Luận văn Khảo sát một số đặc tính azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

uật trồng trọt, điển hình là việc sử dụng nông dược có ảnh hưởng gì đến việc nhiễm khuẩn Azospirillum vào cây trồng hay không. 31 Sau khi xác định được tổ hợp “vi khuẩn – thực vật” có triển vọng nhất thì việc ứng dụng trong sản xuất có thu được kết quả dương tính hay không cần phải làm sáng tỏ ngay một số khía cạnh : vi khuẩn có tiếp cận được với rễ hay không khi hệ rễ quá lớn chiếm một không gian đáng kể trong đất ; thời điểm chính xác mà cây cần được nhiễm vi khuẩn, kỹ thuật nhiễm vi khuẩn phải thực dụng, kinh tế và dễ thực hiện, sản phẩm sử dụng phải có mật độ giống đủ để cạnh tranh trong tự nhiên và có sức sống lâu bền [17]. Các chế phẩm được tạo ra phải đáp ứng các yêu cầu : khô, đa dạng, đơn giản sử dụng, đồng nhất, bị phân giải sinh học do các vi sinh vật đất, không gây độc, vi khuẩn phải không tạp nhiễm, giải phóng chậm, tồn tại được trong một thời gian dài và có thể tiến hành sản xuất ở quy mô lớn [17]. à Chế phẩm Rizolu [1] Quy trình sản xuất chế phẩm do Nguyễn Thị Phương Chi, Nguyễn Ngọc Dũng, Hà Thị Hồng Thanh đề xuất 1995. Cấy dịch nuôi vi khuẩn Azospirillum vào môi trường xốp than bùn với tỷ lệ 1 : 80 (ml/g). Sau 7 ngày nuôi ủ, chế phẩm đạt 109tế bào/gram, có thể bảo quản 6 tháng ở nhiệt độ phòng. Phương pháp sử dụng chế phẩm : sử dụng 45g/sào mạ cấy. Xử lý qua 2 bước : trộn vào mầm lúa ngay trước khi gieo và hồ vào rễ mạ trước khi cấy. à Chế phẩm Azogin [7] Để sản xuất chế phẩm này người ta sử dụng môi trường Dobereiner cải tiến. Môi trường được phân vào bình nón có dung tích từ 250 - 500 ml ở mức 1/3 thể tích bình. Thanh trùng bằng hơi nước ở áp suất 1 atm/30 phút. Lượng giống cấy vào chiếm 1 - 5% thể tích môi trường. Sau 48 - 72giờ nuôi cấy trên máy lắc có tần số 120 - 200vòng/phút hoặc trong các thùng lên men được cấp 1 - 2lít không khí cho mỗi lít môi trường, nhiệt độ nuôi cấy 30 - 47oC, mật độ vi khuẩn có thể đạt 109 - 1010tế bào/ml. các chủng vi khuẩn khác nhau được nuôi cấy riêng lẻ 32 rồi chuyển một cách vô trùng vào chung một bồn chứa. Từ đây chúng tiêm vào các chất mang đã được thanh trùng trước để tạo sản phẩm. Mỗi hecta gieo trồng sử dụng 500 - 800gram sản phẩm. Chất mang được sử dụng trong quy trình này là than bùn trộn với chất hữu cơ theo tỷ lệ 1 : 1, nghiền mịn qua rây 0,1mm, các túi chất mang được thanh trùng tia γ với liều chiếu xạ – 45 KGY. à Giải pháp hữu ích HI0131 [7] Đây là một quy trình sản xuất chế phẩm đạm sinh học từ Azospirillum lipoferum. Quy trình này được gọi là giải pháp hữu ích, vì nó ít tiêu tốn điện năng, không đòi hỏi chi phí đầu tư lớn, thích hợp để sản xuất phân vi sinh với quy mô gia đình, ở các vùng sâu, vùng xa, vùng núi. Ở quy trình này, các chủng vi khuẩn thuộc Azospirillum lipoferum được bảo quản trong những lọ thủy tinh đặc biệt để có thể bảo quản được trong điều kiện bình thường một thời gian dài (khoảng 12 tháng). Môi trường nhân sinh khối được phân vào các chai thủy tinh dân dụng như chai bia, chai nước ngọt... Lượng môi trường chiếm khoảng 2/3 thể tích mỗi chai. Thanh trùng những chai này bằng nồi áp suất dân dụng trong khoảng thời gian 60phút kể từ lúc sôi. Sau khi thanh trùng, để nguội, cấy giống vi khuẩn Azospirillum và để vào nơi thoáng mát trong nhà. Sau 24giờ lấy ra lắc mạnh để trộn đều môi trường nuôi cấy. Tiếp tục để vào chỗ cũ 24 - 48giờ sau ta thu được dịch sinh khối vi khuẩn có mật độ 108 - 109tế bào/ml. Dịch này có thể bảo quản được trong điều kiện bình thường được 20 - 30ngày sau. Có thể dùng dịch sinh khối vi khuẩn trên để trộn vào mầm mạ trước khi gieo, hồ rễ mạ trước khi cấy hoặc trộn với hỗn hợp đất bột - phân chuồng hoai (tỷ lệ 1 : 1) hoặc hỗn hợp than bùn-phân hữu cơ (tỷ lệ 1 : 1) để tạo ra chế phẩm phân vi sinh vật cố định đạm tương tự như Azogin. Chế phẩm Rizolu đã được thử nghiệm lần đầu vào vụ mùa 1991 tại cánh đồng thí nghiệm của Viện Khoa học kỹ thuật VN - An Khánh (Hoài Đức, Hà 33 Tây) và một số vùng khác ở ngoại thành Hà Nội đã thu được những kết quả bước đầu rất khả quan : mạ được xử lý Rizolu có chiều cao hơn đối chứng khoảng 0,5 - 1,5cm, màu xanh đậm hơn, cứng cây hơn, lá to bản hơn, bộ rễ phát triển tốt hơn... Vụ mùa 1992 có một số nơi đã sử dụng đại trà chế phẩm Rizolu đều có cùng nhận xét như các nơi thí nghiệm vụ mùa 1991. Kết quả ảnh hưởng của Rizolu lên lúa ở thời kỳ bắt đầu làm đòng thu được ở vụ mùa 1992 cho thấy lúa được nhiễm Rizolu đẻ nhánh tăng hơn khoảng 9 - 20% so với đối chứng. Đồng thời chiều cao cây cũng tăng khoảng 8%. Vụ mùa xuân 1993 các tỷ lệ này tăng kém hơn so với vụ mùa, do nhiệt độ không khí trong thời gian này thấp (15 - 20oC) thấp hơn nhiều so với nhiệt độ vụ mùa (25 -32oC) nên tác dụng Azospirillum không biểu hiện mạnh như ở vụ mùa 1992. Những kết quả về nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Rizolu lên lúa giai đoạn thu hoạch cũng đã thu được như sau : số lượng bông trên mỗi khóm của mẫu thí nghiệm và đối chứng chênh lệch nhau không đáng kể, có những mẫu bằng nhau. Tổng số hạt lép giảm đi ở những cây có nhiễm Rizolu so với những cây không nhiễm là những yếu tố đóng góp đáng kể tạo nên sự tăng năng suất hạt. Hạt của những cây được nhiễm chế phẩm thường sáng màu hơn, mảy hơn. Nhiễm Azospirillum làm kích thích sự nảy mầm sớm, tăng đẻ nhánh và tăng độ chắc của hạt cùng với năng suất hạt tăng, trọng lượng khô của cây và rễ cũng tăng. Những nơi sử dụng chế phẩm trên diện rộng hơn cũng cho nhận xét tốt về hình thái mạ và năng suất lúa tăng từ 5 - 25%. Tùy theo giống lúa khác nhau, đồng đất khác nhau mà năng suất tăng theo tỷ lệ khác nhau khi nhiễm chế phẩm Rizolu. 34 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU-NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 35 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ Ngoài các thiết bị và dụng cụ cần thiết của Phòng Thí nghiệm Vi sinh còn cần các thiết bị và dụng cụ chuyên dụng sau : - Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen – Mikro22R). - Máy quang phổ (Thermo - Biomate3). - Bộ chưng cất đạm của hãng Gerhardt gồm ba bộ phận. + Công phá mẫu (Kjeldatherm). + Chưng cất (Vapodest). + Bộ hút (Turbosog). - Lux kế (Tes 1330). - Máy đo độ ẩm (Denver instrument - IR200). 2.1.2. Hóa chất và môi trường Hóa chất Thuốc nhuộm tiên mao : thuốc nhuộm Nishizawa Kaghen [2]. Các hóa chất sử dụng trong phương pháp Kjeldahl [13]. Thuốc thử sự hiện diện nitrite trong môi trường : thuốc thử tinh bột – iode. Thuốc thử khả năng sinh tổng hợp IAA : thuốc thử Salkowski [26]. Môi trường - Môi trường phân lập và làm thuần ∗ Môi trường vô đạm NFb (nitrogen - fixing broth) (MT1) [21] Thành phần môi trường (g/l) D,L malic acid 5,0 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 CaCl2 0,02 36 NaCl 0,1 Bromothymol blue (0.5%) trong KOH 0.2M 2ml Dung dịch vitamin(1) 1ml Dung dịch khoáng vi lượng(2) 2ml 1,64% dung dịch FeEDTA 4ml KOH 4,5 Agar 0,0175 - 0,5% pH 6,5 (1)Trong 100ml, dung dịch vitamin chứa : Biotin 10mg Pyridoxol-HCl 20mg Hoà tan trong chậu nước 100oC (2) Trong 1lít, dung dịch khoáng vi lượng chứa : CuSO4.5H2O 40mg ZnSO4.7H2O 0,12g H3BO3 1,4g Na2MoO4 1,0g MnSO4.H2O 1,175g ∗ Môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ (MT2) Môi trường này có thành phần cơ bản là môi trường đặc (15g agar/l) NFb có bổ sung 15ml dung dịch đỏ congo 0,25% và cao nấm men 50mg/lít môi trường. - Môi trường nuôi cấy Môi trường Dobereiner và cộng sự (1976) (g/l) (MT3) [7] Acid malic 5,0 KH2PO4 0,4 MgSO4.7H2O 0,2 37 NaCl 0,1 CaCl2 .7H2O 0,02 FeCl3.6H2O 0,01 Na2MoO4 0,002 Bromothymol blue (0,5%) 2ml KOH 4,0 Agar 1,75 pH 6,8 - Môi trường vô đạm thử khả năng sử dụng nguồn carbon [23] Môi trường bán lỏng NFb thay acid malic bằng các hợp chất làm nguồn carbon : glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. - Môi trường dịch thể thử khả năng sử dụng nguồn carbon Môi trường Andrade (MT4) [2] Dung dịch chỉ thị màu : hòa 0,5g fuchsin acid vào 100ml nước cất, thêm 16,4ml NaOH 1N, khử trùng 5phút ở 110oC. Môi trường cơ bản (g/l) Pepton 10 NaCl 5 Đường 5 pH 7,6 Dung dịch đường, môi trường cơ bản và dung dịch chỉ thị màu được khử trùng riêng biệt. Mỗi bình đựng 100ml môi trường cơ bản, sau khi khử trùng bổ sung thêm 1ml dung dịch chỉ thị màu và 0,5g nguồn đường. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 3 - 5ml (trong có chứa ống Durham). Môi trường trước khi cấy có màu vàng cỏ sáng (gần như trong suốt). Nếu có màu hồng nhạt thì phải điều chỉnh lại bằng NaOH vô trùng. 38 - Môi trường nuôi cấy thử khả năng khử nitrate (MT5) Sử dụng môi trường cao thịt – pepton bổ sung 0,2% KNO3 [5] Môi trường cao thịt – pepton (g/l) Cao thịt 3 Pepton 10 NaCl 5 pH 6,0 - Môi trường nuôi cấy khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sự sinh trưởng của Azospirillum : Môi trường Dobereiner - Môi trường trồng lúa trong ống nghiệm Môi trường MS (Murashige & Skoog) (MT6) [14] Khoáng đa lượng Hàm lượng sau cùng (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Khoáng vi lượng Hàm lượng sau cùng (mg/l) H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.4H2O 8,6 KI 0,83 NaMoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Fe-EDTA Hàm lượng sau cùng (mg/l) 39 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Vitamin MS Hàm lượng sau cùng (mg/l) Glysin 2 Thiamin HCl 0,1 Acid nicotinic 0,5 Pyrodoxin 0,5 Agar 7 - 8g/l pH 5,8 2.1.3. Vật liệu thí nghiệm Œ Giống Giống vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ đất trồng lúa ở An Giang. Giống lúa sử dụng trong các thí nghiệm là giống OM4495. Giống cải thìa do công ty TNHH-TMSX-Hạt giống Hưng Nông-Số 49-Bình Tây-P1-Q6-TPHCM cung cấp. Œ Đất Lúa trong chậu và ngoài ruộng được trồng trên đất đê bao thuộc huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang. Đất trồng rau thuộc loại đất xám bạc màu, thành phần cơ giới nhẹ, cát nhiều thuộc quận Tân Bình, Tp Hồ Chí Minh. Œ Than bùn Than bùn dùng trong nghiên cứu được khai thác ở huyện Tri Tôn, tỉnh An Giang. 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập Môi trường sử dụng để phân lập là môi trường NFb bán lỏng (MT1). Tất cả các loài của vi khuẩn Azospirillum đều có thể phát triển trên môi trường MT1 40 và khi phát triển chúng hình thành một lớp váng mỏng phía dưới bề mặt môi trường. Môi trường NFb rắn (MT2) dùng để nhận diện khuẩn lạc của Azospirillum trên đĩa petri : Azospirillum sẽ tạo khuẩn lạc đỏ tươi hoặc đỏ đậm do chúng có khả năng hấp thu congo đỏ, trong khi đó các vi sinh vật đất khác không có khả năng hấp thu congo đỏ nên khuẩn lạc không có màu đỏ. Tiến trình phân lập [21] : Nghiền đất vùng rễ, hòa với nước cất vô trùng. Ống nghiệm nhỏ (khoảng 10ml) chứa 5ml NFb bán lỏng vô đạm cho nhiễm với huyền phù đất vùng rễ. Sau khi ủ 30oC 3 ngày, có sự hình thành váng mỏng. Sử dụng lớp váng này để phân lập bằng cách trải dịch vi khuẩn trên môi trường NFb rắn (MT2). Ủ 3 ngày nhận thấy trên môi trường xuất hiện 2 dạng khuẩn lạc có màu sắc khác nhau : trắng và đỏ. Những khuẩn lạc màu đỏ có thể là khuẩn lạc của vi khuẩn Azospirillum. Thuần khiết giống Các dạng khuẩn lạc màu đỏ vừa phân lập sẽ tiếp tục được làm thuần : Huyền phù tế bào vi khuẩn trong nước muối sinh lý vô trùng và trải dịch pha loãng lên đĩa petri môi trường, ủ ở 30oC trong 3 ngày. Sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc đỏ đặc trưng và tiếp tục cấy ria trên môi trường đến khi biểu hiện một dạng khuẩn lạc đồng nhất. Để xác định giống thuần khiết khi tiến hành quan sát dưới kính hiển vi qua hình dạng của vi khuẩn và nhuộm Gram. Chọn khuẩn lạc từ giống thuần khiết, cấy ria trên ống thạch nghiêng chứa môi trường Dobereiner, ủ ở 30oC. Sau 3 ngày khi khuẩn lạc phát triển đầy ống thạch, đem cất giữ trong tủ lạnh 10oC để sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo. Đồng thời tiến hành giữ giống bằng cách cấy truyền giống trong thạch nghiêng 41 định kỳ mỗi tháng một lần hoặc bảo quản giống trong dung dịch glycerine 40% (phương pháp lạnh đông). 2.2.2. Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt ™ Khả năng cố định đạm vi khuẩn Xác định khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp định lượng đạm tổng số - Kjeldahl. Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong các bình có chứa 100ml môi trường vô đạm - Dobereiner. Sau 7 ngày lấy dịch nuôi cấy vô cơ hóa và xác định đạm tổng số. Lượng đạm xác định được chính là lượng đạm do vi khuẩn cố định được sau 7 ngày nuôi cấy. ™ Khả năng sinh IAA của vi khuẩn IAA hay còn gọi là β-indole acetic acid hay indole-3-acetic acid thuộc nhóm auxin. Tryptophan là một amino acid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indole. Sản phẩm trung gian chính của phản ứng oxy hóa tryptophan là indole pyruvic acid - IPA. Phân tử này sau đó bị biến đổi theo hướng loại bỏ nhóm amin thành indole hoặc theo hướng loại nhóm carboxyl thành skatol. Tryptophanase xúc tác phản ứng loại nhóm amin thành indole. Dựa vào đặc điểm tryptophan là tiền chất để tổng hợp nên IAA, người ta đã đưa ra nhiều phương pháp nhằm xác định sự hiện diện cũng như hàm lượng IAA được tổng hợp. Chúng tôi chọn phương pháp hóa học để phát hiện IAA thông qua thuốc thử Salkowski (IAA cho màu hồng nhạt với FeCl3). y Định tính 42 Vi khuẩn được cấy trên môi trường Dobereiner rắn có bổ sung 0,01% tryptophan. Đặt giấy lọc vô trùng lên trên vết cấy. Ủ ở 30oC. Sau 3 ngày, lấy giấy lọc ra đặt lên giấy lọc khác đã bão hòa trong thuốc thử Salkowski. Thành phần thuốc thử Salkowski : FeCl3 0,5M 15ml H2SO4 98% 300ml Nước cất 500ml Thuốc thử sau khi pha xong cần bảo quản trong bình màu tối. Xem kết quả sau 30phút. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA sẽ hiện màu hồng với thuốc thử. Đối chứng 1 : giấy lọc đặt trên đĩa môi trường không có vi khuẩn, đối chứng 2 : IAA chuẩn nồng độ 1000ppm. y Định lượng - Dựng đồ thị chuẩn Cân chính xác 25000μg IAA chuẩn hòa tan với 100ml nước cất được dung dịch có nồng độ 250μg/l (dung dịch ban đầu). Lấy 1 - 13ml dịch ban đầu cho vào bình định mức 100. Lần lượt các bình được bổ sung nước cất đến 100ml. Như vậy các bình chứa dung dịch có nồng độ thay đổi từ 2,5μg/ml đến 32,5μg/ml. Ở mỗi nồng độ lấy 2ml và thêm vào đó 8ml thuốc thử Salkowski (dịch đối chứng là 2ml nước cất và 8 ml thuốc thử). So màu ở bước sóng 530nm. Đọc chỉ số OD và dựng đường chuẩn. - Định lượng IAA trong dịch nuôi cấy vi khuẩn Cấy vi sinh vật trên môi trường Dobereiner có bổ sung 0,01% tryptophan, lắc liên tục 120vòng/phút ở 30oC. Qua mỗi ngày đem dịch ly tâm 3500vòng/phút trong 20phút để thu lấy dịch trong. Lấy 2ml dịch trong cho vào 8ml thuốc thử Salkowski (dịch đối chứng là 2ml nước cất và 8ml thuốc thử Salkowski), so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 530nm (IAA cho màu hồng nhạt với FeCl3). Đối 43 chiếu vào đồ thị chuẩn để xác định lượng IAA sinh ra trong quá trình nuôi cấy. Hàm lượng IAA tính theo đơn vị μgIAA/ml. 2.2.3. Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng được chọn ™ Đặc điểm hình thái: y Quan sát đại thể Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường Dobereiner có độ dày 5mm. Sau khi làm khô bề mặt thạch cấy vi khuẩn. Nuôi cấy ở 30oC. Quan sát khuẩn lạc sau 5 ngày. y Quan sát vi thể à Hình dạng : Cấy vi khuẩn từ môi trường thạch nghiêng (môi trường Dobereiner) vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường Dobereiner bán lỏng. Nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 130vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Quan sát hình dạng và đo kích thước tế bào vi khuẩn sau 24giờ nuôi cấy dưới kính hiển vi thông qua tiêu bản nhuộm đơn. à Nhuộm Gram Dựa vào khả năng bắt màu với các thuốc nhuộm tím kết tinh và iode, tất cả các vi khuẩn được chia thành 2 nhóm lớn. Nhóm giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iode khi xử lý bằng alcool là những vi khuẩn Gram dương, nhóm không có khả năng giữ được phức chất này và bị mất màu khi xử lý bằng alcool là những vi khuẩn Gram âm. Dùng que cấy lấy một ít nước cất vô trùng đặt lên phiến kính. Từ môi trường đặc dùng que cấy khử trùng để nguội, lấy vi khuẩn Gram dương - Staphylococcus, làm huyền trọc vi trùng vào giọt nước trên phiến kính, bắt đầu ở bìa giọt nước để có huyền trọc vừa đủ đậm đặc. Dùng que cấy lấy vi khuẩn đang 44 khảo sát hòa trộn vào vi khuẩn trong giọt nước trên phiến kính. Dàn mỏng thành vết bôi. Cố định nhẹ trên ngọn lửa. Tiến hành nhuộm tiêu bản. à Khả năng di động Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường dịch thể 18giờ. Hòa dịch vi khuẩn vào ống nước muối sinh lý vô trùng. Sau 30phút làm tiêu bản giọt treo để xem khả năng di động của vi khuẩn. Tiến hành nhuộm tiên mao theo phương pháp Nishizawa Kaghen [2] để xác định vi khuẩn đơn mao hay đa mao. ™ Đặc điểm sinh lý, sinh hóa y Quan hệ với oxy : Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10ml môi trường Dobereiner thạch đứng. Dùng que cấy thẳng cấy thẳng từ trên mặt thạch vào ống môi trường ngập đến 2/3 ống. Ủ 30oC. Sau 72giờ đọc kết quả : vi khuẩn hiếu khí bắt buộc chỉ phát triển trên bề mặt, vi khuẩn kỵ khí bắt buộc chỉ phát triển dọc theo đường cấy, vi khuẩn hiếu khí tùy ý thì phát triển trên bề mặt lẫn dọc theo đường cấy. y Khả năng sử dụng một số nguồn carbon Khả năng đồng hóa và lên men các nguồn thức ăn carbon ở các loại vi khuẩn khác nhau là không giống nhau. Người ta coi đó là một trong những đặc tính quan trọng được sử dụng khi định danh vi khuẩn. Cơ sở của quá trình này là nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường chứa nguồn carbon khác nhau, xác định sự phát triển của vi khuẩn qua sự đổi màu của môi trường với sự hiện diện của chất chỉ thị màu. à Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường vô đạm Cấy vi khuẩn vào môi trường dịch thể vô đạm - NFb với D,L- malat được thay bằng glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. Sau 48giờ nuôi cấy quan sát sự đổi màu của chỉ thị pH - Bromothymol blue trong môi trường và tiến hành đo trị số mật độ quang. Vi khuẩn phát triển làm acid hóa môi trường 45 (pH<6), môi trường sẽ chuyển từ màu xanh lá cây sang vàng. Ngược lại, vi khuẩn phát triển làm kiềm hóa môi trường (pH>7,6), môi trường sẽ chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương. à Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể Andrade Cấy vi khuẩn vào môi trường dịch thể Andrade với các loại đường được thay đổi là glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. Quan sát sự đổi màu của chỉ thị fuchsin acid bổ sung vào môi trường sau 48giờ nuôi cấy. Nếu vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường này sẽ làm môi trường chuyển từ màu vàng sang màu hồng do có sự acid hóa môi trường làm đổi màu của chất chỉ thị. y Khả năng khử nitrate Việc khử nitrate thành nitrite xảy ra ở các vi sinh vật sản sinh enzyme nitratereductase và sử dụng nitrate để làm nguồn thức ăn nitơ. Đôi khi có trường hợp khử nitrate đến nitrogen phân tử. Khả năng khử nitrate được thấy rõ trong môi trường cao thịt – pepton bổ sung 0,2% KNO3 (MT5). Trong môi trường cao thịt - pepton với 0,2% KNO3, nếu vi khuẩn có khả năng khử nitrate thành nitrite thì chúng sẽ làm đục môi trường. Nitrite sẽ được phát hiện bằng phản ứng tinh bột - iode với nitrite (phản ứng tạo màu xanh lam). Nếu vi khuẩn có khả năng khử nitrate tới nitơ phân tử thì sẽ làm đục môi trường và có bọt khí trong ống Durham. Phân bố môi trường MT5 vào các ống nghiệm có chứa các ống Durham, hấp khử trùng 1atm/15 phút. Cấy vi khuẩn nghiên cứu vào môi trường. Nuôi cấy 4 ngày. Quan sát khả năng khử nitrate thành nitrite. Nếu phản ứng với tinh bột - iode, tiếp tục theo dõi đến 8 ngày xem vi khuẩn có khử nitrite đến nitrogen phân tử. 46 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn 2.2.4.1. Chuẩn bị y Khử trùng và ủ hạt lúa Chọn hạt lúa đều nhau, chắc, không vết mốc. Ngâm hạt trong nước máy 24giờ. Rửa bằng nước máy nhiều lần. Rửa bằng xà phòng loãng. Rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Lau hạt bằng bông gòn thấm nước. Rửa lại bằng nước máy. Sau đó thực hiện trong điều kiện vô trùng : rửa sạch bằng nước cất vô trùng 2 lần. Khử mẫu bằng alcool 70o, lắc 3 - 5phút, loại bỏ cồn. Khử mẫu tiếp bằng Javel pha loãng với nước cất vô trùng theo tỷ lệ (1 : 1), thêm 2 - 3 giọt Tween 80, lắc liên tục trong 30phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến khi sạch mẫu. Cho hạt vào phòng ẩm (đĩa petri chứa giấy thấm vô trùng được tẩm ướt bằng nước cất vô trùng). Ủ ở 30oC đến khi hạt nảy mầm khoảng 1cm (khoảng 3 ngày). y Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn Cấy dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa 24giờ vào môi trường Dobereiner, ủ 30oC. 48giờ thu dịch sinh khối. Đồng thời xác định mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường Dobereiner thạch đĩa theo công thức : Mi (CFU/ml) = Ai * Di / V Ghi chú : Mi : mật độ tế bào trong 1 ml dịch nuôi cấy Ai : số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di : độ pha loãng V : dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) y Khảo sát thời gian thích hợp nhiễm dịch nuôi cấy vi khuẩn đạt hiệu quả 47 Dùng 10ml dịch nuôi cấy vi khuẩn ủ cho 30 hạt lúa nảy mầm. Đối chứng là hạt được ngâm trong môi trường MT3. Tại các thời điểm 0, 3, 6, 9, 12giờ cấy các hạt lúa được ủ vào môi trường MS và nuôi với điều kiện ánh sáng 2000lux, nhiệt độ 25oC. Sau 7 ngày tiến hành đo chiều cao cây mạ ở các lô thí nghiệm. 2.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng : y Cây mạ trong ống nghiệm Mục đích của thí nghiệm trong ống nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn trên cây mạ. Cấy vi khuẩn vào môi trường MT3, ủ 30oC. Đồng thời khử trùng và ủ hạt lúa. Sau 2 ngày, khi có rễ và thân mầm, vi khuẩn được 48giờ, tiến hành đếm số lượng tế bào trước khi cho hạt mầm nhiễm dịch vi khuẩn. Sau khi ngâm được 3giờ (thời gian thích hợp để nhiễm dịch vi khuẩn đạt hiệu quả), cấy hạt mầm vào ống nghiệm chứa môi trường MS. Kích thước ống nghiệm : φ25 Lượng môi trư