhodesianum; 6: M. zatmanii; 7: M. rhodinum; 8: M. radiotolerans; 9: M. mesophilicum; 10: M. aminovorans; 11: M. fujisawaense; 12:M. thiosyanatum; 13: M. chloromethanicum; 14: M. dichloromethanicum;15: M. hispanium; 16: M. aquaticum; 17: M. variable; 18: M. isbiliense; 19: M. populi;20: M. nodulans. 21 :1019. +:có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định ; v: biến đổi. 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa vào vật liệu di truyền) 2.4.2.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật sinh học phân tử. Kỹ thuật sinh học phân tử là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm gồm nhiều kỹ thuật mà có chung đặc điểm là sử dụng các vật liệu nghiên cứu có tính chất phân tử (vật liệu di truyền như: DNA, RNA, protein,.... Là phương pháp hiện đại, đạt kết quả nhanh chóng, và hiệu quả cao. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại. + Sử dụng mẫu dò (probes) Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Mẫu dò là 24 một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang. + Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [4], [67], [95]. Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA. Nguyên tắc của phương pháp PCR Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4 mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng. + Giải trình tự (sequencing) [5]. Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid nucleic chuyên biệt nào đó. Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert (1977), Sanger và ctv (1977), công bố. Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng: - Phương pháp Maxam và Gilbert Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau. - Phương pháp Sanger Là phương pháp dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính chất bổ sung từ một dây nền của DNA - Phương pháp giải mã bằng hệ thống tự động (phương pháp PCR trực tiếp) Nguyên tắc dựa vào việc phát hiện tính hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu. 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật. Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, được cấu tạo từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S, 23S). Chúng đảm nhận chức năng 25 duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được xem là thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà còn dựa vào rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA), vì DNA là vật liệu di truyền dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Trong các loại rRNA thì rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước nó vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), một vài vùng trong rRNA 16S của tất cả các prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi đó một số vùng khác lại có một số khác biệt. Sau khi giải mã thì trình tự của đoạn rRNA đã biết được so sánh với các trình tự rRNA của tất cả các sinh vật trên ngân hàng gen nhờ phần mềm BLAST, hay sử dụng kết hợp các phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự. Từ những cơ sở dữ liệu này, ta có thể vẽ được cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa của các loài và vi trí của loài vi sinh vật cần định danh. Tuy nhiên, khi sử dụng trình tự rDNA 16S để định danh cần chú ý: - Kích thước rDNA phải đủ lớn (> 1300nu) - Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của hai chủng vi sinh vật nhỏ hơn 0,5%. Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại kết quả chính xác. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó. Ngoài ra, trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA 16S (mã hóa cho 16S rRNA). Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh vật mục tiêu [29], [30], [31], [68]. 26 Phần III: Vật liệu và phƣơng pháp 3.1. Vật liệu 3.1.1. Mẫu thí nghiệm  Mẫu lá, đất, nước được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở Tây Ninh  Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 06/ 02/ 2006 đến ngày 18/ 06/ 2006.  Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ  Máy hấp vô trùng autolave  Máy lắc tròn 100 vòng/phút  Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zentrifugen)  Máy điều nhiệt theo chu kỳ Techine  Bộ điện di ngang Mupid-EX (Advance)  Máy đo quang phổ RNA/DNA Gene Quantpro  Kính hiển vi (Olympus)  Eppendorf, Pippette,… Và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Vi Sinh. 3.1.3. Hóa chất 3.1.3.1. Môi trƣờng phân lập và làm thuần vi khuẩn Methylobacterium sp.[34]. Thành phần môi trường Methanol Mineral Salts (MMS): - K2HPO4 1,2g - KH2PO4 0,62g - CaCl2.6H2O 0,05g - MgSO4.7H2O 0,2g - NaCl 0,1g - FeCl3.6H2O 1mg - (NH4)2SO4 0,5 g - CuSO4.5H2O 5 g - MnSO4.5H2O 10 g - Na2MoO4.2H2O 10 g 27 - H3BO3 10 g - ZnSO4.7H2O 70 g - CoCl2.6H2O 5 g - Nước cất vừa đủ 1000ml - pH 7 Môi trường MMS được thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 20 phút. Sau đó, để nguội và bổ sung methanol vào với nồng độ 0,1 – 0,2%. Đối với môi trường rắn thì bổ sung agar 20g/l trước khi hấp vô trùng. Không cần bổ sung vitamine hay các nhân tố tăng trưởng bởi vì các chủng PPFM hầu như không cần thiết trong quá trình tăng sinh. 3.1.3.2. Môi trƣờng giữ giống vi khuẩn Methylobacterium sp. Thành phần môi trường Glycerol-Peptone Agar:[34]. - Agar 15g - Glycerol 10g - Peptone 10g - Nước vất vừa đủ 1000ml 3.1.3.3. Môi trƣờng khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn Methylobacterium sp. [4], [6], [34] Môi trường khảo sát là môi trường MMS. Trong đó, methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp cung cấp nguồn cacbon. 3.1.3.4. Môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn [4], [6]. Môi trường khoáng MS bổ sung 30g/l sucrose, 1mg/l glycine, 1mg/l B1, 100mg/l meso inositol, 2g/l cao thịt, 2g/l casein hydrolyase ký hiệu: CMS. Môi trường cao thịt – peptone (CP) gồm 0,3% cao thịt, 1% peptone, 0,5% NaCl, pH = 6,5. 3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS14GR. 28 3.2. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm Lấy mẫu Tăng sinh vi khuẩn Phân lập Làm thuần Xác định hình thái Kiểm tra sinh lý, sinh hóa Chiết tách DNA Thực hiện PCR Giải trình tự Xử lý kết quả Kết luận 3.2.1. Lấy mẫu Mẫu được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở ba xã khác nhau:xã Truông Mít (huyện Dương Minh Châu), xã Gia Lộc (huyện Trảng Bàng), xã Bàu Đồn (huyện Gò Dầu) tỉnh Tây Ninh bao gồm các mẫu lá, nước, đất. Giờ lấy mẫu : sáng từ 7 – 9 giờ. 3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn Đối với mẫu lá, dùng hai phương pháp là: Leaf print trực tiếp trên đĩa môi trường, hoặc qua quá trình tăng sinh trên môi trường chọn lọc. 29 Sau khoảng 2 – 3 ngày lấy mẫu dùng pippet hút 100 l môi trường tăng sinh cho vào môi trường rắn để tiến hành phân lập vi khuẩn 3.2.3. Phân lập vi khuẩn - Đối với mẫu đất chúng tôi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 10–1, 10 –2,… 10– 6. Sau đó từ mỗi nồng độ hút 100 l cho vào môi trường rắn. - Đối với mẫu nước chúng tôi tiến hành phân lập trực tiếp không qua quá trình tăng sinh, hút cho vào môi trường rắn mỗi đĩa là 40 l - Đối với mẫu lá sau khi tăng sinh dùng pipet vô trùng hút 100 l cấy vào môi trường rắn - Sau khi cấy chuyển vào môi trường rắn đem tất cả các đĩa môi trường đã cấy vi khuẩn nuôi ở nhiệt độ 300C. Sau 2 – 4 ngày xem kết quả và chọn khuẩn lạc hồng đặt trưng để làm thuần. 3.2.4. Làm thuần. Khuẩn lạc thuần đóng vai trò quan trọng quyết định đến kết quả và độ chính xác trong thử nghiệm sinh hóa cũng như các thử nghiệm khác. Do đó, để có khuẩn lạc thuần phục vụ cho tiến trình thử nghiệm sinh hóa chúng tôi tiến chọn lọc khuẩn lạc có màu hồng đặc trưng trên môi trường phân lập cấy ria trên đĩa môi trường mới nhiều lần (3 – 4 lần), để tạo chủng thuần. 3.2.5. Giữ giống. Để có chủng vi khuẩn tiến hành các nghiên cứu có liên quan nên chúng tôi dùng vi khuẩn thuần cấy sang môi trường giữ giống GPA và bảo quản giống trong glycerol 50% trong điều kiện đông lạnh. 3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa Được tiến hành với các thử nghiệm chủ yếu sau: 3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào [4], [6], [7] Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật. Để xác định Gram các chủng đã phân lập và làm thuần chúng tôi tiến hành theo hai phương pháp: + Phương pháp String test - Thử nghiệm String [15] 30 Phương pháp này dựa vào khả năng tạo nhầy giữa sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng vách tế bào vi khuẩn Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy khi phản ứng với KOH. String dương (dương tính) khi giữa que cấy và dung dịch có sợi nhầy mảnh, tức là vi khuẩn Gram âm, ngược lại khi String âm thì vi khuẩn là Gram dương. + Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc: Phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của thành tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram dương gồm các thành phần peptidoglycan nhiều hơn ở thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram âm, ngược lại thành phần lipid của chúng lại thấp hơn. Iod được thêm vào như một chất cắn màu để tạo thành hợp chất crystal violet-iodine bền với cồn. Giai đoạn này là giai đoạn cố định màu. Ở giai đoạn rửa cồn, lớp chất béo ở vi khuẩn gram âm bị cồn hòa tan dẫn đến chất nhuộm ban đầu bị hòa tan vào dung môi. Ngược lại, ở vi khuẩn gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp dày và hợp chất violet-iodine không bị phai ra môi trường xung quanh. Do đó, vi khuẩn gram dương vẫn giữ được màu nhuộm ban đầu. Vi khuẩn gram âm sau khi nhuộm có màu hồng đỏ còn vi khuẩn gram dương có màu tím. Tiến hành: - Cho sinh khối vi khuẩn lên lam kính sạch để khô tự nhiên. - Hơ mặt dưới của lam trên ngọn lửa 2 – 3 lần (tránh để tiêu bản quá nóng). - Phủ dung dịch Crystal violet lên lam kính trong một phút. - Đổ bỏ dịch Crystal violet và rửa bằng nước cất. - Phủ dung dịch lugol để một phút sau đó đổ bỏ lugol và rửa nhẹ bằng nước. - Tẩy màu bằng cồn trong khoảng 10 – 15 giây. - Rửa lại bằng nước. - Phủ dịch fuschin lên lam kính trong khoảng 30 giây. Đổ bỏ fuschin và rửa bằng nước. - Dùng giấy thấm để thấm hay để khô tự nhiên. - Xem kết quả dưới kính hiển vi độ phóng đại của vật kính 100X với một giọt dầu 31  Các chủng vi khuẩn trong thí nghịêm được thử nghiệm sau 2, 4, 6, 8 ngày nuôi cấy trên môi trường CMS. + Đo kích thước tế bào Sau khi nhuộm gram, quan sát dưới khính hiển vi độ phóng đại vật kính 100X và đo kích thước tế bào. 3.2.6.2. Mối quan hệ với oxi Được tiến hành qua thử nghiệm catalase và hoạt tính oxidase trong bộ thử nghiệm IDS14GR. + Thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi khuẩn. Phương pháp thử: - Thử trên lam: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vi sinh vật trên lam. - Thử trong ống nghiệm: Nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên dòng thuần vi sinh vật cấy dày đặt trên mặt thạch nghiêng. Kết quả: Thử nghiệm dương tính khi có bóng khí xuất hiện, âm tính khi không có bóng khí. + Thử nghiệm oxidase: Nguyên tắc: nhằm xác định hoạt tính cytochrome oxidase trong các loài sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Phương pháp: dàn điều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD) quan sát sự xuất hiện màu xanh dương trong khoảng một phút. 3.2.6.3. Khảo sát khả năng di động Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận khi thử nghiệm cấy vi khuẩn trong thạch mềm. Nếu vi khuẩn chỉ phát triển xung quanh đường cấy thì vi khuẩn không di động nếu vi khuẩn mọc lan rộng khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Môi trường thử nghiệm là môi trường thạch mềm LDC (trong IDS14GR) 3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn. Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng các nguồn cacbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do đó, khi sử 32 dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự thay đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Ở pH trung tính thì màu môi trường là xanh lá cây, acid là màu vàng và màu xanh dương khi pH kiềm. Phản ứng dương khi màu môi trường thay đổi so với màu môi trường đối chứng âm (màu xanh lá cây, không cấy vi khuẩn). Mục đích: Nhằm sàng lọc và xác định các nhóm khuẩn lạc đã phân lập theo các đặc tính sinh hóa, tạo tiền đề thuận lợi cho các thử nghiệm định danh sau này nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của các khuẩn lạc thuần phân lập được. Vật liệu: Các khuẩn lạc thuần đã phân lập. Tiến hành: Pha môi trường MMS hấp vô trùng, sau đó bổ sung 1% chất cung cấp nguồn cacbon và chất chỉ thị pH 2ml/l vào môi trường điều chỉnh pH môi trường ở 7 2 bằng KOH 1N và HCl 1N. Sau đó cho môi trường vào các lổ của microplate 1ml/lỗ, cấy vi khuẩn vào các lỗ ngoài trừ lỗ đối chứng. Các chất cung cấp nguồn cacbon đã thử nghiệm: L-arabinose, fructose, ethanol, L- glutamate, acetate, methylamine, trimethylamine, serbacate, D-glocose, sucrose, manitol, maltose, betaine, citrate, lactose và môi trường nutrient agar tổng hợp (Merk). 3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR. Để có thể định danh chính xác hơn các dòng vi khuẩn đã phân lập và thử nghiệm ở trên, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác bằng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm IDS 14GNR của công ty Nam Khoa. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR bao gồm: + Khả năng lên men glucose (MR) Nhằm kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid và vượt qua khả năng ổn định pH của môi trường. Đây là phép thử định tính về khả năng sinh acid (xác định pH) do một số vi sinh vật sinh acid nhiều hơn các vi sinh vật khác. + Khả năng khử nitrate Xác định sự hiện diện của enzyme nitratreductase ở vi sinh vật, và chúng có khả năng sử dụng nitrate làm nguồn thức ăn nitơ. Ngoài ra, một số vi sinh vật có khả 33 năng sử dụng nitrate làm chất nhận electron hay H+ trong hô hấp kị khí để oxy hóa các hợp chất hữu cơ NO3 - + 2e - + 2H +  NO2 - + H2O. + Khả năng sinh tổng hợp galactosidase (thử nghiệm ONPG, o-nitrophenyl-β -D- galactopyranoside) Nhằm xác định sự có mặt của enzyme β-galactosidase có ở vi sinh vật nhờ sự hiện diện của cơ chất ONPG. Khi vi khuẩn có enzyme này thì nó sẽ phân cắt ONPG làm giải phóng nitrophenyl làm môi trường xuất hiện màu vàng. Mục đích: Phân biệt vi khuẩn có khả năng sử dụng lactose. + Khả năng tạo urease Xác định khả năng của vi sinh vật phân giải urea tạo ra hai phân tử ammonia do tác dụng của enzyme urease làm kiềm hóa môi trường + Khả năng tạo phenylalanine deaminase (PAD) Nhằm xác định sự hiện diện của enzyme PDA ở vi khuẩn và khử nhóm amine của phenylalanine. + Khả năng sử dụng citrate