Luận văn Một số đặc tính của các chủng Acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM - 1 kháng carbapenem

quan cảm ứng (Quorum Sensing): Sau cùng, khả năng cảm nhận các tín hiệu của vi khuẩn kế bên (giao tiếp của vi khuẩn), các tín hiệu này có thể kích hoạt các gen kháng kháng sinh của các vi khuẩn. Đây là một trong những cơ chế đề kháng được phổ biến rộng rãi ở các vi khuẩn Gram âm, được tìm thấy trên A. baumannii, có 4 yếu tố cảm ứng tín hiệu mức độ phân tử có khả năng kích hoạt các hoạt tính sinh học N-acylhomoserine-lacton. Quorum cảm ứng đóng vai trò điều hòa việc tạo biofilm, giúp A. baumannii tồn tại trong nhiều loại môi trường khác nhau, thu nhận và tích lũy yếu tố kháng thuốc, có thể nói đây là một cơ quan có vai trò như một trung tâm tự động cảm ứng của nhiều yếu tố độc lực được tìm thấy trong A. baumannii [59]. Cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii Cũng như các vi khuẩn gây bệnh khác, A. baumannii có khả năng kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, trong đó nó có thể đề kháng với chính kháng sinh dùng để điều trị đặc hiệu cho vi khuẩn này. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này cũng khác nhau theo loài, địa phương. A. baumannii với đặc tính là loài có khả năng tích lũy nhiều gen kháng kháng sinh dẫn đến sự phát triển của các chủng đa kháng. Có bốn cơ chế thường gặp gây hiện tượng đa kháng thuốc ở A. baumannii được nói đến nhiều nhất là: (i) Thay đổi vị trí đích tác động (thay đổi đích PBP) (ii) Đột biến mất kênh porin không cho kháng sinh qua màng vào bên trong vi khuẩn, (iii) Bất hoạt kháng sinh qua các bơm đẩy kháng sinh ra ngoài và (iv) tiết enzyme để phá hủy kháng sinh [42, 66, 67]. Ngày nay, với những tiến bộ trong nghiên cứu vi sinh học, người ta đã phát hiện, sự kháng thuốc của A. baumannii trên lâm sàng thông qua việc vi khuẩn này sản xuất ra enzyme ß-lactamase có khả năng kháng với các nhóm kháng sinh họ ß-lactam, kiểu kháng thuốc này được mã hóa trên các plasmid và nhiễm sắc thể [56]. Chính điều này, đã giúp A. baumannii có thể di truyền yếu tố kháng thuốc trong cùng và khác loài như sau: Vi khuẩn có thể cùng một lúc kháng lại nhiều loại kháng sinh, do vi khuẩn mang nhiều gen kháng thuốc nằm trên plasmid và từ một chủng A. baumannii mang gen kháng thuốc này có thể truyền cho một chủng A. baumannii (cùng loài) hoặc một vi khuẩn khác (khác loài) khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh của nó [42]. Đặc điểm gen kháng kháng sinh nhóm carbapenem của A. baumannii Tính kháng kháng sinh nhóm carbapenem của A. baumannii là do vi khuẩn này có chứa gen mã hóa tính năng của enzyme β-lactamase có khả năng ly giải các kháng sinh nhóm carbapenem như IMP, VIM, SIM và NDM-1 thuộc lớp B (Metallo-beta-lactamase). Mặc dù vậy, sự kháng kháng sinh của A. baumannii chủ yếu vẫn do các gen có chứa gen mã hóa enzyme thuộc lớp D (viết tắt là CHLDs carbapenem-hydrolyzing class D beta-lactamases) của vi khuẩn có khả năng thủy phân và ly giải các kháng sinh nhóm β-lactam, điển hình là nhóm carbapenem. Báo cáo đầu tiên men β-lactamase thuộc lớp D kháng với kháng sinh nhóm carbapenem mắc phải của A. baumannii có khởi nguồn từ Scottland và được đặt tên OXA-23. Và tiếp sau đó là những gen kháng nhóm β-lactam thuộc lớp D khác được phát hiện như OXA-23, OXA-24/40 OXA-58, OXA-143 và OXA-51 [31, 57]. Nghiên cứu của Wisplinghoff và Seifert năm 2008, cho thấy, gen OXA-51, OXA-23 và OXA-58 được phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó gen OXA-51, là gen kháng thuốc nội tại tự nhiên và gắn liền với chủng A. baumannii. Gen OXA-23 là một gen kháng KS mạnh, không những có khả năng kháng với nhóm carbapenem mà còn có có khả năng kháng với nhiều loại kháng sinh đặc trị cho A. baumannii, gen OXA-23 được mã hóa không chỉ trên nhiễm sắc thể mà còn trên cả plasmid, do vậy A. baumannii có khả năng lan truyền và phát tán gen kháng thuốc trong cùng hoặc khác loài, gen OXA-23 đã từ lâu được phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới. Nhưng gần đây, gen này đã trở thành một gen được tìm thấy ở nhiều quốc gia châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan, Đài Loan. Một gen khác cũng có những đặc tính kháng kháng sinh như OXA-23 là gen OXA-58, gen này lại thường tìm thấy ở các nước châu Âu, tại Mỹ, Kuwait, Afganistant và đây cũng là một gen kháng thuốc được mã hóa trên cả nhiễm sắc thể (chromosome) và plasmid. Do vậy, cùng với gen OXA-23, nó làm gia tăng khả năng phát tán gen kháng kháng sinh gấp nhiều lần. Mặc dù gen OXA-58 thường được tìm thấy ở các nước châu Âu, châu Mỹ, nhưng gần đây một vài quốc gia châu Á, cũng đã có báo cáo về sự xuất hiện gen OXA-58 này như Hàn Quốc, Trung Quốc và Thái Lan [31, 47, 56]. Sự đề kháng với nhóm carbapenem ở A. baumannii kết hợp với nhóm gen OXA lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 tại Cộng Hòa Czech. Tại đây đã các nhà khoa học đã phát hiện gen OXA-58 và OXA-24 từ những bệnh nhân được nhập viện và điều trị tại khoa Hồi sức tích cực của bệnh viện [20, 109]. Sau đó vài năm, vào năm 2011, cũng tại nơi đây, các nhà khoa học cũng đã phát hiện ra chủng A. baumannii mang gen kháng thuốc NDM và OXA-23, trên những bệnh nhân sau kỳ nghỉ hè trở về từ Ai Cập, và những chủng này có kiểu gen tương đồng với các chủng A. baumannii phân lập được từ châu Âu (Clone 1) [47, 56]. Ngày nay, nhiều nhà nghiên cứu đã phát hiện 4 nhóm gen chứa gen OXA, trong đó có 3 nhóm gen, thường phân lập được là từ những nhiễm khuẩn mắc phải trong bệnh viện như OXA-23, OXA-24, OXA-58, được mã hóa trên nhiễm sắc thể và plasmid, riêng OXA-51 là gen kháng thuốc tự nhiên được mã hóa trên nhiễm sắc thể) và còn có đến 15 loại gen OXA kháng kháng sinh khác nhau trong các nhóm OXA có tính chất tương tự cũng đã được tìm thấy. Sự phân bố các gen OXA kháng kháng sinh có khác nhau giữa các vùng, khu vực và quốc gia. Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã công bố về sự phân bố của các gen kháng kháng sinh được tìm thấy như gen OXA-23 dường như được tìm thấy rộng rãi ở các nước châu Á như Singapore, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan và Hàn Quốc. Trong khi OXA-58 tìm thấy chủ yếu ở châu Âu và ở Brazil, Mỹ, Libia, Pakinstan [56]. Tuy nhiên, gần đây tại các quốc gia châu Á, nhiều nghiên cứu đã công bố sự có mặt của các gen kháng kháng sinh này xuất hiện ở nhiều quốc gia khác nhau trên trong khu vực châu Á, làm dấy lên nỗi lo lắng cho các nhà lâm sàng trong điều trị, cũng như khó khăn cho truy tìm nguồn lây, đường lây của tác nhân gây bệnh này [56]. Hình 1.6. Sự phân bố và cách thức di truyền của các kiểu gen OXA trong A. baumannii [55] Tình hình A. baumannii kháng carbapenem trên Thế giới Hiện nay, vi khuẩn A. baumannii được biết đến như là một tác nhân quan trọng hàng đầu gây nhiễm khuẩn trong bệnh viện ở trên toàn thế giới. Đặc biệt trong 15 năm trở lại đây có nhiều phát hiện quan trọng về khả năng thích ứng của loại vi khuẩn này nhằm kháng lại các kháng sinh đã được báo cáo, điều này cho thấy loại vi khuẩn này đang đe dọa đến thời đại kháng sinh hiện nay của chúng ta. Hiện nay một số chủng A. baumannii kháng lại tất cả các kháng sinh hiện có cũng đã được báo cáo, do vậy cần phải giám sát chặt chẽ thậm chí phải đưa ra ngay các hành động cụ thể nhằm ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn này trên hệ thống y tế toàn thế giới [56]. Ngay từ những năm đầu của thập kỷ 1980, đã có rất nhiều vụ dịch do A. baumannii xảy ra tại các bệnh viện của châu Âu tập trung chủ yếu ở Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha và Hà Lan. Các điều tra về dịch tễ học cho thấy có 2 chủng A. baumannii kháng đa kháng sinh là EU-1 và EU-2 gây ra các vụ dịch này, đường lây truyền có thể là do việc vận chuyển bệnh nhân giữa các bệnh viện và lây lan ra các khu vực khác của châu Âu do việc giao thông đi lại quốc tế. Ví dụ như chủng A. baumannii kháng đa kháng sinh lây lan từ nam Âu tới các nước ở phía bắc châu Âu như Bỉ và Đức [13, 28, 69]. Sau đó nhiều tác giả cũng phát hiện được sự lây lan của các chủng EU-1 và EU-2 ở nhiều khu vực khác nhau ở trên thế giới, điển hình là báo cáo của tác giả Mugnier và cộng sự phát hiện được 8 chủng EU-1 týp ST25 và ST44; 10 chủng 10 EU-II týp ST92 và ST118 mang gen blaOXA-23 kháng carbapenem ở 15 quốc gia [47]. Sự lây lan nhanh chóng của các chủng A. baumannii ST92 cũng được báo cáo ở Trung Quốc và nam Triều Tiên [29, 53]. Theo báo cáo của Nemec và cộng sự, 20/23 chủng A. baumannii kháng carbapenem ≥8 mg/L phân lập tại tại cộng hòa Czech mang gen blaOXA-58-like, blaOXA-24-like hoặc blaOXA-51-like thuộc týpEU-II [48]. Sự lây lan các chủng EU-II mang gen blaOXA-58 cũng được ghi nhận ở các đơn vị điều trị tích cực tại Rome của Ý [21]. Tuy nhiên nghiên cứu của Kulah và cộng sự lại công bố kết quả hoàn toàn khác, nhiều loại chủng thuộc A. baumannii mang gen blaOXA-58 phân lập được tại các vụ dịch ở các bệnh viện của Thổ Nhĩ Kỳ không có liên quan tới các chủng A. baumannii EU-I và EU-II đang gia tăng hiện nay [38]. Vấn đề đang được quan tâm nhất hiện nay trên thế giới là sự lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn mang gen New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) sinh men kháng lại carbapenem, lần đầu tiên được ghi nhận trên chủng K. pneumoniae phân lập được trên bệnh nhân Người Thụy Điển có tiền sử du lịch tại Ấn Độ [79]. Cho đến thời điểm hiện tại đã có rất nhiều báo cáo ghi nhận nhiều loại vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh men New Delhi metallo-β-lactamase bao gồm cả Acinetobacter spp. ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói rằng rất ít các cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các chính trị gia và công chúng như là NDM-1. Là do khả năng đề kháng với tất cả các loại kháng sinh hiện có trừ colistin và khả năng lan truyền không chỉ giới hạn trong một loài mà còn lan truyền một cách nhanh chóng của các gen mã hóa NDM-1 thông qua các plasmid sang các loại vi khuẩn Gram âm khác sống bình thường trong đường tiêu hóa của con người. Sự xuất hiện của các vi khuẩn mang gen siêu kháng thuốc này báo hiệu sự mở đầu của một giai mới về tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh trên thế giới [39, 79]. Acinetobacter là một trong số vi khuẩn Gram âm được báo cáo có mang gen NDM-1, ví dụ, tại châu Âu, từ năm 2008 đến 31 tháng 3 năm 2011, tại hai quốc gia châu Âu đã ghi nhận được 16 chủng Acinetobacter mang gen NDM-1 sinh men New Delhi metallo-β-lactamase, 10 chủng tại Anh và 6 chủng ở Đức. Trong số 10 ca tại Anh thì 1 ca phát hiện năm 2008, 5 ca năm 2009 và 4 ca phát hiện năm 2010 và tất cả các ca bệnh nhiễm khuẩn với Acinetobater mang gen NDM-1 này đều không có tiền sử đi du lịch. Trong tổng số 6 ca mắc tại Đức thì có 5 ca được phát hiện vào tháng 10 năm 2010. Sau đó nhiều quốc gia trên thế giới cũng báo cáo sự xuất hiện của các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 như Trung Quốc và Bỉ. Cho đến thời điểm hiện tại thì chưa có một nghiên cứu nào nhằm đánh giá các tai biến hay nguy cơ tử vong trên các bệnh nhân bị nhiễm trùng do các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh mang gen NDM-1 kháng carbapenem và so sánh với các chủng không mang gen này. Tuy nhiên dựa vào quan sát các nghiên cứu khác về các týp vi khuẩn sinh men phân hủy carbapenem khác cho thấy các bệnh nhân bị mắc các chủng NDM-1 có nguy cơ tai biến và tử vong cao hơn với các bệnh nhân bị mắc các chủng vi khuẩn sinh men phân hủy carbapenem khác. Tình hình A. baumannii kháng carbapenem tại Việt Nam Ở Việt Nam, dưới tác động của công cuộc cải cách kinh tế vào đầu thập kỷ 1990 dẫn đến việc bùng nổ các nhà thuốc tư nhân, kháng sinh có thể mua dễ dàng không cần đơn thuốc hay chỉ dẫn của bác sỹ, điều này sẽ dẫn đến việc sử dụng kháng sinh không đúng cách tại Việt Nam, đây là những yếu tố nguy cơ quan trọng tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh trong cộng đồng. Ở trong bệnh viện các vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh ở mức độ cao. Theo tổng kết về thực trạng kháng kháng sinh của hiệp hội kháng kháng sinh toán cầu (GARP) tại Việt Nam từ các nghiên cứu khác nhau tại các bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh cho thấy từ năm 2000-2001 có 25% các vi khuẩn Gram âm phân lập được kháng lại cephalosporin, tuy nhiên cho đến năm 2009 thì 42% số chủng vi khuẩn Gram âm kháng lại cefftazidime, gentamicin 63% và nalidixic acid 74% [1]. Nghiên cứu gần đây nhất do nhóm nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trong 2 năm từ 2010-2011 nhằm phát hiện tỷ lệ kháng carbapenem của các vi khuẩn Gram âm gây nhiễm khuẩn tại 3 bệnh viện của Hà Nội. Kết quả ban đầu cho thấy A. baumannii chiếm một tỷ lệ nhiễm khuẩn cao nhất 53,33% (320/600) trong tổng số chủng vi khuẩn Gram âm thu thập được và hơn 95% đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và với ít nhất 1 kháng sinh thuộc nhóm carbapenem. Đặc biệt chúng tôi phát hiện được 5% (16/320) số chủng A. baumannii mang gen NDM-1 tại cả 3 bệnh viện. Do vậy để phòng chống sự lây lan của các chủng A. baumannii kháng kháng sinh, đặc biệt là các chủng mang gen NDM-1 cần phải phát hiện ra các nguy cơ tiềm ẩn, nguồn gốc truyền nhiễm. Việc phân loại ra các chủng gây dịch và các chủng không gây dịch và so sánh chúng với nhau là việc làm hết sức cần thiết. Hiện nay các phương pháp phân loại kiều hình truyền thống (mô tả kiểu hình) dựa trên các đặc tính sinh hóa, huyết thanh học, định dạng phage đang được thay thế bằng các các phương pháp phân loại phân tử như định loại các plasmid, ribotyping; điện di xung trường (PFGE); hay phân tích đa hình ngẫu nhiên chiều dài đoạn cắt (AFLP), là kỹ thuật có mức độ định dạng cao về kiểu gen của các vi khuẩn... Gần đây kỹ thuật Multilocus sequence typing (MLST) được đánh giá là một kỹ thuật có mức độ phân loại tốt nhất về kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn như Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae và S. aureus [25, 27]. Kỹ thuật MLST cũng đã được Bartual và cộng sự phát triển để phân loại các chủng A. baumannii dựa vào các trình tự gen có độ dài từ 305 đến 513bp tại các vùng bảo tồn (conserved regions) của 7 loại gen: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD [11]. Hiện nay các số liệu về MLST được đánh giá là dùng để phân loại kiểu gen tốt hơn khi so sánh với kết quả phân tích của kỹ thuật PFGE và AFLP [11].Hiện nay kỹ thuật MLST là một trong rất ít các kỹ thuật được gọi là thư viện để xắp xếp, phân loại và được sử dụng trong các nghiên cứu về dịch tễ học của các chủng A. baumannii. Kỹ thuật này rất phù hợp cho các nghiên cứu dịch tễ học toàn cầu và chúng cũng cho phép chúng ta nhận biết được các chủng gây dịch, kháng kháng sinh, hay các chủng A. baumannii sinh độc tố và cho phép chúng ta giám sát sự lan truyền của chúng trong phạm vi một quốc gia và trên toàn thế giới. Tuy nhiên hiện nay kỹ thuật MLST vẫn chưa được áp dụng tại Việt Nam. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các chủng A. baumannii phân lập được từ 3 bệnh viện ở Hà Nội bao gồm: bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Thanh Nhàn và bệnh viện Xanh Pôn giai đoạn 2010-2014. Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm và vật tư tiêu hao Trang thiết bị, sinh phẩm và dụng cụ tiêu hao đầy đủ và đạt tiêu chuẩn sử dụng trong nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu hồi cứu – mô tả cắt ngang Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu được tiến hành từ: năm 2014 đến 2015 Địa điểm nghiên cứu: Tại phòng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Cỡ mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu nghiên cứu: Cỡ mẫu toàn bộ bao gồm 582 chủng A. baumannii thu thập được từ 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn từ năm 2010 đến năm 2014. Các chủng A. baumannii được phân lập từ các bệnh phẩm nhiễm khuẩn như: máu, đờm khí quản, nước tiểu, dịch vết mổ Các phương pháp nghiên cứu Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch Được thực hiện tại khoa vi sinh của 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn. Dựa trên nguyên lý là kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào đĩa thạch Mueller-hinton đã được láng đều các chủng vi khuẩn cần thử nghiệm. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh sẽ được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Đường kính các vòng vô khuẩn thu được sẽ được ghi lại và tính toán dựa theo tiêu chuẩn CLSI, năm 2010. Các loại khoanh giấy kháng sinh sử dụng bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm [20]. Sau khi thực hiện thử nghiệm, các chủng vi khuẩn kháng với carbapenem sẽ được ghi lại, lập danh sách cụ thể và gửi về phòng thí nghiệm Kháng sinh- Khoa Vi khuẩn-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để tiếp tục thực hiện các thử nghiệm tiếp theo phục vụ cho nghiên cứu. Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) Kỹ thuật MIC được thực hiện tại phòng thí nghiệm Kháng sinh- Khoa Vi khuẩn-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller-hinton có nồng độ kháng sinh khác nhau theo tiêu chuẩn của CLSI và được ủ ở 37oC qua đêm (khoảng 18 giờ). Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc £ 3. Các kháng sinh được thử nghiệm bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm [20]. Các kỹ thuật sinh học phân tử Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn mang gen NDM-1 Tế bào vi khuẩn ly giải toàn phần trong nước cất vô trùng bằng phương pháp tách nhiệt ở 95oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ cặn và giữ lại nước nổi có chứa DNA để sử dụng làm khuôn mẫu cho kỹ thuật PCR phát hiện các gen NDM-1.Các đoạn mồi sử dụng cho kỹ thuật được trình bày tại Bảng 2.1. Bảng 2.1: Trình tự mồi để phát hiện gen NDM-1 của vi khuẩn [79] TT Tên Trình tự mồi Kích thước (bp) Ndm1-F 5’-atgcacccggtcgcgaagctgag-3’ 499 Ndm1-R 5’-ttcgacccagccattggcggcga-3’ Quy trình tách chiết DNA của vi khuẩn: Vi khuẩn được xác định là chủng thuần và được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng. Lấy 3-5 khuẩn lạc vi khuẩn, hòa đều vào 200µl nước cất vô trùng đựng trong tube ly tâm vô trùng. Đun cách thủy ở 95oC/ 5 phút sau đó ly tâm 13.000 vòng/ 10 phút và loại bỏ cặn, thu nước nổi làm khuân mẫu DNA cho phản ứng PCR. Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên thạch điện di agarose nồng độ 1,5% trong đệm TAE 1X trong 30 phút. Sau khi điện di xong gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromine nồng độ 10mg/ml trong 10 phút, rửa trong nước cất 15 phút. Gel được mang đi quan sát và chụp lại bằng máy chụp ảnh gel. Phân tích kết quả: Sau khi thu được ảnh chụp, các chủng vi khuẩn xuất hiện band sẽ được so sánh với kích thước band của chứng dương để kết luận chúng có dương tính với gen NDM-1 hay không. Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử bằng kỹ thuật multilocus sequence typing (MLST) Phương pháp của Bartual và cộng sự sẽ được áp dụng để tiến hành kỹ thuật MLST. Trong kỹ thuật MLST, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sau đó tiến hành giải trình tự. Số lượng Allele sẽ phân loại các ST (sequence type) sau khi số liệu này được gửi vào dedicated data- base ( Các dữ liệu về Allele của 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sẽ được phân tích trên cơ sở dữ liệu về MLST của Acinetobacter baumannii Bảng 2.2. Các trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật MLST đối với chủng A. baumannii [11] TT Tên Trình tự mồi Kích thước (bp) Tài liệu tham khảo 1 gltA -F AAT TTA CAG TGG CAC ATT AGG TCC C 772 A. baumannii MLST website gltA -R GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA CAC G 2 gyrB -F TGA AGG CGG CTT ATC TGA GT 594 gyrB -R GCT GGG TCT TTT TCC TGA CA 3 gdhB -F GCT ACT TTT ATG CAA CAG AGC C 774 gdhB -R GTT GAG TTG GCG TAT GTT GTG C 4 recA -F CCT GAA TCT TCY GGT AAA AC 425 recA -R GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC 5 cpn60-F GGT GCT CAA CTT GTT CGT GA 640 cpn60-R CAC CGA AAC CAG GAG CTT TA 6 gpi-F GAA ATT TCC GGA GCT CAC AA 456 gpi-R TCA GGA GCA ATA CCC CAC TC 7 rpoD -F ACC CGT GAA GGT GAA ATC AG 672 rpoD -R TTC AGC TGG AGC TTT AGC AAT Sau khi chạy PCR với 7 cặp mồi cho kỹ thuật MLST, sản phẩm PCR sẽ được mang đi tinh sạch bằng bộ kit DNA Gel purification (QIAGEN).Thực hiện phản ứng Bigdye – PCR - Tinh sạch sản phẩm DNA: Cho 45 µl Sam solution và 10 µl X-termination/ mẫu bệnh phẩm. Lắc 2000 vòng/30 phút, ly tâm 3000 vòng trong 2-3 phút lấy nước nổi cho vào máy giải trình tự gen. - Đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied Biosystem, Mỹ). - Phân tích trình tự gen: So sánh các đoạn gen với các trình tự chuẩn của ngân hàng gen trên website của đơn vị nghiên cứu Oxford Phân tích mối liên hệ kiểu gen các chủng A. baumannii bằng kỹ thuật PFGE [39] Tách DNA vi khuẩn trong đệm thạch: Lấy một khuẩn lạc của các chủng A. baumannii và chủng vi khuẩn Braenderup H9812 (chủng chuẩn) trên đĩa thạch Mueller-hinton được nuôi cấy qua đêm ở 37oC cấy vào ống canh thang LB, ủ ở 37oC qua đêm Hút canh khuẩn vào tube ly tâm 1.5ml, ly tâm 8000vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ nước nổi, rửa cặn bằng TE 1X sau đó ly tâm 8000vòng/phút trong 5 phút. Giữ lại cặn và hoàn nguyên vào 500 µl CSB, bổ sung protein K (20mg/ml) và đảo nhẹ bằng pipet. Bổ sung SGA-SDS 1% vào hỗn dịch vi khuẩn, trộn đều, sau đó nhỏ hỗn dịch vào khuôn tạo plug, để ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút cho đông. ly giải tế bào vi khuẩn bằng dung dịch CLB (1mg/ml protein K, 1% N-lauroylsarcosin trong 0.5M EDTA pH 8.0), bổ sung 30µl proiein K (20mg/ml) lắc nhẹ trong bể ủ nhiệt ở 55o C qua đêm. Rửa plug sau khi ly giải: Loại bỏ nước ly giải tế bào, rửa plug bằng nước khử ion vô trùng 2 lần mỗi lẫn 15 phút ở 55oC. Thực hiện bước rửa tương tự bằng TE 1 X sau đó giữ plug trong TE 1X ở 4oC tới khi sử dụng. Cắt DNA vi khuẩn bằng enzyme cắt giới hạn: Cắt chromosomal DNA của vi khuẩn đã tách chiết trong thạch bằng Enzym giới hạn XbaI (đối với chủng chuẩn Braenderup H9812 ) và ApaI (cho A. baumannii) nồng độ 30UI/ miếng thạch ở 370C trong vòng 12-16 giờ. Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1%, ở hiệu điện thế 6V/cm trong 19 giờ ở nhiệt độ 140C, thời gian một xung từ 25 đến 60s và góc điện trường là 120 độ. Phát hiện plasmid mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật Southern-Blotting [39] Tạo mẫu dò cho gen NDM-1: Khuếch đại đoạn gen NDM-1 bằng phản ứng PCR. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng tinh sach DNA (high pure product purification kik – Roche) Biến tính 100 ng DNA ở 100oC trong 5 phút sau đó làm lạnh tức thì bằng cách vùi vào đá dắm trong 10 phút. Tạo mẫu dò bằng bộ kít ECLTM Amersham Sản phẩm NDM-1 sau khi đánh dấu nếu không sử dụng ngay có thể được giữ ở trong 30% glycerol ở -15 đến -300C trong 6 tháng. Tách chiết DNA vi khuẩn trong đệm thạch (giống với phương pháp PFGE ở phần 2.6.2.3) Thực hiện kỹ thuật S1-PFGE: Cắt loại bỏ DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn bằng enzym S1 nồng độ 20UI/200µl dung dịch đệm enzym S1, Ủ 370C trong 1 giờ. Chủng S. braenderup H9812 sử dụng làm thang DNA chuẩn được cắt bằng enzym XbaI, 30UI/phản ứng ở 370C trong 3 giờ. Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1% để tách plasmid. Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và chụp ảnh để xác định số lượng và kích thước plasmid của các chủng vi khuẩn. Chuyển DNA plasmid sang màng lai Hybond-N, Amersham: Rửa gel bằng dung dịch HCL 0,25M lạnh trong 7 phút, dung dịch biến tính (NaCl 1,5M; NaOH 0,5M) lạnh trong 20 phút và dung dịch trung hòa (Tris-HCl 0,5M; NaCl 1,5M; pH 7.5) lạnh trong 20 phút. Chuyển các plasmid sang màng lai Hybond-N của hãng Amersham bằng dung dịch chuyển màng SSC 20X (3 M NaCl, 300 mM Natri Citrate, pH 7.0) bằng hệ thống chuyển màng Biometra-analytic (của hãng Jena, Cộng hòa Pháp). Thực hiện phản ứng lai: Màng lai đặt ủ trong dung dịch tiền lai (gold hydridization buffer của hãng ECLTM Amersham) ở 42oC trong 1 giờ. Loại bỏ dung dịch tiền lai đưa vào dung dịch lai đã được bổ sung 30 µl mẫu dò NDM-1. Lai qua đêm ở 42oC (khoảng 16 giờ) bằng lò lai UPV HL-2000 HybriLinker (Đức). Dừng phản ứng lại và rửa màng lai bằng dung dịch SSC 0,5X chứa 0,4% SDS và dung dịch SSC 2X ở 55oC. Hiện màng (sử dụng bộ Kit ECl, Hãng ECLTM Amersham): Hiện màng trên hyper film bằng hỗn hợp detection 1 và detection 2 ECLTM Amersham. Phân tích kết quả: Sử dụng ảnh chụp gen các plasmid trước khi và ảnh plasmid sau khi lai để phát hiện số lượng và kích thước các plasmid mang gen. Quản lý và phân tích số liệu Số liệu thu thập được từ phiếu điều tra và bệnh án sẽ được nhập 2 lần độc lập vào máy tính và kiểm tra đối chiếu để tránh sai sót trong quá trình nhập số liệu. Số liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm excel. Kết quả được trình bày dưới dạng bảng, đồ thị, biểu đồ Phần mềm Bioedit và website của đơn vị nghiên cứu Oxford được sử dụng để đọc và phân tích kết quả MLST. Phân tích mối liên hệ kiểu gen của các chủng A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 bằng phần mềm Bionumeric- 6.5 để tạo cây phả hệ. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN