Luận văn Khảo sát khả năng ứng dụng của màng BC hấp phụ dịch Nisin trong bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối

u ñoù noù ñöôïc thoaùt ra ngoaøi teá baøo cuøng vôùi moät loaïi enzyme. Enzyme naøy coù theå polymer hoùa thaønh cellulose. A. xylinum coù theå söû duïng nhieàu nguoàn ñöôøng khaùc nhau vaø tuøy thuoäc vaøo nguoàn ñöôøng naøo ñöôïc söû duïng toát nhaát [16]. Baûng 1.2. Ñaëc ñieåm sinh hoùa cuûa A. xylinum . STT Ñaëc ñieåm sinh hoùa của A.xylinum Hieän töôïng Keát quaû 1 Oxy hoùa ethanol thaønh acid acetic Acid acetic taïo ra keát hôïp vôùi CaCO3 laøm voøng saùng roäng hôn vaø taïo lôùp caën, ñuïc roõ + 2 Catalase Suûi boït khí + 4 Chuyeån hoùa glucose thaønh acid Voøng saùng sung quanh khuaån laïc + 5 Chuyeån hoùa glycerol thaønh dihydroxyaceton Voøng CuO xuaát hieän xung quanh khuaån laïc + 6 Kieåm tra sinh saéc toá naâu Khoâng thaáy saéc toá naâu - 7 Kieåm tra toång hôïp cellulose Vaùng vi khuaån xuaát hieän maøu lam + [24]. Cellulose vi khuaån . Giôùi thieäu Celluose laø moät polymer sinh hoïc raát ña daïng treân theá giôùi, laø thaønh phaàn lôùn nhaát trong sinh khoái thöïc vaät. Beân caïnh polymer thöïc vaät coøn coù polymer ngoaïi baøo cuûa vi sinh vaät, chuùng laø saûn phaåm cuûa hoaït ñoäng bieán döôõng sô caáp ñöôïc duøng nhö moät lôùp aùo beân ngoaøi ñeå baûo veä teá baøo chuû, trong khi cellulose thöïc vaät ñoùng vai troø caáu truùc. Cellulose vi khuaån vaø cellulose thöïc vaät coù caáu truùc hoùa hoïc gioáng nhau nhöng tính chaát vaät lyù vaø hoùa hoïc khaùc nhau. . Caáu truùc maøng BC: Cellulose laø moät polymer khoâng phaân nhaùnh cuûa caùc lieân keát b-1,4 glucopyranose. Caùc nghieân cöùu cho thaáy BC coù caáu truùc hoùa hoïc gioáng vôùi caáu truùc cuûa cellulose thöïc vaät. Tuy nhieân, caáu truùc ña phaân töû vaø thuoäc tính cuûa cellulose vi khuaån khaùc vôùi cellulose thöïc vaät. Caùc chuoãi môùi sinh cuûa BC taäp hôïp laïi hình thaønh neân caùc sieâu sôïi coù ñoä roäng khoaûng 1.5nm. Caùc sieâu sôïi naøy laïi hình thaønh neân caùc vi sôïi (Jonas and Farab, 1998), sau ñoù chuùng ñöôïc boù laïi vaø hình thaønh neân caùc ribbon (Yamanaka vaø coäng söï, 2000). Kích thöôùc cuûa caùc ribbon laø 3-4 x 70-80 nm. Caùc BC khaùc nhau thöôøng coù ñoä polymer hoùa khaùc nhau thöôøng naèm trong khoaûng 2000 ñeán 6000, trong moät soá tröôøng hôïp leân ñeán 16000 – 20000. Trong khi ñoù möùc polymer hoùa trung bình cuûa thöïc vaät thöôøng naèm trong khoaûng 13000 – 14000 [15, 16]. Caáu truùc cuûa BC phuï thuoäc chaët cheõ vaøo ñieàu kieän nuoâi caáy. ÔÛ ñieàu kieän nuoâi caáy tónh, vi khuaån toång hôïp nhöõng mieáng cellulose treân beà maët nuoâi caáy tónh, taïi ranh giôùi giöõa beà maët dòch loûng vaø khoâng khí giaøu oxy. Caùc mieáng BC naøy ñöôïc goïi laø BC treân moâi tröôøng tónh (S-BC). Caùc sieâu sôïi cellulose lieân tuïc ñöôïc taïo ra töø nhöõng loã ñöôïc xeáp doïc treân beà maët cuûa teá baøo vi khuaån, keát laïi thaønh caùc vi sôïi, vaø bò ñaåy xuoáng saâu hôn trong moâi tröôøng dinh döôõng. Caùc daûi cellulose töø moâi tröôøng tónh taïo neân caùc maët phaúng song song, sôïi S-BC keùo daøi vaø choàng treân caùc sôïi khaùc theo chieàu ñan cheùo nhau khoâng coù toå chöùc, coù vai troø choáng ñôõ cho quaàn theå teá baøo Acetobacter xylinum. Caùc sôïi BC keá nhau ñöôïc taïo ra töø moâi tröôøng tónh noái vôùi nhau vaø beû nhaùnh ít hôn caùc sôïi BC ñöôïc taïo ra töø moâi tröôøng laéc (A-BC) [16]. Hình 1.2. Maøng BC hình thaønh trong moâi tröôøng nuoâi caáy tónh [14]. Hình 1.3. Caùc vieân BC hình thaønh trong moâi tröôøng khuaáy [14]. Hai daïng keát tinh phoå bieán cuûa cellulose trong töï nhieân laø I vaø II, ñöôïc phaân bieät bôûi caùc kyõ thuaät phaân tích baèng tia X, quang phoå vaø tia hoàng ngoaïi. Cellulose I ñöôïc chuyeån thaønh cellulose II, nhöng cellulose II thì khoâng theå chuyeån thaønh cellulose I. Cellulose I ñöôïc toång hôïp bôûi ña soá thöïc vaät A. xylinum ôû trong moâi tröôøng tónh. Caùc chuoãi b - 1,4 – glucan ôû cellulose I ñöôïc saép xeáp song song vôùi nhau theo moät truïc. Trong khi ñoù, caùc chuoãi b - 1,4 – glucan ôû cellulose II thì xeáp moät caùch ngaãu nhieân, haàu nhö khoâng song song vaø noái vôùi nhau bôûi moät soá löôïng lôùn caàu noái hydrogen, laøm cho cellulose II coù ñoä beàn veà nhieät. Raát ít teá baøo Eukaryota toång hôïp cellulose II. A. xylinum toång hôïp ñöôïc caû hai loaïi cellulose I vaø II. Trong phaân töû cellulose I coù söï xuaát hieän cuûa Ia vaø Ib, do ñöôïc caáu taïo bôûi glucose daïng a hay daïng b. Daïng b beàn veà nhieät ñoäng hôn. Gluose daïng a hay glucose daïng b laø hai daïng ñoàng phaân khoâng gian cuûa nhau. Hai daïng ñoàng phaân naøy chæ khaùc nhau ôû söï ñònh höôùng cuûa nhoùm hydroxyl. Gai daïng naøy coù ôû caùc cellulose coù nguoàn goác töø taûo, vi khuaån, thöïc vaät. BC coù daïng Ia nhieàu hôn cellulose thöïc vaät. S-BC coù nhieàu daïng Ia hôn A-BC. Söï khaùc nhau veà tæ leä Ia giöõa hai loaïi S-BC vaø A-BC laøm phoùng ñaïi caùc chæ soá keát tinh, chæ soá Ia tæ leä thuaän vôùi kích côõ keát tinh. A-BC coù chæ soá keát tinh thaáp hôn vaø kích côõ keát tinh nhoû hôn S-BC. . Tính chaát hoùa lyù cuûa maøng S-BC: Maøng S-BC coù theå taïo hình daïng phuø hôïp vôùi thieát bò phaûn öùng sinh hoïc. Hình daïng, kích thöôùc cuûa saûn phaåm BC raát ña daïng vaø coù theå chuû ñoäng taïo ra kích thöôùc mong muoán. S-BC coù tính chaát cô lyù beàn vaø oån ñònh. Ñoä chòu löïc cuûa BC khaù dai, gaàn baèng vôùi ñoä chòu löïc cuûa nhoâm. Tính chaát cô lyù beàn vaø oån ñònh giuùp BC coù theå chòu ñöôïc söï taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö khuaáy troän hoaëc caùc aùp löïc. BC khoâng tan trong moâi tröôøng phaûn öùng. Giaù theå BC coù ñoä tröông nôû toát. Ñoä tröông nôû giuùp cho söï khueách taùn cuûa cô chaát, saûn phaåm. Moâi tröôøng trong vaø ngoaøi chaát mang khoâng coù söï khaùc bieät. BC ñaõ qua xöû lyù khoâng gaây taùc ñoäng ñeán chaát ñöôïc haáp phuï. Sau giai ñoaïn xöû lyù, BC chæ laø giaù theå trô veà maët hoùa hoïc, coù ñoä tröông nôû toát. Maøng BC coù theå taùi söû duïng nhieàu laàn trong öùng duïng laøm chaát mang, an toaøn cho moâi tröôøng soáng [15]. . Chöùc naêng sinh lyù cuûa cellulose ñoái vôùi Acetobacter xylinum Trong töï nhieân, phaàn lôùn vi khuaån toång hôïp polysaccharide ngoaïi baøo ñöôïc duøng nhö maøng bao voøng quanh teá baøo, maøng BC laø moät ví duï.Nhöõng teá baøo vi khuaån sinh toång hôïp cellulose ñöôïc baãy beân trong maïng löôùi polymer. Maïng löôùi naøy laø vaät choáng ñoõ cho quaàn theå vi sinh vaät luoân ôû beà maët tieáp giaùp giöõa moâi tröôøng loûng vaø khoâng khí. Heä thoáng löôùi polymer laøm cho caùc teá baøo coù theå baùm chaët treân beà maët moâi tröôøng vaø laøm teá baøo thu nhaän chaát dinh döôõng moät caùch deã daøng hôn so vôùi khi teá baøo ôû trong moâi tröôøng loûng khoâng coù maïng löôùi cellulose. Nhôø vaøo tính deûo vaø tính thaám nöôùc cuûa caùc lôùp cellulose maø teá baøo vi khuaån khaùng laïi nhöõng thay ñoåi baát lôïi trong moâi tröôøng soáng nhö giaûm löôïng nöôùc, thay ñoåi pH, xuaát hieän caùc chaát ñoäc vaø caùc vi sinh vaät gaây beänh. Caùc vi khuaån A.xyllinum coù theå taêng tröôûng vaø phaùt trieån beân trong lôùp voû bao. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn nhaän ra raèng cellulose baûo veä teá baøo vi khuaån döôùi taùc ñoäng cuûa tia UV, khoaûng 23% caùc teá baøo vi khuaån sinh acid acetic ñöôïc bao boïc bôûi maøng BC coù khaû naêng soáng soùt sau 1 giôø chieáu xaï tia UV. Vieäc loaïi boû lôùp maøng bao naøy seõ laøm giaûm bôùt khaû naêng soáng soùt cuûa chuùng, chæ coøn 3% [15]. . Con ñöôøng sinh toång hôïp BC. Sinh toång hôïp BC laø moät tieán trình bao goàm nhieàu böôùc ñöôïc ñieàu hoøa moät caùch chuyeân bieät vaø chính xaùc, lieân quan ñeán moät löôïng lôùn enzyme, caùc chaát xuùc taùc vaø protein ñieàu hoøa. Tieán trình naøy bao goàm söï sinh toång hôïp urdine diphosphoglucose (UDPGIc), tieàn chaát cuûa cellulose, tieáp ñeán laø söï polymer hoùa glucose vaøo moãi chuoãi b-1,4-glucan vaø söï keát hôïp caùc sôïi môùi vaøo daûi (ribbon), ñöôïc hình thaønh töø haøng traêm, thaäm chí haøng ngaøn sôïi cellulose rieâng leû. Trong quaù trình sinh toång hôïp cellulose vi khuaån, UDPGIc ñöôïc xem laø tieàn chaát cuûa cellulose. Ñaàu tieân glucose ñöôïc phosphoryl hoùa thaønh glucose-6-phosphate, phaûn öùng naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi glucokinase, tieáp theo ñoù phaûn öùng isomer hoùa glucose-6-phosphate thaønh glucose-1-phosphate ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme phosphoglucomutase. Sau ñoù, enzyme UDPGIc pyrophosphorylase xuùc taùc phaûn öùng chuyeån glucose-1-phosphate thaønh UDP-glucose, tieàn chaát cuûa cellulose. Cuoái cuøng, UDP-glucose ñöôïc chuyeån thaønh cellulose nhôø xuùc taùc cuûa enzyme cellulose sythase [15, 16]. Hình 1.4. Con ñöôøng sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån Acetobacter xylinum [1]. Tröùng vòt muoái Qui trình saûn xuaát tröùng vòt muoái Tröùng vòt Röûa saïch Laøm raùo Phaân taùch Ngaâm Vôùt ra, röûa saïch Röûa laàn 1 baèng coàn Röûa laàn 2 baèng nöôùc muoái Loøng ñoû Saáy khoâ beà maët Bao goùi Saûn phaåm Loøng traéng Dung dòch muoái 12% T0C = 650C Thôøi gian: 24h T0C = 800C Thôøi gian: 10 - 15 phuùt Maøng BC haáp phuï nisin Sô ñoà 1.1. Quy trình saûn xuaát loøng ñoû tröùng vòt muoái [4]. Tieâu chuaån tröùng vòt muoái Saûn phaåm tröùng vòt muoái ñöôïc ñaùnh giaù theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67. Yeâu caàu kyõ thuaät Nguyeân lieäu chính vaø phuï: Tröùng: tröùng töôi coù hình baàu duïc, voû tröùng saïch khoâng dính baån, coù muøi hôi tanh cuûa tröùng. Chieàu cao buoàng khí khoâng quaù 9mm. maøng khoâng bò raùch. Loøng traéng, loøng ñoû coøn toát, chöa coù hieän töôïng gì hö hoûng. Muoái: muoái khoâ saïch, khoâng coù taïp chaát. Chæ tieâu vi sinh vaät: khoâng ñöôïc pheùp coù vi sinh vaät gaây beänh vaø khoâng coù hieän töôïng hö hoûng do vi sinh vaät gaây ra. Chæ tieâu hoùa lyù: theo caùc yeâu caàu ghi trong baûng 1 Baûng 1.3. Baûng chæ tieâu hoùa lyù. Teân chæ tieâu Yeâu caàu Loaïi 1 Loaïi 2 Khoái löôïng quaû khoâng thaáp hôn 55g 50g Haøm löôïng muoái aên (Natri clorua) tính theo % 4 - 7 [14]. Chæ tieâu caûm quan: theo caùc yeâu caàu ghi trong baûng 2 Baûng 1.4. Baûng chæ tieâu caûm quan Teân chæ tieâu Yeâu caàu Muøi vò Tröùng ñaõ luoäc chín coù muøi hôi ñaäm maën töï nhieân cuûa tröùng muoái. Khoâng ñöôïc coù muøi vò laï Loøng ñoû Loøng ñoû nguyeân veïn, hình caàu, coù maøu vaøng ñoû vaø raén, khoâng cho pheùp bò vöõa, bò aùm ñen, coù nhöõng tia maùu [14] Caùc nghieân cöùu trong vaø ngoaøi nöôùc veà öùng duïng bacteriocin vaø maøng BC haáp phuï bacteriocin ñeå baûo quaûn thöïc phaåm Caùc nghieân cöùu trong nöôùc Traàn Thò Töôûng An (2006), böôùc ñaàu nghieân cöùu söû duïng maøng moûng BC haáp phuï bacteriocin cuûa Lc. lactis ñeå baûo quaûn thòt sô cheá toái thieåu. Keát quaû coù theå baûo quaûn thòt töôi 3 ngaøy baèng maøng moûng BC haáp phuï dòch thoâ bacteriocin 200 AU/ml vaãn ñaûm baûo chaát löôïng thòt theo tieâu chuaån TCVN 7046 : 2002[1]. Nguyeãn Thò Myõ Leä (2009), ñaõ khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch bacteriocin vaøo maøng BC ñeå baûo quaûn möïc moät naéng. Keát quaû coù theå baûo quaûn möïc moát naéng 13 ngaøy baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin tinh saïch 200 IU/ml vaãn ñaûm baûo chaát löôïng möïc theo TCVN 5649:1992 vaø TCVN 5289:1992. Thôøi gian baûo quaûn möïc moät naéng ñöôïc keùo daøi theâm 8 ngaøy so vôùi maãu ñoái chöùng [7]. Caùc nghieân cöùu ngoaøi nöôùc Siragusa vaø cs (1999) ñaõ keát hôïp nisin vaøo trong maøng polyethylene duøng ñeå bao goùi chaân khoâng thòt boø töôi. Hoaït ñoäng cuûa nisin trong maøng bao giuùp choáng laïi Lactobacillus helveticus vaø B. thermosphacta ñöôïc caáy vaøo treân beà maët moâ cuûa thòt. Sau 20 ngaøy baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh thì maãu ñöôïc bao boïc baèng maøng coù chöùa nisin coù maät ñoä B. thermosphacta thaáp hôn maãu ñoái chöùng (khoâng coù nisin) [33]. Scannel vaø cs (2000) ñaõ tìm hieåu khaû naêng haáp phuï nisin vaø lacticicin 3147 vaøo maøng cellulose ñeå baûo quaûn phomai vaø thòt jambon. Ñaàu tieân, khi khaûo saùt khaû naêng haáp phuï cuûa hai bacteriocin noùi treân thì ngöôøi ta nhaän thaáy raèng lacticicin 3147 khoâng coù khaû naêng haáp phuï toát vaøo maøng, trong khi ñoù nisin laïi coù khaû naêng thaám vaøo maøng raát toát vaø coù theå oån ñònh trong voøng 3 thaùng trong ñieàu kieän baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh. Ngöôøi ta bao goùi phomai vaø thòt jambon baèng phöông phaùp MAP vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh ñeà laøm maãu ñoái chöùng. Ñoái vôùi maãu thí nghieäm, ngöôøi ta thöïc hieän bao goùi vôùi maøng cellulose coù haáp phuï nisin. Söï keát hôïp nisin vôùi maøng cellulose ñaõ laøm giaûm soá löôïng L. innocula xuoáng coøn 1.5 log10 CFU/g sau 12 ngaøy baûo quaûn (trong khi soá löôïng ban ñaàu coù trong maãu laø 2 – 4 x105 CFU/g. Vaø soá löôïng teá baøo S. aureus 1.5 log10 CFU/g trong phomai vaø 2.8 log10 CFU/g trong phomai. Nghieân cöùu naøy caøng cho thaáy tính hieäu quaû trong vieäc keát hôïp bacteiocin trong maøng bao thöïc phaåm ñeà keùo daøi thôøi gian baûo quaûn [32]. Coma vaø cs (2001) ñaõ haáp phuï nisin vaøo trong maøng bao aên ñöôïc coù nguoàn goác töø cellulose ( maøng hydroxypropylmethylcellulose). Nhöõng khaûo saùt cho thaáy maøng coù theå choáng laïi söï phaùt trieån cuûa L. innocua vaø S. aureus, nhöng vieäc theâm vaøo chaát phuï gia ñeå taêng khaû naêng thaám nöôùc cuûa maøng laø stearic acid seõ laøm giaûm khaû naêng khaùng khuaån cuûa nisin. Nghieân cöùu naøy ñaõ ñaùnh daáu khaû naêng öùng duïng nisin keát hôïp maøng bao aên ñöôïc vaøo lónh vöïc thöïc phaåm [19]. Hudaa Neetoo vaø cs (2007) ñaõ nghieân cöùu tieàm naêng cuûa nisin keát hôïp vôùi maøng bao plastic söû duïng trong baûo quaûn caù hoài. Nghieân cöùu cho thaáy khi uû caù hoài vôùi maät ñoä ban ñaàu laø 5 x 102 CFU/cm2 Listeria monocytogene ñem uû trong maøng bao coù nisin vôùi hoaït tính 2000IU/cm2 vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä 100C hay 40C. Keát quaû cho thaáy, maãu uû vôùi nisin 2000IU/cm2 thì giaûm ñi 3,9 laàn so vôùi maãu ñoái chöùng (khoâng chöùa nisin) sau 56 ngaøy uû ôû 40C hay 49 ngaøy ôû 100C. Coøn maãu uû vôùi nisin 500IU/cm2 thì giaûm 0.5 ñeán 1,7 laàn sau 56 ngaøy uû ôû 40C hay 49 ngaøy ôû 100C [24]. Young-Min Kim vaø coäng söï (2000) ñaõ söû duïng hai loaïi bacteriocin laø nisin vaø lacticicin NK24 haáp phuï vaøo maøng coù maät ñoä polyethylene thaáp keát hôïp vôùi 2% polyamide. Caùc chaát phuï gia cuõng ñöôïc theâm vaøo nhö sodium chloride, citric acid vaø chaát hoaït ñoäng beà maët ñeå laøm taêng hieäu quaû cuûa vieäc haáp phuï vaø hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa bacteriocin treân maøng. Vi sinh vaät chæ thæ ñöôïc söû duïng laø Micrococcus flavus ATCC 10240. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy söï haáp phuï nisin vaøo maøng bao hieäu quaû hôn lacticicin NK24. Hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa maøng bao haáp phuï bacteriocin khoâng bò aûnh höôûng ñôn leû bôûi ñoä haáp phuï cuûa bacteriocin, vaø baûn chaát töï nhieân beân trong cuûa dung dòch choáng laïi vi khuaån laø nhaân toá quan troïng trong vieäc kieåm soaùt söï gia taêng cuûa vi sinh vaät. Söï keát hôïp cuûa sodium chloride, citric acid vaø chaát hoaït ñoäng beà maët khoâng laøm caûi thieän khaû naêng haáp phuï cuûa nisin vaøo maøng vaø hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa nisin treân maøng [35]. CHÖÔNG 2: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP Vaät lieäu Gioáng vi sinh vaät Vi khuaån gaây hö hoûng thöïc phaåm duøng laøm chuûng chæ thò cho hoaït tính khaùng khuaån cuûa bacteriocin: Bacillus subtilis (PTN), Bacillus cereus (PTN), Salmonella typhimurium SA – 1.06, Escherichia coli ATCC 2592. Vi khuaån Acetobacter xylinum BC16 duøng ñeå leân men thu nhaän maøng moûng BC ñöôïc cung caáp töø Boä söu taäp gioáng cuûa Boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Moâi tröôøng nuoâi caáy MT 1: Moâi tröôøng giöõ gioáng Acetobacter xylinum Nöôùc döøa giaø 1lit Glucose 20g Diamoni phosphate 2g Amonium sulphate 8g Cao naám men 2g Agar 20g MT 2: Moâi tröôøng nhaân gioáng vaø leân men BC Nöôùc döøa giaø 1000ml Glucose 20g Diamoni phosphate 2g Amonium sulphate 8g Cao naám men 2g Acid acetic 5ml MT 3: Moâi tröôøng NB Pepton 10g Yeast extract 5g NaCl 5g Nöôùc caát 1000ml MT 4: Moâi tröôøng NA Pepton 10g Yeast extract 5g NaCl 5g Nöôùc caát 1000ml Agar 20g Vaät lieäu, hoùa chaát HCl, NaOH, thuoác nhuoäm xanh Methylene, thuoác nhuoäm Gram. Bacteriocin vôùi caùc noàng ñoä 100, 200, 300 vaø 500 IU/ml töø cheá phaåm Nisaplin coù nguoàn goác töø Lactococcus lactis. Thieát bò vaø duïng cuï Tuû caáy voâ truøng, tuû aám, tuû saáy, noài haáp tieät truøng, maùy laéc nhieät ñoä thaáp, maùy laéc troøn, loø viba, beáp ñieän, ñóa nhöïa. Thieát bò phaân tích: kính hieån vi, caân kyõ thuaät, caân phaân tích, pH keá. Duïng cuï thuûy tinh duøng trong phaân tích: erlen, becher, ñóa Petri, oáng nghieäm, bình ñònh möùc. Noäi dung thí nghieäm Caùc böôùc tieán haønh thí nghieäm ñöôïc theå hieän ôû sô ñoà 2.1 Nhieät ñoä Thôøi gian Cheá ñoä laéc Noàng ñoä bacteriocin Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình BC haáp phuï dòch nisin Maøng BC haáp phuï dòch nisin ôû ñieàu kieän toái öu Baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái Phöông phaùp A: Nhuùng tröùng vaøo nisin, bao beân ngoaøi 1 lôùp PE Phöông phaùp B: Boïc tröùng maøng BC haáp phuï dòch nisin, bao ngoaøi lôùp PE Ñaùnh giaù chaát löôïng saûn phaåm: Vi sinh Caûm quan Phöông phaùp ÑC1: Loøng ñoû tröùng vòt muoái bao beân ngoaøi 1 lôùp PE. Sô ñoà 2.1. Noäi dung caùc böôùc thí nghieäm cuûa ñeà taøi. Phöông phaùp thí nghieäm Khaûo saùt khaû naêng taïo maøng moûng BC baèng phöông phaùp leân men truyeàn thoáng. Maøng BC ñöôïc thu nhaän töø quaù trình leân men theo sô ñoà 2.2 Gioáng A.xylinum Nhaân gioáng caáp I Nhaân gioáng caáp II Caáy gioáng:10-20% gioáng Leân men tónh (1-2ngaøy) Thu nhaän BC thoâ Sô ñoà 2.2. Caùc böôùc leân men thu nhaän maøng BC [23]. Gioáng ñöôïc nhaân gioáng caáp 1 ôû ñieàu kieän nhieät ñoä thöôøng trong 24 giôø vôùi tyû leä gioáng laø 20%. Sau ñoù tieáp tuïc nhaân gioáng caáp 2 ôû ñieàu kieän nhieät ñoä phoøng trong voøng 48 giôø vôùi tyû leä gioáng 20%. Tieáp theo, gioáng ñöôïc leân men trong moâi tröôøng nhaân gioáng ñeå taïo maøng BC. Ñeå thu ñöôïc lôùp maøng coù beà daøy mong muoán, thí nghieäm ñöôïc thieát laäp nhö sau: gioáng vaø moâi tröôøng nhaân gioáng ñöôïc troän vôùi nhau, sau ñoù ñem ñoå dòch gioáng vaøo ñóa nhöïa coù kích thöôùc ñöôøng kính laø 10,5 cm vôùi theå tích dòch gioáng laø: 12ml, 14ml, 16ml, 18ml, 20ml. Phöông phaùp xöû lyù maøng BC tröôùc khi haáp phuï Maøng BC sau khi thu ñöôïc chöùa moät löôïng lôùn moâi tröôøng leân men vaø caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát (acid acetic,…). Muïc ñích cuûa ñeà taøi laø söû duïng maøng moûng BC ñeå haáp phuï nisin ñeå gia taêng thôøi gian baûo quaûn tröùng vòt muoái neân vieäc xöû lyù maøng BC phaûi ñaït nhöõng yeâu caàu sau: Coù tính chaát cô lyù beàn vöõng, ñoä tröông nôû oån ñònh, chòu ñöôïc caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö khuaáy troän, aùp löïc, nhieät ñoä… Khoâng gaây taùc ñoäng ñoái vôùi chaát ñöôïc haáp phuï vaø thöïc phaåm ñöôïc bao boïc. BC sau khi leân men xong seõ ñöôïc xöû lyù theo sô ñoà Maøng BC thoâ Röûa vaø ngaâm nöôùc (24h) Ngaâm trong NaOH 3% (10h) Ngaâm trong HCl 5% (20phuùt) Röûa vaø ngaâm nöôùc (24h) Haáp tieät truøng (1210C, 15phuùt) Maøng BC Sô ñoà 2.3. Caùc böôùc xöû lyù maøng BC [24]. Ño beà daøy maøng BC Beà daøy maøng BC ñöôïc xaùc ñònh baèng thöôùc keïp vaø ñoàng hoà ño chieàu daøy. Ta ño ôû nhieàu vò trí khaùc nhau. Sau ñoù xaùc ñònh ñöôïc beà daøy baèng caùch tính toaùn caùc laàn ño. Thí nghieäm ñöôïc boá trí trong baûng Baûng 2.1. Caùch boá trí thí nghieäm ño beà daøy maøng Maãu d1 (mm) d2 (mm) d3 (mm) d4 (mm) dtb (mm) A1 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 A2 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 A3 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 A4 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 Xaùc ñònh hoaït tính cuûa nisin tröôùc khi haáp phuï Phöông phaùp gieáng khueách taùn laø phöông phaùp ñeå xaùc ñònh hoaït tính cuûa nisin tröôùc khi haáp phuï [24] Ñoå 15ml moâi tröôøng MT 3 vaøo ñóa Petri voâ truøng, ñeå thaïch ñoâng. Traûi 10ml dòch nuoâi caáy qua ñeâm chuûng chæ thò Bacillus cereus. Ñuïc loã coù ñöôøng kính 5mm treân thaïch. Nhoû 20ml dòch nisin vaøo loã thaïch, uû ôû 370C, 12 giôø. Quan saùt voøng khaùng khuaån xuaát hieän treân maët thaïch. Xaùc ñònh hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï dòch nisin Ñoå 15ml moâi tröôøng MT 3 vaøo ñóa Petri voâ truøng, ñeå thaïch ñoâng. Traûi 10ml dòch nuoâi caáy qua ñeâm chuûng chæ thò Bacillus cereus. Caét maøng maûng BC thaønh nhöõng mieáng nhoû coù kích thöôùc 1 x 1 cm, cho haáp phuï trong dòch nisin. Duøng maøng BC sau khi haáp phuï ñaët vaøo giöõa ñóa Petri ñaõ coù chuûng chæ thò, uû ôû 370C, 12 giôø. Quan saùt voøng khaùng khuaån. Xaùc ñònh thoâng soá toái öu cuûa quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng moûng BC Thöïc hieän quy hoaïch thöïc nghieäm toái öu hoùa toaøn phaàn 4 yeáu toá (24) Xaùc ñònh thoâng soá cuûa quaù trình: Thoâng soá ñaàu ra: haøm löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC (g), kyù hieäu laø yi. Thoâng soá ñaàu vaøo: caùc yeáu toá taùc ñoäng leân quaù trình haáp phuï dòch nisin ñöôïc kyù hieäu laø Zi. Caùc thoâng soá chính aûnh höôûng tôùi quaù trình haáp phuï dòch nisin laø: noàng ñoä nisin (x1), nhieät ñoä (x2), thôøi gian (x3), cheá ñoä laéc (voøng/phuùt). Xaùc ñònh möùc cô sôû vaø khoaûng bieán thieân yeáu toá ñaàu vaøo. Choïn khoaûng bieán thieân xi laøm 3 möùc: treân, döôùi vaø cô sôû. Caùc möùc naøy ñöôïc maõ hoùa nhö sau: möùc treân +1, möùc döôùi -1, möùc cô sôû 0 Baûng 2.2. Caùc möùc bieán thieân vaø caùc yeáu toá aûnh höôûng trong quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC Caùc möùc Caùc yeáu toá X1 X2 X3 X4 Möùc cô sôû (0) 200 20 30 150 Khoaûng bieán thieân (±1) 100 10 10 50 Möùc treân (+1) 300 30 40 200 Möùc döôùi (-1) 100 10 20 100 x1: noàng ñoä nisin (IU/ml); x2: nhieät ñoä (0C); x3: thôøi gian (phuùt); x4: cheá ñoä laéc (voøng/phuùt). Soá löôïng thí nghieäm ñöôïc xaùc ñònh theo coâng thöùc: Nk = 24 = 16 thí nghieäm. N: soá löôïng nghieäm thöùc; k: soá yeáu toá khaûo saùt. Xaây döïng phöông trình baäc nhaát ñeå xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa 4 yeáu toá khaûo saùt tôùi quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC. Phöông trình hoài quy moâ taû thöïc nghieäm coù daïng: y= bo +b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 ….. Trong ñoù: b0, b1, b2, b3, …. laø caùc heä soá trong phöông trình hoài quy [3]. Thöïc hieän thí nghieäm leo doác Döïa vaøo keát quaû quy hoaïch thöïc nghieäm tieán haønh toái öu hoùa thöïc nghieäm ñöôïc thöïc hieän baèng phöông phaùp ñöôøng doác nhaát. Choïn böôùc chuyeån ñoäng cho caùc yeáu toá coù aûnh höôûng trong phöông trình hoài quy. Ñeå tìm ñöôïc caùc thoâng soá toái öu phaûi xaùc ñònh ñöôïc y cao nhaát, töông öùng caùc giaù trò x1, x2, x3, x4 cuûa caùc yeáu toá caàn tìm. Phöông phaùp xaùc ñònh theå tích nisin bò haáp phuï Choïn maøng BC coù khoái löôïng töông ñoái ñeàu nhau, ñem haáp phuï theo caùc thoâng soá thieát keá thí nghieäm qui hoaïch thöïc nghieäm. Caân khoái löôïng mieáng BC sau khi haáp phuï, hieäu soá giöõa khoái löôïng tröôùc vaø sau khi haáp phuï chính laø löôïng nisin haáp phuï vaøo. ÖÙng duïng baûo quaûn tröùng vòt muoái baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin Khaûo saùt khaû naêng öùng duïng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin ôû cheá ñoä toái öu vöøa khaûo saùt vaø thöïc teá baûo quaûn tröùng vòt muoái ôû nhieät ñoä phoøng. Sau khi xaùc ñònh ñieàu kieän toái öu maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin, ta ñem maøng moûng haáp phuï nisin bao boïc tröùng vòt muoái, bao goùi maãu baèng maøng PE, baûo quaûn nhieät ñoä phoøng. Boá trí thí nghieäm: caùc maãu khaûo saùt ñöôïc trình baøy qua baûng 2.3 Baûng 2.3. Caùc maãu khaûo saùt phöông phaùp baûo quaûn tröùng vòt muoái. Maãu thí nghieäm Phöông phaùp baûo quaûn Tieán haønh thí nghieäm ÑC1(ñoái chöùng thí nghieäm) Ñoái chöùng theo thôøi gian baûo quaûn A Baûo quaûn baèng dòch nisin Nhuùng maãu tröùng vòt muoái qua dòch nisin 200IU/ml, bao beân ngoaøi moät lôùp PE B Baûo quaûn baèng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin Boïc maãu tröùng vòt muoái baèng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin 200IU/ml, bao beân ngoaøi moät lôùp PE. Caùc chæ tieâu theo doõi: tieán haønh kieåm tra ñaùnh giaù chaát löôïng cuûa caùc maãu thí nghieäm thoâng qua: Caùc chæ tieâu vi sinh (667/1998/ QÑ – BYT): toång soá vi khuaån hieáu khí, Coliform, E. coli, Salmonella. Tieán haønh ñaùnh giaù veà maët caûm quan cuûa caùc maãu theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Taïo maøng moûng BC Khaûo saùt moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng Acetobacter xylinum Chuûng Acetobacter xylinum BC16 do phoøng thí nghieäm Boä moân Coâng ngheä sinh hoïc cung caáp ñöôïc kieåm tra moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc. Keát quaû thu ñöôïc nhö sau: Kieåm tra vi theå Gioáng Acetobacter xylinum ñöôïc nhuoäm Gram vaø quan saùt döôùi kính hieån vi, chuùng toâi nhaän thaáy: vi khuaån Acetobacter xylinum Gram aâm, coù daïng hình que, teá baøo ñöùng rieâng leû. Hình 3.1. Hình quan saùt vi theå gioáng Acetobacter xylinum qua kính hieån vi. Kieåm tra ñaïi theå Ñaëc ñieåm sinh tröôû