Luận văn Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho hoạt động của Enzyme Glucoamylase trong quy trình sản xuất rượu nếp

tăng đến nhiệt độ nhất định. Vượt qua nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng bị giảm và enzyme có thể bị vô hoạt. Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme. Mỗi loại enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc nguồn gốc của chúng. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính của enzyme bị giảm, khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của có các chất, kim loại, pH và chất bảo vệ. Ta K1 K3 K2 13 thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng theo yêu cầu của chế biến. 2.2.5.4 Ảnh hưởng của pH Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH môi trường. Do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp enzyme – cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Mỗi loại enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ một ít enzyme có pH tối thích nằm trong vùng acid hay kiềm mạnh. 2.2.5.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa Chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành trạng thái hoạt động, từ hoạt động yếu thành hoạt động mạnh. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học khác nhau, chúng có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển hóa nhóm, chuyển gốc hóa học. - Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm chất hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme. - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động. - Ngoài ra một số kim loại có bán kính 0,34 ÷ 1,65 A0 (Na+, K+, Ca2+, Mg2+) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa các ion có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa các enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme. - Các chất hoạt hóa này chỉ có tác dụng tốt ở một nồng độ nhất định, vượt qua nồng độ này chúng sẽ ức chế hoạt động của enzyme. 2.2.5.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch. Trong chất kìm hãm thuận nghịch, ta có thể phân biệt hai dạng kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh. 14 Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối, trong trường hợp này chất kìm hãm có cấu tạo tương tự cơ chất thật, nó kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme làm giảm hiệu lực xúc tác của enzyme. Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm tốc độ phản ứng. Kiềm hãm bởi sản phẩm phản ứng: các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thành chất kìm hãm tốc độ thể tạo của chính phản ứng đó. Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu S1 + S2 P1 + P2 Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2. Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + S ES E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này coi như chất kìm hãm. ES + S ESS Tất cả các enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại như: Cu2+, Ag+. 2.2.5.7 Ảnh hưởng của cơ chất Cơ chất của enzyme amylase là tinh bột. Tinh bột là nhóm carbohydrate thực vật có chủ yếu trong các loại ngũ cốc như gạo, nếp, ngô, trong các loại củ như khoai lang, khoai mì, sắn,…Công thức tổng quát của tinh bột là (C6H12O6)n. Tinh bột được cấu tạo từ hai phân tử amylose và amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng. Các loại tinh bột đều có chứa từ 20 ÷ 30% amylose và 70 ÷ 80% amylosepectin. Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000 ÷ 160.000, được cấu tạo từ 200 ÷ 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylosepectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷ 6000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside tạo nhánh. 15 Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng sẽ bị hồ hóa khi đun nóng lên 60 ÷ 850C. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết glycoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra ở hai mức độ: dịch hóa và đường hóa. Kết quả của quá trình dịch hóa là tạo thành các sản phẩm trung gian dextrin, sau đó dextrin tiếp tục bị phân cắt tạo thành sản phẩm cuối là maltose và glucose. Tốc độ thủy phân của tinh bột phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme thủy phân, thành phần amylose và amylosepectin trong tinh bột và mức độ hồ hóa của hồ tinh bột. Chính vì vậy để quá trình thủy phân đạt hiệu quả ta cần chọn loại enzyme amylase và nhiệt độ hồ hóa phù hợp với loại nguyên liệu tinh bột. 2.3 Nấm men 2.3.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men Nấm men có cấu tạo đơn bào. Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như hình hình cầu, hình elip, hình trứng,…Kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 8 ÷ 15µm. Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men Thành phần Hàm lượng (%) Carbon 49,8 CaO 12,4 Nitro 6,7 Hydro 3,54 P2O5 2,34 K2O 0,04 SO3 0,42 MgO 0,38 Fe2O3 0,035 SiO 0,09 (Nguyễn Đức Lượng, 1996) 16 2.3.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Tế bào nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy chồi, tế bào mẹ nảy sinh ra một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra, quá trình này xảy ra sau 2 giờ. Giai đoạn a (giai đoạn tiền phát) : giai đoạn này tế bào nấm men làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng. Giai đoạn b (giai đoạn phát triển logarit): đây là giai đoạn phát triển rất nhanh của tế bào nấm men, tốc độ sinh khối của tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân. Trong giai đoạn này có sự thay đổi mạnh mẽ thành phần của dịch lên men. Giai đoạn c (giai đoạn ổn định): số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết. Giai đoạn d (giai đoạn chết): số lượng tế bào nấm men giảm dần do tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản chậm lại. Hình 2.7 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men 2.3.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang Trong sản xuất cồn, rượu vang và bia người ta thường sử dụng chủng nấm men Saccharomyces, chủng này được phân chia thành các dạng: Đặc điểm của lên men nổi là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt một lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì cho đến khi lên men gần kết thúc. Theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết nhau thành chuỗi. Đối với lên men nổi thì nhiệt độ lên men thích hợp ở 20 ÷ 280C. Nấm men chìm chỉ phát triển ở lơ lửng và ở đáy môi trường lên men, chúng không tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp men xít, bám chắc ở đáy thùng. Nhiệt độ thích hợp cho nấm men loại này là 5 ÷ 100C. Đặc điểm nổi bật của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α- galactosidase lên men hoàn toàn đường rafinose. Còn nấm men nổi thì chỉ có một số ít chủng có khả năng chuyển hóa được 1/3 đường rifanose thành rượu và CO2. a b c d 17 Ngoài tính chất chung là nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành rượu và CO2 thì trong mỗi ngành sản xuất đều có những đòi hỏi đặc thù. Ví dụ: nấm men dùng trong sản xuất bia và rượu vang phải cho sản phẩm mùi đặc trưng thơm ngon; đồng thời phải lắng tốt và giúp cho dịch lên men nhanh chóng. Các nòi nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu vang thường có khoảng nhiệt độ thích hợp 18 ÷ 250C. Ở 350C, sinh sản của chúng bị ức chế, ở 400C sinh sản bị ngừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 160C sinh sản và lên men bị kéo dài. Các điều kiện lý hóa, thành phần và chất liệu dịch quả cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấm men. Ngày nay trong công nghệ sản xuất rượu vang, người ta còn sử dụng các chủng nấm men như: Saccharomyces ellipsodues, Saccharomyces oriformis (Osterwalder) (Lê Minh Châu, 2007). Các chủng nấm men này có tốc độ lên men mạnh mẽ, tạo ra các sản phẩm chứa 18 ÷ 20% ethanol. Đặc trưng của nấm men vang là có hình elip hoặc elip kéo dài. Trong điều kiện thuận lợi, nấm men sinh sản bằng cách nảy chồi; trong điều kiện không thuận lợi chúng sinh sản bằng cách tạo bào tử (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Saccharomyces vini: đây là tên dùng phổ biến hiện nay, trước đây người ta gọi là Saccharomyces vini Meyer hay là Saccharomyces ellipsoideus, theo Lodder là Saccharomyces cerevisiae Hansen. Trong quá trình lên men nước quả, nấm men này sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon là đường, cồn và acid hữu cơ; có tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, mezoinzit, tiamin và piridoxin; ngoài ra chúng còn có các đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp cho rượu vang có mùi đặc trưng riêng biệt. Nhiều nòi của nấm men này trong lên men tạo được một lượng rượu chỉ đạt 8 ÷ 10% so với thể tích. Ở giai đoạn cuối của quá trình lên men Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong rượu. Sau đó chúng thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh. Saccharomyces oviformic: Nấm men này được tách từ nước nho tự lên men, có khả năng chịu được lượng đường và cồn cao, lên men kiệt đường và tạo ra lượng cồn tới 18 độ cồn. Giống này lên men được glucose, fructose, manose, saccarose, maltose và 1/3 rafinose và không lên men được lactose, pectose (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Loại nấm men thường được sử dụng trong sản xuất rượu vang nếp là Saccharomyces cerevisiae. Loại nấm men này có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như glucose, fructose, saccharose, maltose, galactose từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau như gạo, nếp, ngô, khoai, sắn. Nấm men này có thể lên men tốt với lượng đường trong dung dịch từ 12 ÷ 14% có khi từ 16 ÷ 18%, nồng độ rượu trong dịch lên men từ 10 ÷ 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷ 320C. 18 Yêu cầu đối với nấm men rượu vang:
Khả năng lên men cao
Chịu được nhiệt độ thấp
Bền với etanol và nồng độ đường cao. 2.4 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp 2.4.1 Quá trình hồ hóa tinh bột nếp Hồ hóa tinh bột nhằm mục đích giúp quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra dễ dàng hơn. Đầu tiên hạt tinh bột sẽ hút nước và trương lên, tăng khối lượng và thể tích. Khi nấu tinh bột với nước đến nhiệt độ 400C tinh bột bắt đầu trương nở. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên thì hạt tinh bột sẽ tiếp tục trương nở đến khi tạo thành một thể đồng nhất gọi là sự trương nở vô hạn. Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của hạt tinh bột tăng 50 ÷ 100 lần. Lực liên kết giữa các phân tử yếu dần đến mức độ tinh bột tan ra gọi là sự hồ hoá tinh bột . Ở trạng thái này chỉ mới một phần nhỏ tinh bột bị phá vỡ. Điều này chứng tỏ rằng sự cấu tạo bền vững của tinh bột là do sự kết hợp giữa các phân tử lớn của các chuỗi tinh bột giữa các mạch chính và nhánh thành những mạng, giữa các mạng là amylose và amylosepectin . Các mạch thẳng trong hạt tinh bột liên kết với nhau bằng lực hút tĩnh điện và liên kết hydro. Ngoài các liên kết trên trong tinh bột còn có các liên kết khác chắn chắn hơn (do sự xoắn mạch của các mạch amylose làm cho chúng siết chặt lấy nhau), chính hiện tượng này làm cho quá trình hồ hoá muốn phá vỡ chúng cần phải tiêu tốn một nhiệt lượng cần thiết. Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu hạt, người ta thường bổ sung một lượng nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan và đạt được nồng độ chất khô theo yêu cầu. Khi làm nguội, dung dịch amylosepectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 550C chúng biến thành keo làm cho enzyme amylase không thể tác dụng. Đối với dung dịch amylose thì rất không bền vững, nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được. Do đó làm giảm khả năng đường hoá. Vì vậy, trong sản xuất rượu người ta thường làm nguội nhanh đến nhiệt độ 60 ÷ 620C và đường hoá. Một biện pháp kĩ thuật thường dùng là sử dụng enzyme amylase dịch hoá trước hay sau khi nấu nguyên liệu. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) 19 2.4.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu nếp Nguyên liệu tinh bột của nếp không thể trực tiếp lên men được, mà cần phải qua giai đoạn đường hoá. Tác nhân xúc tác thường dùng là enzyme amylase. Enzyme này sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường để nấm men sử dụng trong quá trình lên men. Quá trình đường hóa chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Nhiệt độ Tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme amylase chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ. Tốc độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ tối thích của enzyme. Nếu vượt quá nhịêt độ này thì chúng sẽ bị biến tính và sẽ trở nên trơ hơn đối với cơ chất. Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa mà còn ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần của sản phẩm đường hóa. Khi đường hóa ở nhiệt độ cao, dexrtin tạo ra nhiều hơn so với đường khử. Mặt khác, trong nấm men không có hoặc rất ít α-amylase và glucoamylase nên không thể thủy phân tiếp tục dextrin thành đường nên giảm hiệu suất thu hồi. pH Bản chất của enzyem là protein do vậy tính chất của nó cũng giống như protein. Những nhóm hoá học cơ bản của enzyem có khả năng ion hoá. Sự hiện diện của ion H+ làm giảm khả năng ion hoá của các nhóm này. Nếu nhóm này là trung tâm hoạt động của enzyem thì sẽ kiềm hãm hay kích thích enzyem tuỳ theo nồng độ. pH tối thích của enzyem amylase trong khoảng 4,5 ÷ 5,5. Thời gian đường hóa Thời gian đường hoá có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, phụ thuộc vào khả năng làm nguội dịch nấu và phương pháp đường hoá. Thời gian đường hoá quyết định năng suất của thiết bị, chất lượng của dịch đường hoá và hiệu suất thu hồi. Thời gian đường hoá có ảnh hưởng đến sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Khi đường hoá khối nấu ở nhiệt độ 55 ÷ 580C trong thời gian 15 ÷ 150 phút hầu như đường lên men không tăng, nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Nồng độ enzyme Trong điều kiện không thay đổi về chủng loại enzyme, nồng độ cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme tăng thì tốc độ đường hóa tăng. Trong sản xuất tốc độ của sự phân hủy là một hàm số, là sự tác dụng tổng hợp của phức hệ enzyme. Phức hệ enzyme, nếu có sự khác nhau về loại, lượng, hoạt tính khác nhau thì kết quả của sự thủy phân tinh bột cũng khác nhau. Chất sát khuẩn: 20 Để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn trong quá trình đường hoá, các nhà máy sản xuất rượu thường sử dụng Na2SiF6, formol. Nồng độ chất sát trùng cao không gây ức chế có khi lại kích thích sự hoạt động của enzyem. 2.4.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp Lên men rượu là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men). Tùy theo sản phẩm sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic… Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện của O2 như quá trình lên men acid accetic, citric… Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men. Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic và CO2. Người ta còn gọi quá trình này là quá trình rượu hóa. Cơ chế của quá trình lên men Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được lớn hơn 100 triệu tế bào trong 1ml dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường khử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men và sau đó khuyếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2. Rượu etylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào trong môi trường. CO2 cũng hòa tan vào môi trường nhưng sự hòa tan không lớn, ở áp suất 800mmHg nhiệt độ 25 ÷ 30 0C là 0,856 ÷ 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuyếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị phá vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men luôn ở trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men 21 và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo các thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng quá trình lên men. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004). Các giai đoạn của quá trình lên men Giai đoạn đầu: khoảng 60 giờ kể khi cho nấm men tiếp xúc với dịch men. Sự lên men xảy ra rất chậm. Giai đoạn 2: đây là thời kỳ lên men chính, chiếm khoảng 60 ÷ 120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại. Giai đoạn 3: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau. Giai đoạn lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men. Giai đoạn này, trong điều kiện lên men bình thường, sau mỗi giờ nồng độ đường trong dung dịch lên men sẽ giảm đi, mức độ giảm tùy theo sản phẩm, dây chuyền sản xuất. Trong giai đoạn lên men, sự đường hoá cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hoà tan. Do đó tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự thuỷ phân hàm lượng dextrin không lên men còn lại. Tuy vậy, chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy, chu kì lên men cuối phụ thuộc vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme . Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng, càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004). Vì vậy, tuỳ theo sản phẩm của sự lên men, nồng độ đường của dịch đường hoá, phương pháp lên men, nhà sản xuất sẽ tạo ra một quy trình sản xuất riêng biệt với chất lượng và thành phần mong muốn của họ (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống của tế bào nấm men, do đó cũng ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men và chất lượng rượu thành phẩm. Nấm men 22 phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 ÷ 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu là 50C. Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 ÷ 220C có năng lực lên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 ÷ 450C. Nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết. (Nguyễn Thanh Vũ, 2007) Ảnh hưởng của pH pH ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Mỗi loại nấm men phát triển tốt ở một pH nhất định gọi là pH tối thích. Nấm men trong sản xuất rượu vang có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH từ 2 ÷ 8 nhưng thích hợp nhất là 4 ÷ 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH khoảng 3,8 ÷ 4,0. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Nồng độ đường Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 ÷ 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 ÷ 35%, nồng độ đường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men. Ảnh hưởng của nồng độ rượu Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy. 2.5 Quy trình sản xuất 2.5.1 Sơ đồ quy trình 23 2.5.2 Thuyết minh quy trình 2.5.2.1 Nghiền Việc nghiền nhỏ nguyên liệu là khâu rất quan trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình hồ hóa tinh bột và quá trình thủy phân của enzyme. Nghiền nhằm tạo điều kiện để tăng tốc độ quá trình lý học và hóa sinh học trong khi hòa thấm hạt vào nước. Đồng thời nghiền nhỏ còn có tác dụng làm tăng cường tiếp xúc giữa nước và hạt giúp các chất hòa tan dễ dàng vào nước khi nấu. Việc nghiền nhỏ nguyên liệu được thực hiện bằng máy nghiền búa. 2.5.2.2 Nấu Mục đích: quá trình nấu nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không hòa tan thành trạng thái hòa tan trong nước, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme amylase dễ dàng thủy phân tinh bột. Tiến hành: cho khoảng 10% enzyme vào nếp đã được pha loãng sẵn sau đó nâng nhiệt độ lên 70 ÷ 720C và giữ ở nhiệt độ đó 15 phút để enzyme thực hiện quá trình dịch hóa. Tiếp tục đun dịch cháo đến nhiệt độ sôi và giữ ở đó khoảng 10 phút để quá trình hồ hóa xảy ra hoàn toàn. Làm nguội dịch cháo đến khoảng 65 ÷ 750C và cho toàn bộ lượng enzyme còn lại vào, giữ nhiệt độ này trong khoảng 30 phút đến khi quá trình đường hóa kết thúc rồi đem đi lọc. Gạo nếp Nghiền Đường hóa Lên men chính Men giống Hãm cồn Lên men phụ Lọc thô Nấu 24 2.5.2.3 Đường hóa Sau khi nấu xong, tinh bột trong dịch cháo đã chuyển sang trạng thái hòa tan nhưng chưa thể lên men trực tiếp để biến thành rượu được mà phải trải qua quá trình thủy phân do xúc tác của hệ amylase để chuyển tinh bột thành đường. Đây là công đoạn có vai trò quan trọng trong bất kỳ dây chuyền sản xuất rượu từ nguyên liệu có chứa tinh bột. (Nguyễn Đình Thưởng và ctv, 2007) 2.5.2.4 Lên men Quá trình lên men được tiến hành ở nhiệt độ phòng. Trong thời gian lên men có hai quá trình xảy ra song song ở mức độ khác nhau đó là quá trình phát triển của nấm men và quá trình rượu hóa. 2.5.2.5 Hãm cồn Sau khi lên men nồng độ cồn trong dịch lên men khoảng 7 ÷ 10%. Với hàm lượng cồn này rượu rất khó bảo quản và chất lượng không cao. Vì vậy, ta cần bổ sung thêm một lượng cồn để tăng hàm lượng cồn trong sản phẩm và tăng khả năng bảo quản cũng như tăng chất lượng sản phẩm. Tùy theo yêu cầu của từng loại sản phẩm mà lượng cồn thêm vào khác nhau. 2.5.2.6 Lên men phụ Rượu nếp được lên men và không qua chưng cất nên sau khi lên men xong sẽ còn nhiều sản phẩm phụ có thể ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm và gây độc cho người tiêu dùng. Vì vậy, cần có thời gian lên men phụ để chuyển hóa và ổn định rượu làm cho chất lượng rượu tốt hơn. Thời gian lên men phụ thường là 6 tháng. 25 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 02/02/2009 đến 03/05/2009. Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp & SHƯD – Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.2 Nguyên liệu Nguyên liệu nếp được mua ở chợ Xuân Khánh, nếp không bị lẫn gạo, có mùi thơm đặc trưng. Các loại enzyme α-amylase, glucoamylase, ở dạng thương mại được mua ở các cửa hàng.