Luận văn Khảo sát hoạt tính và tinh sạch Protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae và Aspergillus Kawasaki trên môi trường bán rắn

các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch… + Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trƣng. + Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị tiêu hóa kém…  Trong nông nghiệp : Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.  Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý. 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 2.3.1.1 Phân loại Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Ngành phụ : Pezizomycota Lớp : Ascomycetes Bộ : Plectascales Họ : Aspergillaceae Giống : Aspergillus Loài : Aspergillus oryzae 2.3.1.2 Đặc điểm  Hình thái Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty. 16 Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CBS – MEA2%.  Điều kiện phát triển : Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành bào tử : 45%. Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%. Độ ẩm không khí : 85 -95%. pH môi trƣờng : 5,5 - 6,5. Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 300C. 2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt. Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng nhƣ các enzyme khác có thể dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy : phƣơng pháp bề mặt và phƣơng pháp bề sâu. Phƣơng pháp bề mặt thƣờng dùng để nuôi cấy nấm mốc, phƣơng pháp bề sâu thƣờng dùng đối với vi khuẩn. Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lƣợng 17 enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thƣờng là những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật nhƣ cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease, ngƣời ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành nhƣ những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng bán rắn khi nuôi bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:  Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: + Nhiệt độ tăng rất chậm. + Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi. + Khối môi trƣờng còn rời rạc. + Enzym mới bắt đầu đƣợc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối không đƣợc đƣa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.  Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: + Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trƣờng, trong lòng môi trƣờng. + Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt. + Độ ẩm môi trƣờng giảm dần. + Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC. + Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. + Các loại enzym đƣợc hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn. + Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29- 30 oC là tốt nhất. 18  Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản nhƣ sau: + Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dƣỡng sẽ chậm lại. + Nhiệt độ của khối môi trƣờng giảm, do đó làm giảm lƣợng không khí môi trƣờng xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử đƣợc hình thành nhiều do đó lƣợng enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng). Ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh. 2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease Quá trình tinh sạch enzyme đƣợc tóm tắt nhƣ sau : Chế phẩm enzyme thô Trích ly Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Tinh chế kết tủa bằng sắc ký lọc gel Kiểm tra độ tinh sạch, xác định trọng lƣợng phân tử 19 2.5.1 Trích ly enzyme Toàn bộ khối lƣợng chế phẩm enzyme thô đã sấy đƣợc đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội bào chƣa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nƣớc nên sau khi nghiền mịn, ngƣời ta dùng nƣớc, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nƣớc trong mục đích này cho kết quả tốt và dễ đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc có thể chiết đƣợc lƣợng enzyme trên 90 – 95% và trong nƣớc chiết không chứa các tạp chất không tan. Nƣớc thƣờng dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. (Lƣơng Đức Phẩm, 1998) Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly :  Tỷ lệ nƣớc trích Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nƣớc để trích ly enzyme hơn chế phẩm ẩm, tỷ lệ nƣớc trên chế phẩm khác nhau sẽ trích đƣợc lƣợng enzyme khác nhau. Lƣợng nƣớc dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lƣợng chế phẩm nấm mốc.  Thời gian trích Enzyme thủy phân dễ tan trong nƣớc, thời gian trích ly càng lâu càng có khả năng trích đƣợc nhiều enzyme hơn nhƣng làm tăng lƣợng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.  Nhiệt độ trích Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhƣng làm giảm hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 300C. Để tăng cƣờng khả năng thu enzyme, chế phẩm đƣợc đánh tơi trƣớc khi trích để đạt đƣợc kích thƣớc hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thƣờng dùng hệ thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ Sản phẩm enzyme tinh khiết 20 trích đƣợc nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và hàm lƣợng enzyme trong dịch chiết thu đƣợc. 2.5.2 Quá trình tủa Dịch thu nhận đƣợc vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa nƣớc, các chất hòa tan khác từ khối môi trƣờng nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô thƣờng chứa một lƣợng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này. Để làm đƣợc điều đó ngƣời ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa. Tủa là phƣơng pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bƣớc ban đầu trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này ngƣời ta loại đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.  Nguyên tắc : Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi. Ở phân tử enzyme, các gốc ƣa nƣớc và kỵ nƣớc thƣờng nằm trên bề mặt. Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau. Trong đó, các nhóm kỵ nƣớc có xu hƣớng nằm trong lòng phân tử protein, một phần không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi, các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lƣỡng cực khác có vai trò quyết định đến tính chất enzyme. Độ hòa tan của enzyme đƣợc coi là kết quả của tƣơng tác lƣỡng cực của chất hòa tan với nƣớc và tƣơng tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành màng nƣớc bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tƣơng tác này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thƣờng gọi là tủa protein. Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền nhƣ trƣớc thì đƣợc gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.  Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein a) Kết tủa bằng muối 21 Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hƣớng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Khi cho một lƣợng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính. Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp. Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó cũng đƣợc sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân tử protein lớn có khuynh hƣớng kết tủa trƣớc, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối khác nhau. Nhƣ vậy với quá trình này ta có thể thu đƣợc protein mong muốn một cách tinh sạch hơn. b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tƣơng tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó độ hòa tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trƣờng. Điều này có đƣợc bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nƣớc (nhƣ acetone) vào dung dịch chứa protein. Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960 có nhiều thuận lợi do tƣơng đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phƣơng pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. Có thể xảy ra hiện tƣợng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nƣớc lại tiếp xúc 22 với dung môi. Hiện tƣợng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lƣu ý đến nhiệt độ, ta bắt buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thƣờng mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Ngƣời ta thƣờng tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 10 0C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme đƣợc xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme. 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký Sắc ký sinh học là phƣơng pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng. Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein Đặc tính Kỹ thuật Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography) o Sắc ký giấy. o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography) o Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC) Kích thƣớc Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand) Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography) 23 Hình 2.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đƣa vào thị trƣờng sản phẩm thƣơng mại Sephadex TM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.  Nguyên tắc : Lọc gel là phƣơng pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật này dùng để tách những phân tử có kích thƣớc, trọng lƣợng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thƣớc đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và đƣợc giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách : a) Phân tách nhóm (Group separations) Các thành phần của một mẫu đƣợc phân tách thành hai nhóm chính theo phạm vi kích thƣớc. Sự phân tách nhóm đƣợc sử dụng để loại các phân tử lớn hay các phân tử tạp chất nhỏ (nhƣ đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao đổi đệm. b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution fractionation of biomolecules) Các thành phần của cùng một mẫu đƣợc phân tách theo sự khác biệt về kích thƣớc phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể đƣợc dùng để cô lập một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lƣợng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lƣợng phân tử. 24  Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel a) Ƣu điểm Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt. Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối. b) Nhƣợc điểm - Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài) - Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu. - Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.  Một số thông số vật lý của phƣơng pháp Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lƣợng phân tử (MW) nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lƣợt ra khỏi cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000 Da đều không chui vào hạt gel. Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ đƣợc phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50. Độ ngậm nƣớc (Water Regain-WR) : Là trọng lƣợng nƣớc mà 1g bột gel khô hút nƣớc. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột. Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trƣơng nở trong nƣớc. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô. Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt theo m. Hạt có kích thƣớc lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho 25 tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100-200 mesh, 50-150 m. Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da. Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.  Phân tách bằng sắc ký lọc gel Để phân tách, môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi trƣờng này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này đƣợc chọn vì tính ổn định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản ứng). Nền nhồi đƣợc cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi đƣợc xem nhƣ phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các hạt, đƣợc xem nhƣ phase động. Cần lƣu ý rằng, mẫu đƣợc giải hấp một cách đồng nhất (isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân tách. Tuy nhiên, bƣớc rửa giải dùng loại đệm đang chạy thƣờng bao gồm ở thời điểm kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lƣu trong cột đƣợc dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.  Quá trình lọc gel 1. Các hạt hình cầu của môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột. 2. Mẫu đƣợc nạp vào cột. 3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng đƣợc miêu tả nhƣ quá trình phân đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu trong chất nền hơn và do đó lƣu lại trong cột lâu hơn. 4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống dƣới đáy cột. 26 5. Các phân tử lớn rời cột trƣớc nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình tự kích thƣớc của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lƣợng dung môi bằng tổng thể tích cột (tƣơng đƣơng với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi trƣờng lọc gel. Hình 2.7 : Quá trình lọc gel 27 2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE Sau khi qua các bƣớc ly trích và tinh sạch, ngƣời ta thƣờng kiểm tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng lƣợng phân tử và độ tinh sạch của chúng. Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điện trƣờng. Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS. Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine (TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trƣờng và kích thƣớc của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng nhƣ giới hạn trọng lƣợng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide : nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc lớn và ngƣợc lại. SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng và các phân tử tích điện dƣơng sẽ di chuyển về cực âm của điện trƣờng. Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết. 28 Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp:  Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng.  Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới) : tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này đƣợc phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 daltons thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%. 29 PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 10/2/2006 đến tháng 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM. 3.2 Vật Liệu 3.2.1 Chế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme protease dạng bột thô của hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki do phòng Vi Sinh Ứng Dụng - Viện SHNĐ cung cấp. 3.2.2 Hóa chất Hóa chất để pha dung dịch đệm phosphate : Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4 Hóa chất để tủa enzyme : Cồn 960, (NH4)2SO4 Hóa chất để xác định hàm lƣợng protein : Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml, thuốc thử Bradford (Coomasie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid Phosphoric) Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme : dung dịch Tyrosine 1mg/ml; HCl 0,1M; Na2CO3 0,4M; dung dịch Trichloacetic acid 0,4M (TCA); thuốc thử Folin; dung dịch đệm phosphate 0,1M; casein dạng bột. Hóa chất dùng trong phƣơng pháp sắc ký. Hóa chất dùng trong phƣơng pháp điện di. 3.2.3 Thiết bị  Máy đo quang phổ UV – Vis  Máy khuấy từ  Thiết bị lọc hút chân không  Máy ly tâm  Máy đo pH  Cân phân tích  Bể ổn nhiệt  Tủ sấy  Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Biorad gồm phễu đổ gel, flow adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch.  Ống nghiệm 30  Bình định mức  Ống đong  Giấy lọc  Phễu lọc  Đũa khuấy  Pipette thủy tinh, pipetman 50 – 300 l, 100 – 1000 l  Các dụng cụ để chạy điện di : Bộ điện di dứng, bộ nguồn chạy điện di, đầu típ, eppendorf, phao để eppendorf. 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1.1. Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô. Cân 100g chế phẩm enzyme thô của mỗi chủng, hòa tan trong 750 ml nƣớc cất. Khuấy đều hỗn hợp trong thời gian 1 tiếng bằng máy khuấy từ. Lọc hỗn hợp qua vải thô. Dịch lọc thu đƣợc tiếp tục lọc bằng thiết bị lọc hút chân không. Dịch sau lọc đƣợc đem đi ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ cặn và thu lấy dịch . Định mức đến 650 ml. Bảo quản ở 100C. Dịch chiết enzyme thô đƣợc xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano. a) Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford Bradford là một trong những phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng protein. Phƣơng pháp này có một số ƣu điểm sau :  Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử).  Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20 g)  Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định.  Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein. 31  Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch mang tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 465 nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với cả nhóm kỵ nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau hai phút và ổn định trong gần một giờ.  Hóa chất và thiết bị